CN111304364A - 检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。含有禽流感病毒RNA片段的待测物通过利用该引物和探针可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术在等温条件下进行大量扩增，反应条件低，特异性好、灵敏度高，便于临床使用。

Description

检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的禽类普遍易感的病毒性传染病，一直以来对我国的禽类养殖业造成巨大的经济损失。AIV为单股负链RNA病毒，有8个独立的RNA节段，亚型众多，最常见的病毒亚型为H5、H7、H9。AI分布广，世界各地均有分离出该病病原的报道，该病作为人畜共患病，不但给养禽业造成严重的危害，还对人类健康构成潜在威胁。

AI的实验室诊断方法有很多，如通过观察鸡胚出血、发育迟缓等病变进行诊断，或者利用AIV血凝性进行血凝抑制实验，但特异性均不高。PCR体外核酸扩增具有好的特异性，然而传统PCR诊断方法需要高温退火、低温延伸等过程，核酸扩增反应条件高，实时荧光定量PCR还需要昂贵的仪器，使二者在临床推广使用中受到一定的限制。

发明内容

针对现有PCR诊断方法反应条件高的问题，本发明提供了用于检测禽流感病毒的引物和探针组合。

以及，本发明还提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒。

以及，本发明还提供了检测禽流感病毒的方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如SEQ ID NO.1～2所示)为：

上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；

下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；

所述探针的序列(如SEQ ID NO.3所示)为：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。

上述引物是根据禽流感保守基因(NP)序列经过人为设计而得，含有H5、H7、H9任一亚型的AIV均能够利用上述引物通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)在等温条件下进行大量扩增。其探针根据上述下游引物的序列经设计而得，探针上距离5′端30bp位置设有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(THF)残基修饰(SEQ ID NO.3中R即为THF)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，从而可进一步提高该引物和探针组合的特异性，使其能够与其它禽常见呼吸道病毒(如新城疫病毒(DNV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等)核酸没有交叉反应，扩增后能够与其他禽类常见病毒进行区分，且检测限度为10²拷贝/μL，灵敏度是PCR法(10⁴拷贝/μL)灵敏度的100倍。

用上述引物和探针组合进行等温核酸扩增的反应条件低，37℃左右、22min即可完成反应，反应条件低，不需昂贵仪器设备，使用水浴锅或体温加热均可，便于临床使用。

以及，本发明实施例还提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒，包含上述引物和探针组合。使用该试剂盒进行禽流感病毒检测是反应条件低，操作简便，并具有特异性好、灵敏度高的优点。

优选地，所述探针5′端以荧光基团修饰，3′进行磷酸化处理，所述下游引物的5′端以生物素修饰，扩增完成后可通过侧向流试纸条进行现场检测，从而能够简便、快捷地诊断禽流感病毒。

优选地，所述试剂盒还包括基础缓冲液和乙酸镁。二者均可选择用于RT-RAA核酸扩增的市售试剂，如江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂。

优选地，所述试剂盒还包括胶体金侧向流免疫层析试纸条(LFD)。LFD将RT-RAA和LFD进行结合，无需借助含有毒染料的传统琼脂糖电泳即可实现检测结果的可视化，扩增反应产物只需要滴加到试纸条上3min即可观察结果。即使在不具备恒温设备的条件下，该试剂盒借助人体的温度也可实现快速检测。该LFD优选杭州优思达生物科技公司的LFD。当选用该公司的LFD时，探针5′端是荧光基团应选用FAM荧光基团。

以及，本发明实施例还提供了一种检测禽流感病毒的方法，具体操作为：提取待测物的基因组，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物。该方法用上述试剂盒可快速检测出H5、H7、H9亚型的AIV，反应条件低，特异性好，灵敏度高，适合临床兽医和基层实验室应用。

优选地，所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：

反应温度为35～39℃，反应时间22～40min。该反应体系简单、反应条件参数少，易于操作和控制，能够在基层实验室使用，对试验条件要求低。

优选地，所述反应时间为22～26min。

优选地，用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条进行扩增产物检测。将LFD与RT-RAA结合后构成的RT-RAA-LFD检测方法能够方面、快捷地检测出待测物中的AIV。

附图说明

图1为本发明实施例3～10中AIV的LFD试纸条检测结果；

图2为本发明检验例1中特异性实验结果；

图3为本发明检验例2中常规PCR检测AIV敏感性测试结果。

图4为本发明检验例2中RT-RAA-LFD检测AIV敏感性测试结果。

图5为本发明检验例2中RFQ-PCR检测AIV敏感性测试结果，其中0为阴性对照，1-7依次为10⁰拷贝/μL-10⁶拷贝/μL。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例提供了用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，序列分别为：

上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；

下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；

探针：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。

实施例2

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒，具体包括：

(1)等温扩增引物和探针：序列分别为：

上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；

下游引物：5′-Biotin-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；

探针：5′-FAM-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THFCACAAAGGGCAATGA-P-3′。

(2)基础缓冲液、乙酸镁(均为江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂)。

实施例3

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。AIV(H5、H7、H9各亚型)为河北农业大学实验室保存。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：39℃反应30min。

(2)扩增产物检测

取10μL的步骤(1)所得扩增产物滴加到LFD试纸条(购自杭州优思达生物科技公司，设有FAM抗体检测线和Biotin抗体质控线)的检测区，并将试纸条插入加有100μL Tris缓冲液(25mmol/L Tris、150mmol/L NaCl和0.05％T ween-20)的EP管内，3min后观察结果。

试纸条判定标准：出现两条红带为阳性，且两条带一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明样本中含有AIV核酸片段；如果质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明不含或未检出有AIV片段。

实施例4

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的RNA，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：39℃反应30min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例5

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：39℃反应30min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例6

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV标准毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取待测物的基因组，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：39℃反应30min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例7

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：35℃反应24min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例8

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：37℃反应24min。

(3)扩增产物检测同实施例3。

实施例9

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：37℃反应22min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例10

本发明实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。

AIV毒株同实施例3。步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

反应体系同实施例3，反应条件为：37℃反应26min。

(2)扩增产物检测同实施例3。

实施例3～10中AIV的LFD试纸条检测结果如图1所示。

检验例1

本检验例对上述禽流感病毒的检测方法进行了特异性实验。

各待测物分别为：

AIV(H5、H7、H9各亚型)和新城疫病毒(NDV)均为河北农业大学实验室保存，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV AV195)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV AV1511)购买于中国兽医药品监察所。阴性对照(N)用纯水代替模板。

步骤具体如下：

(1)重组酶介导等温核酸扩增反应

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别提取AIV、NDV、IBV的RNA以及ILTV的DNA，将其反转录所得cDNA为模板，按以下反应体系及反应条件进行重组酶介导等温扩增反应：

反应条件为：39℃反应30min。

(2)扩增产物检测

取10μL的步骤(1)所得扩增产物滴加到LFD试纸条(购自杭州优思达生物科技公司，设有FAM抗体检测线和Biotin抗体质控线)的检测区，并将试纸条插入加有100μL Tris缓冲液(25mmol/L Tris、150mmol/L NaCl和0.05％T ween-20)的EP管内，3min后观察结果。

试纸条判定标准：出现两条红带为阳性，且两条带一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明样本中含有AIV核酸片段；如果质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明不含有AIV片段。

结果如图2所示，只有含禽流感病毒RNA片段的待测物呈现阳性结果，其他病毒均呈现阴性结果，可见本发明提供的检测禽流感病毒的方法具有良好的特异性。

检验例2

本检验例对上述禽流感病毒的检测方法进行了敏感性实验。

以AIV基因组反转录所得cDNA为模板，将NP基因PCR扩增(PCR引物序列如SEQ IDNO.4～5所示)，通过琼脂糖电泳胶回收后，连接T-Vector Pmd^TM20质粒(购买于Takara公司)，导入感受态细胞后进行蓝白筛选，提质粒(即标准质粒)并且根据摩尔定律计算单位体积质粒所含DNA拷贝数。

质粒所含DNA拷贝数(拷贝/L)＝[质粒浓度(g.μL^-1)×6.02×10²³]/[总片段长度(bp)×660g/mol]，总片段长＝载体长度(bp)+片段长度(bp)。

将构建的标准质粒用10倍稀释法稀释为10⁰～10⁶拷贝/μL梯度浓度。

1、常规PCR法敏感性检测

以10⁰～10⁸拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)。按以下反应体系进行PCR扩增：

反应程序为：94℃，1min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环；68℃延伸5min；4℃保存。通过2％琼脂糖电泳观察结果。

其中PCR上游引物的序列(如SEQ ID NO.4所示)为5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTC-3′；PCR下游引物的序列(如SEQ ID NO.5所示)为5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTC-3′。

2、实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)敏感性检测

以10⁰～10⁶拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)，进行PCR扩增。

RFQ-PCR为25μL体系为：TB Green Premix DimerEraser(2X)12μL，上、下游引物(10μM)各0.75μL，模板1μL，其余用纯化水补齐。反应程序为：95℃ 30s，95℃ 5s，55℃ 30s，72℃ 30s，40个循环后观察结果。

3、RT-RAA-LFD敏感性检测

以10⁰～10⁶拷贝/μL质粒为模板，设置阴性水对照(N)，反应体系和条件及扩增产物检测方法同实施例3。

结果如图3～5所示，常规RT-PCR检出限为10⁴拷贝/μL(如图3所示)；RT-RAA-LFD检出限为10²拷贝/μL(如图4所示)，RFQ-PCR敏感性为10拷贝/μL(如图5所示)。RT-RAA-LFD方法敏感性是常规PCR的100倍。

检验例3

用实施例3中的检测方法和常规PCR、RFQ-PCR方法分别检测临床诊断中疑似AIV病料58份，以常规PCR为标准，比较三种方法的符合率。结果如表1所示。

表1两种方法临床检测结果(n＝58)

结果表明本研究建立的RT-RAA-LFD方法符合率为94.8％，可用于AIV的临床检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法

<130> 2020.01.16

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

acaatggtga tggaactgat tcggatgata aa 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

tcccaggatt tctgctctct cgcacttgat 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 探针

<400> 3

aacatcctca aagggaaatt ccaaacagca rcacaaaggg caatga 46

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> PCR上游引物

<400> 4

acaatggtga tggaactgat tc

22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR下游引物

<400> 5

tcccaggatt tctgctctct c

21

Claims (9)

1.用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物的序列为：

上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；

下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；

所述探针的序列为：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。

2.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物和探针组合。

3.根据权利要求2所述的检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针5′端以荧光基团修饰，3′进行磷酸化处理，所述下游引物的5′端以生物素修饰。

4.根据权利要求3所述的检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基础缓冲液和乙酸镁。

5.根据权利要求4所述的检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金侧向流免疫层析试纸条。

6.一种检测禽流感病毒的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组，用权利要求5所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物。

7.根据权利要求6所述的检测禽流感病毒的方法，其特征在于，所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：

反应温度为35～39℃，反应时间22～40min。

8.根据权利要求7所述的检测禽流感病毒的方法，其特征在于，所述反应时间为22～26min。

9.根据权利要求7所述的检测禽流感病毒的方法，其特征在于，用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条进行扩增产物检测。

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