CN101899418A - 禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗 - Google Patents

Abstract

一种禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗。本发明属于生物技术领域，涉及分离的禽流感病毒新毒株，本发明公开了三种H9N2禽流感病毒。本发明还公开了三种检测H9N2禽流感病毒的试剂盒，以及三种用于预防的H9N2禽流感病毒的疫苗，以及抗H9N2禽流感病毒的抗体。通过本发明的试剂盒，可以迅速的检测或者排除是否是由本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒所致的禽流感，从而尽快的控制禽流感疫情。同时，接种本发明的疫苗，可以预防本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。并且本发明还可以为禽流感病毒监测系统提供生物信息。

Description

禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及三种H9N2禽流感病毒的新毒株及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗。

背景技术：

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病。禽类感染禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)后，症状可表现为非显性感染、亚临诊感染，或轻度呼吸道疾病、产蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多种形式。根据AIV对易感鸡致病性的差异，可将AIV分为高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽类所导致的禽流感对养禽业具有毁灭性的打击，故被国际兽疫局规定为A类疾病；而一些低致病性AIV，如H9AIV的感染虽然对感染禽的致死率低，但可引起产蛋量的减少和淘汰率的上升，并造成免疫抑制，引起其他疫病的发生或混合感染，对养禽业造成的经济损失也相当可观。因此，AI一直是威胁世界养禽业的主要疾病之一，世界各国都十分重视对AIV的研究工作。已有研究表明来自于禽类的H9N2禽流感病毒能偶尔从禽类传染给哺乳动物，包括人和猪。Ck/Bei-like和G1-like H9N2禽流感病毒在1990底首次从人和猪中分离到。2003年分离到的人H9N2禽流感病毒是一个新的重组体，很可能来源于当地的活禽市场。这种跨种间传播表明目前的H9N2禽流感病毒对人仍有潜在的感染性。AIV存在着广泛的抗原漂移和抗原转变现象，其抗原变异频率很高。因此测定AIV的全基因序列，对于研究禽流感病毒的检测、分布、流行规律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意义。本研究分离鉴定了2002-2008年上海地区活禽市场的H9N2亚型禽流感病毒，经全基因序列测定分为三种基因型，对这三种基因型毒株的8个基因片段进行关键位点的分析以及基因进化关系分析，表明这三种基因型与目前报道的基因型存在差异，为H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三种新的基因型，分别命名为Y1，Y2，Y3。

发明内容：

本发明提供了三种H9N2禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗，所述的这三种H9N2禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗要解决现有技术中无法确认和预防新的禽流感病毒从而导致新的禽流感疫情在禽类或者人类传播的技术问题。

本发明提供了一种分离的禽流感病毒(Y1)，其基因组由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3117。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的分离的禽流感病毒。

本发明还提供了一种用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在109.6-109.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗上述的一种分离的禽流感病毒(Y1)。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒(Y2)，其基因组由SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3118。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P 1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的禽流感病毒。

本发明还提供了上述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗上述的一种分离的禽流感病毒(Y2)。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒(Y3)，其基因组由SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3119。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的禽流感病毒。

本发明还提供了上述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗权利要求1所述的一种分离的禽流感病毒(Y3)。

本发明借助MEGA3.1分析软件，对这三种基因型H9N2禽流感病毒的8个基因片段分别进行了系统发育树的绘制和分析。这三种基因型毒株属于Ck/Bei系，均为四重重组体，并且这三种基因型与目前报道的Ck/Bei系中的基因型不同，因此为RT-PCR检测这三种新基因型8个基因片段提供了模板序列。通过本发明的试剂盒，可以迅速的检测或者排除是否是新的禽流感由本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒所致，从而尽快的控制禽流感疫情。同时，接种本发明的疫苗，可以预防本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。使用本发明的抗体，可以治疗本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。

本发明对分离的三种H9N2禽流感病毒进行了保藏。第一种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(C G M C C)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCC NO：3117。第二种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(C G M C C)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCC NO：3118。第三种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(C GM C C)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCCNO：3119。

本发明还可以对禽流感病毒监测系统提供生物信息。对这三种基因型病毒关键位点的分析能提供这三种基因型是否有向人类感染的威胁以及8个片段重排的规律，尤其是有无H5片段的存在等，提供是否有向高致病性禽流感转变的可能性，并为我国H9N2禽流感病毒种子库提供储备，并为病毒的追踪溯源提供序列信息。

附图说明：

图1是H9N2禽流感病毒中HA基因片段的进化关系图。

图2是H9N2禽流感病毒中NA基因片段的进化关系图。

图3是H9N2禽流感病毒中PB2基因片段的进化关系图。

图4是H9N2禽流感病毒中PB1基因片段的进化关系图。

图5是H9N2禽流感病毒中PA基因片段的进化关系图。

图6是H9N2禽流感病毒中M基因片段的进化关系图。

图7是H9N2禽流感病毒中NP基因片段的进化关系图。

图8是H9N2禽流感病毒中NS基因片段的进化关系图。

具体实施方式：

实施例1 病毒的获得

于2002年至2008年从上海地区的活禽批发市场获得商品代三黄鸡，采集活禽样品包括气管或泄殖腔拭子，将采集样品放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内。将鉴定为阳性样品的棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，样品液经1000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。取处理好的样品以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于35℃～37℃孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，通过下面的实施例对从鸡胚尿囊液中的病毒进行基因测序和鉴定，是三种新的甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，对此进行了保藏，保藏号分别为：CGMCC NO：3117(Ck/SH/Y1/06)、CGMCC NO：3118(Ck/SH/Y1/07)、CGMCC NO：3119(Ck/SH/Y1/08)。

实施例2 三种基因型H9N2禽流感病毒的全基因测序

2.1 于2002年至2008年从上海地区的活禽批发市场获得商品代三黄鸡，共分离、鉴定了三种基因型H9N2禽流感病毒：A/Chicken/Shanghai/Y1/06(简写为Ck/SH/Y1/06，基因型Y1)；A/Chicken/Shanghai/Y1/07(简写为Ck/SH/Y1/07，基因型Y2)；A/Chicken/Shanghai/Y1/08(简写为Ck/SH/Y1/08，基因型Y3)。病毒鉴定用的H9亚型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所。设计用于扩增H9亚型AIV所有8个基因片段的特异引物由宝生物(大连)工程公司合成。

HA基因上游引物P1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’；

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’。

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’；

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’。

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’；

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’。

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’；

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’。

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’；

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’。

PA基因上游引物P 1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’；

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’。

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’；

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’。

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’；

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

2.2 将阳性样本接种SPF鸡胚，取感染鸡胚尿囊液用TRIzol抽提试剂进行RNA的抽提。

2.3 8个基因片段RT-PCR扩增如下：采用20μL的cDNA合成体系置于0.2mL反应管中，取溶于DEPC处理水中的AIV RNA样品9μL，分别加入上游引物3μL，5倍RT-PCR缓冲液4μL，dNTPs(10mmol/L)2.5μL，RNA酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶2μL，用无RNase的超纯水加至总体积为20μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以30℃10min，42℃60min，进入PCR扩增。

PCR反应体系100μL：在PCR反应管中分别加入cDNA10μL，上、下游引物各3μL(20pmol/μL)，10×LA PCR Buffer10μL，dNTPs(2.5mmol/L)10μL，MgCl₂(25mmol/L)8μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL)，灭菌超纯水加至100μL，置于PCR仪中进行PCR扩增。首先95℃预变性2min，然后进行以94℃30s，55℃60s(HA，PB1，M，NP这4个基因的退火温度为55℃，PB2，NS，PA，NA的退火温度为52℃)，72℃180s的PCR循环，进行40个循环后于72℃延伸10min。

2.4 8个基因片段的cDNA克隆、鉴定和测序：RT-PCR产物电泳经凝胶回收后，按pMD18-T载体说明书进行连接、转化，用EcoRI和HindIII进行双酶切鉴定；鉴定为阳性克隆后送英骏生物有限公司测序。

其具体实施步骤如下：

2.4.1 RT-PCR产物电泳

取RT-PCR产物加10×loading buffer，在1％琼脂糖凝胶(含0.1ug/ml的溴化乙锭)中，以TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，1mMEDTA)电泳0.5hr，电泳结束后，在紫外线下观察。

2.4.2 RT-PCR产物回收

1)将目的片段切下；

2)先冻融，再捣碎；

3)加500ul平衡酚混匀，置-20℃，60min；

4)取出后立即离心，5000g×5min；

5)小心地将水相转移至另一EP管中；

6)在原EP管内加200ulTE(PH8.0)，充分混匀。必要时可用玻棒再次捣碎，置-20℃，30min；

7)离心，500g×5min，将水相转移并合并至含有上次水相的EP管中；

8)加等体积酚、氯仿：异戊醇各抽提一次；

9)在转移出的水相中加1/10体积3mol乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇置-20℃30min；

10)离心，12000g×15min。弃上清，70％乙醇洗涤一次，真空干燥；

11)沉淀用7ul TE缓冲液(PH8.0)溶解，-20℃保存备用；

上述操作也可通过相关公司生产的胶回收试剂盒进行回收。

2.4.3 回收的产物与pMD18-T载体的连接

SolutionI：5ul；

pMD18-T Vector：0.5ul；

PCR Product：4.5ul；

4℃连接12h-24h。

2.4.4 感受态细胞的制备

1)划平板，尽量形成单一菌落，使性质均一(一定要熟悉E.coli的颜色、大小、亮度，什么时候最好)，37℃过夜，16h。选择分散、单个菌落，一般8h可见菌落，16h差不多；

2)挑取单个菌落，接种到3-5mlLB培养过夜(37℃振摇，200-300rpm)；

3)取1ml菌液到LB中，37℃，2-4h，200-300rpm振荡培养至OD₅₅₀＝0.3-0.5，此时正好是E.coli对数生长期早期，生命力最好；

4)放入冰水中，停止增殖，保持该状态10-15min；

5)离心，弃上清，留沉淀于冰浴中(4℃，4000g×10min)；

6)0.1MCaCI₂(4℃预冷)，体积多一些没关系，作用20-30min，时间可以长一些；

7)4℃，4000g×10min离心，去CaCI₂；

8)加CaCI₂，量只有上一次的1/5到1/10；

9)分装200ul于EP管中。

置4℃冰箱，12-24h即可用于转化。

2.4.5 细菌的转化

1)无菌操作取一定量的感受态细胞(200ul)置冰浴；

2)加入需1.4.3制备的连接物10ul，轻轻手腕旋转或吹打以充分混匀；

3)取出置42℃热休克90S，不要摇动，立刻冰浴1-2min；

4)每管加预热的LB800ul，37℃振摇45min-1h，以复苏抗性；

5)稍离心一下，弃去部分上清，剩200ul左右全部涂板，带有Amp抗性的平板；待液体被吸收后，置37℃培养12-18hr；

6)观察见有数个单、小菌落，继续培养，挑选单菌落接种到含Amp的LB液体培养基中

2.4.6 重组质粒的提取及酶切鉴定

1)从摇床中取出上述培养物，取1.5ml于EP管中，1，2000rpm，1min；

2)弃上清，加预冷的溶液I100ul，用枪吹起菌体；

3)加新鲜配制溶液II200ul，通过手腕混匀；

4)加预冷溶液III150ul，倒转混匀，12000rpm，5min；

5)上清移于另一EP管中，加等体积酚/氯仿，混匀，12000rpm，5min；

6)上清移于另一EP管中，并加2倍体积冷无水乙醇-20℃沉淀一段时间，12000rpm，5min；

7)弃上清，加1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃去，完全干燥沉淀，并用20ul TE(ph8.0，含20ug/mlRNase)重悬沉淀。用EcoRI和HindIII进行双酶切鉴定。发现阳性克隆的送英骏公司测序(具体见序列表)。

实施例3 HA基因氨基酸序列分析

推导的氨基酸序列分析表明，三种基因型毒株均含有7个潜在的糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为除Pro以外的任意氨基酸)，其中5个位于HA1部分(29aa～31aa、141aa～143aa、218aa～220aa、298aa～300aa、305aa～307aa)，2个位于HA2部分(492aa～494aa、551aa～553aa)。裂解位点序列分析发现，所有毒株均为RSSR↓GLF，对禽类为低致病力。构成受体结合位点的氨基酸(109aa、161aa、163aa、191aa、202aa、203aa)除198位氨基酸变化较大外，其它位点在所有毒株中都是相当保守的。此外本研究表明Ck/SH/Y1/06在HA基因226位点为Gln，证明为人类非易感性的H9亚型AIV，而其余2个毒株在该位点为Leu，表明有向人类感染的嗜性(如表1所示)。

表1 HA基因几个关键位点的比较

Isolates

146aa-150aaRight edgeof RBS

a b c d ef gReceptorbindingsite(RBS)#

232aa-237aaLeft edgeof RBS

1 2 3 4 5 6 7Potentialglycosylationsites*

335aa-341aaProteolyticcleavagesite

Ck/SH/Y1/06(Y1)	GTSKA	YWTNVLY	NGQQGR	NST NVS NRT NTTNVS NGT NGS	RSSR ↓GLF
						Ck/SH/Y1/07(Y2)	GTSKA	YWTNALY	NGLQGR	NST NVS NRT NTTNVS NGT NGS	RSSR ↓GLF
Ck/SH/Y1/08(Y3)	GTSKA	YWTNVLY	NGLQGR	NST NVS NRT NTTNVS NGT NGS	RSSR ↓GLF

Note：#Receptor-binding sites(受体结合位点)，their locations are(它们的具体位置)：a(109aa)，b(161aa)，c(163aa)，d(191aa)，e(198aa)，f(202aa)，g(203aa)；*Potential glycoylation sites(潜在糖基化位点)，their locationsare(它们的具体位置)：1(29aa-31aa)，2(141aa-143aa)，3(218aa-220aa)，4(298aa-300aa)，5(305aa-307aa)，6(492aa-494aa)，7(551aa-553aa)；Ck：chicken(鸡)；SH：Shanghai(上海)。

实施例4 绘制系统发育树

借助MEGA3.1分析软件，对三种基因型毒株的8个基因片段分别进行了系统发育树的绘制和分析(如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7和图8所示)。分析结果表明这三种基因型毒株属于Ck/Bei系，均为四重重组体，这三种基因型不同于以往报道的Ck/Bei系中的H9N2禽流感病毒基因型，本研究中这三种基因型组成情况见表2，目前已报道的Ck/Bei系中的基因型组成情况见表3，本研究中这三种基因型其内源性基因中含有H5N1的片段(表2中的Gs/GD系为H5N1病毒)。

表2.2002-2008年上海地区鸡群中三种新基因型H9N2禽流感病毒的基因组成情况

Abbreviations(缩写)：Ck/Bei，Ck/Beijing/1/94-like(Ck/Beijing/1/94系)；Dk，duck(duck系)；G1，Qa/HK/G1/97-like(Qa/HK/G1/97系)；Gs/GD，Gs/GD-like(Gs/GD系)；Ck：chicken(chicken系)；SH：Shanghai.

表3.中国H9N2禽流感病毒Ck/Bei系的不同基因型的基因组成情况

Abbreviations(缩写)：？，unknown avian host or lineage；Aq，aquatic bird；Ck，chicken；Ck/Bei，Ck/Beijing/1/94-like；Dk，duck；G1，Qa/HK/G1/97-like；Gs/GD，Gs/GD-like；H5N1/01，H5N1/01-like；MP，minor poultry species，鹌鹑除外；Qa，quail.

实施例5 三种基因型H9N2禽流感病毒8个基因片段RT-PCR诊断试剂盒

试剂盒的组成包括：病毒RNA抽提液、RT反转录反应液和PCR反应液。

其中，病毒RNA的抽提采用TRIzol法，由于TRIzol法抽提病毒RNA为本领域的常规技术，在这里不再赘述。

RT反转录反应液组成如下：随机引物，5倍RT-PCR缓冲液，dNTPs(10mmol/L)，RNA酶抑制剂，AMV反转录酶，无RNase的超纯水。

PCR反应液组成如下：上、下游引物(20pmol/μL)，10×LA PCR Buffer，dNTPs(2.5mmol/L)，MgCl₂(25mmol/L)，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)。

这三种基因型H9N2禽流感病毒8个基因片段的上、下游引物情况如下表：

5.1 RT-PCR诊断试剂盒使用说明

取11μL的RT反转录反应液和9μL的病毒RNA置于0.2mL反应管中，以30℃10min，42℃60min，置于PCR仪中进行cDNA合成；取5μL的上述cDNA产物和45μL的PCR反应液置于0.2mL反应管中，首先95℃预变性2min，然后进行以94℃30s，55℃60s(HA，PB1，M，NP这4个基因的退火温度为55℃，PB2，NS，PA，NA的退火温度为52℃)，72℃180s的PCR循环，进行40个循环后于72℃延伸10min。RT-PCR产物经琼脂糖电泳后判定结果，8个片段长度见上表。

实施例6 三种基因型H9N2禽流感病毒的灭活疫苗

6.1 疫苗抗原液制备及毒价测定

将这三种基因型H9N2禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种9日龄非免疫鸡胚，37℃培养72h(弃去24h内死亡鸡胚)，4℃冷藏24h后，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512。病毒液置-18℃冰箱中保存备用。

6.2 抗原液灭活

将福尔马林溶液加入病毒液中，福尔马林溶液终浓度为0.2％，置37℃温箱内摇动作用1.6小时后，经接种9日龄SPF鸡胚检验合格后作为制备抗原液。

6.3 油相佐剂制备

以注射用专用白油(杭州炼油厂)、司本-80(上海大众药业)和硬脂酸铝(上海远航试剂厂)，按一定比例(94％轻质白油，6％司本-80，再加2％硬脂酸铝)配制混合，经高温灭菌后备用。

6.4 疫苗水相制备

将一定量的吐温-80(上海大众药业)经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度为3％，经充分溶解混合即为水相。

6.5 疫苗配制

将一定比例的油相与水相(比例为1∶1)在立式胶体磨机中预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂。

6.6 无菌及安全检验

随机抽取4瓶疫苗，分别接种鲜血琼脂培养基，37℃培养48小时，无菌生长。另取免疫剂量的3倍量，颈部皮下注射10日龄非免雏鸡6羽，观察2周，无任何不良反应。

6.7 理化性状检查

疫苗色泽正常，3000rpm离心15分钟不分层，37℃放置21天不破乳。

6.8 免疫效果评估

取SPF4周龄公鸡，在清洁条件下隔离饲养。为预防试验期间被感染并模仿实际生产条件，所以鸡在接种这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗前均用Lasota株NDV弱毒疫苗及鸡传染性法氏囊弱毒疫苗免疫，5d后注射这三种基因型H9N2禽流感油乳灭活苗。在接种这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗后2、3、4、5周后分别采血，测定对H9亚型AIV HI抗体效价。

以0.5ml一次肌肉注射后2、3、4和5周采血，分离血清测定其对H9亚型AIV的滴度。2周后大多数鸡都已表现出不同程度的HI抗体。在3周后，所有免疫鸡都产生抗H9的HI抗体，且较2周时显著上升，这一HI抗体滴度在5周龄时上升至最高值，这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗：Y1平均可达10log2，Y2平均可达8.6log2，Y3平均可达9.6log2。而且个体间差异减少。

据有关资料表明，当HI抗体的平均值达到4log2就有保护力，但有时能分离到病毒。当达到5log2以上时其保护率达100％并且分离不到病毒。以上试验说明这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗免疫效果较好，能抵抗AIV的侵袭，性能稳定。

序列表

<110>上海市动物疫病预防控制中心

<120>禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗

 

<160>24

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>2280

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的PB2基因

<400>1

atggaaagaa taaaagaatt aagagaccta atgtcgcaat cccgcacccg cgagatacta     60

acgagaacca ctgtggatca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aaggcaagag    120

aagaaccctg ctctcagaat gaaatggatg atggctatga aatacccaat cacagcagac    180

aagagaataa tggaggcgat ccccgaaagg aatgagcaag ggcagacgct ttggagcaag    240

acaaatgatg ctggatcaga cagggtgatg gtgtctcccc tcgctgtaac ttggtggaac    300

aggaatgggc ctacaacaag tactgtccat tacccaaagg tttacaaaac atactttgag    360

aaggttgaga ggttaaagca tggaaccttt ggtcccgtcc acttccgaaa tcaaattaaa    420

atacgccgcc gggttgacat aaacccgggt catgcagatc tcagtgctaa agaagcacaa    480

gatgttatca tggaggttgt ttttccaaat gaagtgggag ccagaatatt gacatcagaa    540

tcgcagttga caataacaaa agagaagaaa gaagagctcc aggattgtaa gattgctcct    600

ttaatggtag catacatgtt ggaaagggaa ctagtccgga aaaccagatt cctaccggta    660

gcaggtggaa caagcagcgt ttacattgaa gtattgcatt tgactcaagg gacctgctgg    720

gaacagatgt acacaccagg cggagaagtg agaaatgatg atgttgacca gagtttgatc    780

atcgctgcca gaaatattgt taggagagct acggtgtcgg cagatccatt ggcatcatta    840

ttagaaatgt gccacagcac acaaattggt gggataagga tggtggacat ccttaggcaa    900

aatccaactg aggaacaagc tgtggatata tgcaaagcag caatgggctt gaggatcagt    960

tcatctttta gctttggagg cttcactttc aaaagaacaa gtgggtcgtc tgtcaagaag  1020

gaagaggaag tgctcacagg caatctccaa acactgaaga taagagtaca tgaggggtac  1080

gaggaattca caatggttgg gcagagagca acagctatcc tgaggaaagc aaccagaaga  1140

ctgattcagc tgatagtaag tggaagagat gaacaatcag tcgctgaagc gatcattgta  1200

gcaatggtgt tctcacagga agattgcatg ataaaagcgg tcaggggtga tctgaatttc  1260

gtaaatagag caaaccaaag actaaacccc atgcatcaac tccttaggca ctttcaaaaa  1320

gatgcaaagg tgctatttca aaactgggga attgaaccta ttgacgatgt catggggatg  1380

atcggaatat tacctgacat gactccaagc acagagatgt cactgagagg agtaagagtt  1440

agtaagatgg gagtggatga atattccagc actgagagag tggtagtaag tattgaccgt  1500

ttcttaaggg ttcgagatca gcggggaaac gtactcttat cccccgagga ggtcagcgaa  1560

acacagggga ctgagaagtt gacaataaca tattcatcac caatgatgtg ggaaatcaac  1620

ggtcccgaat cagtgctagt taacacctat cagtggatca ttagaaattg ggagactgtg  1680

aagattcaat ggtctcaaga cccaacaatg ctgtacaata aagtggagtt tgaaccgttc  1740

caatccttgg tgcctaaagc taccagaggt caatatagtg gatttgtgag aacactattc  1800

caacagatgc gtgacgtatt gggaacattt gatactgtac agataataaa gctgctacca  1860

tttgcggccg ccccaccaga gcagagcaga atgcagtttt cttctctaac tgtgaatgta  1920

agaggatcgg gaatgcgaat actcgtaagg ggcaactccc cagtgttcaa ctataataag  1980

gcaaccaaaa ggcttaccat tcttggaaag gatgcaggtt cattagcaga agatccagat  2040

gagggaacag caggagtgga atctgcagta ctgaggggat tcctaattct aggcaaagag  2100

gacaaaaggt atggaccagc attgagcatc aatgaactga gcaatcttgc gaaaggggag  2160

aaagctaatg tgcttatagg gcaaggagac gtagtgttgg tgatgaaacg gaaacgggac  2220

tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagga ttcggatggc catcaattag  2280

 

<210>2

<211>2274

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的PB1基因

<400>2

atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtgccgg tgcaaaatgc tataagtacc   60

acgttccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa caggaacagg atacaccatg     120

gacacagtca acagaacaca tcaatactca gaaaagggaa aatggacaac gaacacagag     180

actggagcac cccaactcaa tccgattgat ggaccattgc ctgaggacaa cgagccgagt     240

gggtatgcac aaacggattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgaaga atctcaccca     300

gggatctttg aaaactcgtg tctcgaaacg atggaaattg ttcagcaaac aagagtggat     360

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ggaaggttga tagatttcct caaggacgta atggaatcga tggataagga agaaatggag     540

attacaacac atttccagag aaagaggaga gtgagggaca acatgaccaa aaaaatggtc     600

acacagagaa caataggaaa gaaaaaacaa agactgaaca aaaggagcta cctaataaga     660

gcactgacat tgaacacaat gacaaaggat gctgaaagag gcaagttgaa aaggagggca     720

atcgcaacac ccgggatgca aatcagagga ttcgtgtatt ttgtagaaac actagcgagg     780

agtatctgtg agaaacttga gcaatctggg ctccctgtcg gagggaatga gaagaaagct     840

aaattggcaa atgttgtgag gaagatgatg actaattcac aagatacaga gctctccttc     900

acaattactg gagacaacac caaatggaat gagaatcaga acccccggat gtttctagca     960

atgataacat acatcacaag aaaccaacca gaatggttta gaaatgtctt aagcattgct    1020

cctataatgt tctcaaataa gatggcgaga ttagggaaag gatacatgtt cgaaagtaag    1080

agcatgaagt tacggacaca aataccagcg gaaatgctcg caaatattga cctgaaatac    1140

ttcaacaaat caacaagaga gaaaatcgag aaaataagac ctctactaat agatggcaca    1200

gcctcattga gtcctggagt gatgatgggc atgttcaaca tgttgagtac agtcttagga    1260

gtctcaatcc ttaatctcgg ccagaagaag tacaccaaaa ccacatattg gtgggacgga    1320

ctccaatcct ctgatgactt cgccctcata gtgaatgcac cgaatcatga gggaatacag    1380

gcaggggtgg ataggttcta tagaacctgc aagttagttg ggatcaacat gagcaagaag    1440

aaatcctaca taaatcggac aggaacattc gaattcacaa gctttttcta ccgctatgga    1500

ttcgtagcca acttcagtat ggagttgccc agttttggag tatctgggat taatgagtca    1560

gctgacatga gcattggtgt tacagtaata aagaacaata tgataaacaa cgaccttgga    1620

ccagcaacag ctcagatggc ccttcagcta tttatcaaag actacagata cacataccga    1680

tgtcacaggg gtgatacgca aattcaaacg aggagagcat tcgagctgaa gaagctgtgg    1740

gagcagaccc gttcgaaggc aggattgttg gtttcagatg gagggccaaa cctgtacaat    1800

atccggaacc tccacattcc agaggtctgc ttgaaatggg aattgatgga tgaagactac    1860

caaggccggc tgtgtaatcc tctgaacccg tttgtcagtc ataaggaaat tgattccgtc  1920

aacaatgctg tggtgatgcc agctcatggc ccagccaaaa gcatggagta tgatgccgtt  1980

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ggaattcttg aggatgaaca gatgtaccag aagtgttgca acctattcga aaagttcttc  2100

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agggcccgaa ttgatgcacg aattgacttc gaatctggaa ggattaagaa agaggagttt  2220

gctgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atag        2274

 

<210>3

<211>2151

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的PA基因

<400>3

atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca     60

atgaaagaat atggggaaga tccgaaaatc gaaacgaaca aattcgcagc aatatgcaca    120

cacttagaag tctgcttcat gtactcggat ttccacttca ttgacgaacg aggcgaatca    180

acaattatag aatctggcga tccaaatgcg ttggtgaaac acctgattga actaattcga    240

agggagagcc cgatcaaatg gcttgacagt ggtgaatagt atcggcaaca ccacgggagt    300

cgagaatccc aaatgtcttc cggatctgta tgactgcaag gaagaccgat tcattgaaat    360

tggagtaacg aggagggaag tccacatatc tcctagagaa agccaataaa ataaaatccg    420

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ttgaagaaag atttgaaatc acaggaacca tgcgcaggct tgccgaccaa agtatcccac    660

cgaacttctc cagccttgaa aactttagag cctatgtgga tggattcgaa ccgaacggct    720

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tagcttaatg tatcttggtt caactccttc ctcacacatg cactgagata g           2151

 

<210>4

<211>1683

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的HA基因

<400>4

atggaaacaa tatcactaat agctatacta ctagtagtga cagtgagcac tgcagacaaa     60

atctgcatcg gataccaatc aacaaactcc acagagactg tagacacgct aacagaaaac    120

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tattggtcga tattgaaacc aggtcaaaca ctgagaataa gatccaatgg gaatctaatt     780

gctccatggt atggacacgt tctttcggga gagagccatg gaagaatact aaagactgat     840

gtaaacagtg gtaactgtgt ggtgcaatgt cagacagaaa aaggtggttt aaatactaca     900

ttgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gcccaaagta tgttggcgta     960

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ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagataggga ttcgactcaa    1140

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tatgaaatta ttgatcatga attcagcgag gttgaaaccc gactcaacat gatcaataat    1260

aagattgatg accaaattca agacatatgg gcatataatg cagaaatgct agtgctgctt    1320

gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcgaatgtga acaatctata taataaagtg    1380

aagagagcat taggttccaa tgcagtggaa gatgggaaag ggtgtttcga gctataccat    1440

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acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg    1620

tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata    1680

taa                                                                  1683

 

<210>5

<211>1497

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的NP基因

<400>5

atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttac gaacacgatg gaaactggtg gagaacgcca     60

gaatgctact gagatcaggg catctgttgg aagaatggtt agtggcattg ggagattcta    120

catacagatg tgtacagaac tcaaactcag tgacaatgaa gggaggctga tccagaacag    180

tataacaata gagagaatgg tactctctgc atttgatgaa agaaggaaca gatacctgga    240

agagcacccc agttcgggaa aggacccgaa gaaaactgga ggtccaattt accggagaag    300

agacgggaaa tgggtgagag agctgatcct gtatgacaaa gaggagatca ggaggatttg    360

gcgtcaagcg aacaatggag aggacgcaac tgctggtctt acccatctga tgatatggca    420

ttccaacctg aatgatgcca cctatcagag aacgagagct ctcgtgcgta ctggaatgga    480

tccccggatg tgctctctga tgcaaggatc aactctcccg aggagatctg gagctgcagg    540

tgcagcagta aaggggatag ggacaatggt gatggaactg attcggatga taaaacgagg    600

gatcaacgac cggaatttct ggagaggcga aaatggaaga agaacaagga ttgcatacga    660

gaggatgtgc aatatcctca aagggaaatt ccaaacagca gcacaaagag caatgatgga    720

tcaagtgcga gagagcagaa atcctgggaa tgctgaaata gaagatctca tttttctggc    780

aaggtctgca ctcatcctga gaggatcagt ggcccataag tcctgcttgc ctgcttgtgt    840

gtacggactt gcagtggcca gtggatatga ctttgagaga gaagggtact ccctggttgg    900

aatagatcct ttccgtctgc ttcaaaacag ccaggtcttt agtctcatta gaccaaatga    960

gaacccagca cataagagtc aattagtgtg gatggcatgc cactctgcag catttgagga   1020

ccttagggtc tcaagtttca tcagagggac aagaatggtc ccaagaggac agctatccac   1080

tagaggggtt caaattgctt caaatgagaa catggaagca atggactcca acactcttga   1140

actgagaagt agatattggg ctataagaac cagaagcgga ggaaacacca accaacagag   1200

ggcatctgca ggacagatca gcgttcaacc cactttctcg gtacagagaa atcttccctt   1260

cgaaagagcg accattatgg cagcatttac aggaaacact gagggtagaa cgtctgacat   1320

gaggactgaa atcataagaa tgatggagag tgccagacca gaagatgtgt cattccaggg   1380

gcggggagtc ttcgagctct cggacgaaaa ggcaacgaac ccgatcgtgc cttcctttga   1440

catgaataat gaaggatctt attcttcgga gacaaagcag gggagtatga caattaa      1497

<210>6

<211>1401

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的NA基因

<400>6

atgaatccaa atcagaagat aataacaatt ggctctgttt ctctaactat tgcggcaata    60

tgcttcctca tgcagattgt catcttagca acgactatga cactaccttt caagcagaat   120

gaatgcagca acccctcgaa taaccaagta gtgccatgtg aaccaatcat aatagaaagg   180

aacatagtgc attggaataa tactaccatc gagaaggaaa tttgtcctaa agtggcagaa   240

tacaagaatt ggtcaaaacc ccaatgtcaa atcacagggt tcgctccttt ctccaaggac   300

aactcaatta ggctttccgc aagtggggat atctgggtga caagagaacc ttatgtgtcg   360

tgtggtcttg gtaaatgtta tcaatttgca cttggacagg gaaccacttt gaaaaacaaa   420

cactcaaatg gtactacgca tgatagaatc cctcatagaa cccttttaat gaatgagttg   480

ggtgtcccgt ttcatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtccag ctcaagctgt   540

catgatggga aagcatggtt acatgtttgt gtcactggtg atgataaaaa tgcgactgct   600

agtatcattt atgacgggat gcttgttgac agtattggtt catggtctaa aaacatcctc   660

agaactcagg agtctgagtg cgtttgcatc aatggaactt gtacagtagt aatgactgat   720

ggaagtgcat caggaaaggc tgacactaga ctattattca taagagaggg aaagattgta   780

cacattagcc cattgtcagg aagtgctcag catgtggagg aatgttcctg ttacccccgg   840

tatccagaag taaggtgtgt ttgtagagac aattggaagg gctccaatag gcccgttcta   900

tatataaatg tggcagatta tagtattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgtcggc   960

gacacaccaa gaaatgatga tagctccagc agcagcaact gcagggatcc taataacgag  1020

agaggggccc caggagtgaa agggtgggcc tttgacactg gaaatgacat ttggatggga  1080

cgaacgatca aagtggattc acgctcaggt tatgagactt ttagagtcgt tggtggttgg  1140

accacggcta atttcaagtc acagataaat agacaagtca tagttgacag tgacaactgg  1200

tcagggtatt ctggtatctt ctctgttgaa ggcaaaaact gcattaacag gtgtttttat  1260

gtggagttga taagaggaag accacaggag actaagatat ggtggacttc aaatagcatc  1320

attgtatttt gtggaacctc aggtacctat ggaacaggct catggcctga tggggcgaat  1380

atcaacttca tgcctatata a                                            1401

<210>7

<211>982

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的M基因

<400>7

atgagccttc taaccgaggt cgaaacgtat gttctctcta tcatcccatc aggccccctc     60

aaagccgaga tagcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac agaccttgag    120

gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcttgtcac ctctgactaa agggatttta    180

gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgatttgtc    240

caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt caaactatac    300

aagaagctga agagggaaat gacgttccat ggagcaaagg aggttgcact cagttactca    360

actggtgcgc ttgccagttg catgggtctc atatacaacc gaatgggaac ggtgaccaca    420

gaagtggctc tgggcctagt atgtgccact tgtgagcaga ttgctgattc acatcatagg    480

tctcacagac aaatggcgac aactaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggta    540

ctagccagca ctacagctaa ggcaatggag caaatggctg gatcgagtga gcaggcagcg    600

gaagccatgg aggttgcaag tcaggctagg cagatggtgc aggcgatgag gactattgga    660

actcaaccta gctccagtgc aggcctgaaa gatgatctta ttgaaaattt gcaggcatac    720

cagaaacgga tgggagtgca gatgcaacga ttcaagtgat cctctcatta ttgcagcaag    780

cgtcattggg atattgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgcat    840

ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgcctgagtc    900

tatgagggaa gaatatcggc aggagcaaca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt    960

tgtcaacata gagctggagt aa                                             982

 

<210>8

<211>838

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y1中的NS基因

<400>8

atgaactcca acactgtgtc aagctttcag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa     60

cggtttgcag accaagaact gggtgatgcc ccatttctag accggcttcg ccgggatcag    120

aagtccctga gaggaagaag cagcactctt ggtctggaca tcagaaccgc cactcgtgaa    180

ggaaagcata tagtggagcg aattttggag gaagagtcag acgaagcatt taaaatgact    240

attgcttcag tgccagctcc acgctatcta actgacatga ctcttgaaga aatgtcaaga    300

gattggttaa tgctcattcc caaacagaaa gtgacagggt ccctttgcat tagaatggac    360

caagcaatag tggacaaaaa catcacattg aaagcaaatt tcagtgtgat tttcaatcga    420

ttggaagccc taatactact tagagctttt acggatgaag gagcaatagt gggcgaaatc    480

tcaccattac cttctcttcc aggacatact gacaaggatg tcaaaaatgc aattggggtc    540

ctcatcggag gatttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga    600

ttcgcttgga gaagcagcga tgaggatggg agacctccac tctctccaaa gtagaaacgg    660

gagatggaga gaacagttaa gccagaaatt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt    720

acgacatagg ttaaagatta cagagaatag ctttgaacaa ataactttta tgcaagcctt    780

acaactattg cttgaagtgg agcaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaa      838

 

<210>9

<211>2280

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的PB2基因

<400>9

atggagagaa taaaagaatt aagagaccta atgtcgcaat cccgcacccg cgagatacta     60

acgagaacca ctgtggatca tatggccata atcaagaagt acacatcagg acggcaagag    120

aaaaaacctg ctctcagaat gaaatggatg atggctatga aatacccaat cacagcagac    180

aaaagaatag tggaggtgat tcccgaaagg aatgagcaag ggcagacgct ttggagcaag    240

acaaatgatg ctggatcaga cagggtgatg gtgtctcccc tcgctgtaac ttggtggaac    300

aggaatgggc ctataacaag tactgttcat tacccaaagg tttacaaaac atactttgag    360

aaagttgaga ggttaaagca tggaaccttt ggtcccgtcc acttccgaaa tcaaattaaa    420

atacgccgcc gggttgacat aaacccgggt catgcagatc taagtgctaa agaagcacaa    480

gatgttatca tggaggttgt ttttccaaat gaagtgggag ccagaatatt gacatcagaa    540

tcgcagttga caataacaaa agagaagaaa gaagagctcc aggattgtaa gattgctcct     600

ttaatggtag catacatgtt ggaaagggaa ctagtccgaa aaaccagatt cctaccggtg     660

gcaggtggaa caagcagcgt ttacattgaa gtattgcatt tgactcaagg gacctgctgg     720

gaacagatgt acactccagg cggagaagtg agaaatgatg atgttgacca gagtttgatc     780

attgctgcca gaaacattgt taggagagct acggtgtcgg cagatccatt ggcatcatta     840

ttagaaatgt gccacagcac acaaattggt gggataagga tggtggacat ccttaggcaa     900

aatccgactg aggaacaagc tgtggatata tgcaaagcag caatgggctt gaggatcaat     960

tcatctttta gctttggagg cttcactttc aaaagaacaa gtgggtcgtc tgtcaagaag    1020

gaagaggaag tgctcacagg caatctccaa acactgaaga taagaataca tgaggggtac    1080

gaggaattca caatggttgg gcggagagca acagctatcc tgaggaaagc aaccagaaga    1140

ctgattcagc tgatagtaag tggaagagat gaacaatcag tcgctgaagc gatcattgta    1200

gcaatggtgt tctcacagga agattgcatg ataaaagcgg tcagaggtga tctgaatttc    1260

gtaaatagag caaatcaaag attaaacccc atgcatcaac tccttaggca cttccaaaaa    1320

gatgcaaaag tgctatttca aaactgggga attgaaccca ttgacgatgt catggggatg    1380

atcggaatat tacctgacat gactccaagc acagagttgt cactgagagg agtaagagtt    1440

agtaagatgg gggtggatga atattccagc accgagagag tggtagtaag tattgaccgt    1500

ttcttaaggg ttcgagatca gcggggaaat gtactcttat cccccgagga ggtcagcgag    1560

acacagggga cagagaaatt gacaataaca tattcatcac caatgatgtg ggaaatcaac    1620

ggtcctgaat cagtgctagt taacacctat cagtggatca ttagaaattg ggagaatgta    1680

aagattcaat ggtctcaaga cccaacaatg ctgtacaata aggtggagtt tgaaccgttc    1740

caatccttgg tgcctaaagc tatcagaggt caatatagtg gatttgtgag aacattattc    1800

caacagatgc gtgacgtatt gggaacattt gatactgtac agataataaa gctgctacca    1860

tttgcggccg ccccaccaga gcagagcaga atgcagtttt cttctctaac tgtgaatgtg    1920

agaggatcgg gaatgcgaat actcgtaagg ggcaactccc cagtgttcaa ctataataag    1980

gcaaccaaaa ggcttaccat tcttggaaag gatgcaggtt cattagcaga agatccagat    2040

gagggaacag caggagtgga atctgcagta ctgaggggat tcctaattct aggcaaagag    2100

gacaaaaggt atggaccggc attgagcatc aatgaactga gcaatcttgc gaaaggggag    2160

aaagctaatg tgcttatagg gcaaggagac atagtgttgg taatgaaacg gaaacgggac    2220

tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattaa    2280

<210>10

<211>2274

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的PB1基因

<400>10

atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtgccag tgcaaaatgc tataagtacc    60

acgttccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa caggaacagg atacaccatg   120

gacacagtca acagaacaca tcaatactca gaaaagggaa agtggacaac gaacacagag   180

actggagcac cccaactcaa tccgattgac ggaccattgc ctgaggacaa cgagccgagt   240

gggtatgcac aaacggactg tgttttggaa gcaatggctt tccttgaaga atctcaccca   300

gggatctttg aaaactcatg tctcgaaacg atggaaattg ttcagcaaac aagagtggat   360

aaactgaccc aaggtcgcca gacctatgac tggactttga atagaaatca accggctgct   420

actgcattgg ccaacactat agaggtattc agatcgaatg gcctgacagc caatgaatca   480

ggaaggttga tagatttcct caaggacgta atggaatcga tggataagga agaaatggag   540

attacaacac atttccagag aaagaggaga gtgagggaca acatgaccaa gaaaatggtc   600

acacagagaa caataggaaa gaaaaaacaa agactgaaca aaaggagcta cctaataaga   660

gcactgacat tgaacacaat gacaaaggat gctgaaagag gcaagttgaa aaggagggca   720

atcgcaacac ccgggatgca aatcagagga ttcgtgtatt ttgtagaaac actagcgagg   780

agcatctgtg agaaacttga gcaatctggg ctccctgtcg gagggaatga gaagaaagct   840

aaattggcaa atgttgtgag gaagatgatg actaattcac aagatacaga gctctccttc   900

acaattactg gagacaacac caaatggaat gagaatcaga acccccggat gtttctagca   960

atgataacat acatcacaag aaaccaacca gaatggttta gaaatgtctt aagcattgct  1020

cctataatgt tctcaaataa gatggcgaga ttagggaaag gatacatgtt cgaaagtaag  1080

agcatgaagt tacggacaca aataccagcg gaaatgctcg caaatattga cctgaaatac  1140

ttcaacaaat caacaagaga gaaaatcgag aaaataagac ctctactaat agatggcaca  1200

gcctcattga gtcctggagt gatgatgggc atgttcaaca tgttgagtac agtcttagga  1260

gtctcaatcc ttaatctcgg ccagaagaag tacaccaaaa ccacatattg gtgggacggg  1320

ctccaatcct ctgatgactt cgccctcata gtgaatgcac cgaatcatga gggaatacag  1380

gcaggagtgg ataggttcta tagaacctgc aaattagttg ggataaacat gagcaagaag  1440

aaatcctaca taaatcggac aggaacattc gaattcacaa gctttttcta ccgatatgga  1500

ttcgtagcca acttcagtat ggagttgccc agttttggag tgtctgggat taatgagtca  1560

gctgacatga gcattggtgt tacagtaata aagaacaata tgataaacaa cgaccttgga  1620

ccagcaacag ctcagatggc ccttcagcta tttatcaaag actacagata cacataccga  1680

tgtcacaggg gtgatacgca aattcaaacg aggagagcat tcgagctgaa gaagctgtgg  1740

gagcagaccc gttcgaaggc aggattgttg gtttcagatg gagggccaaa cctgtacaat  1800

atccggaacc tccacattcc agaggtctgc ttgaaatggg aattgatgga tgaagactac  1860

caaggcaggc tgtgtaatcc tctgaacccg tttgtcagtc ataaggaaat tgattccgtc  1920

aacaatgctg tggtgatgcc agctcacggc ccagccaaaa gcatggagta tgatgccgtt  1980

gcaactacac attcatggat tcctaagagg aatcgctcca ttctcaacac cagccaaagg  2040

gggattcttg aggatgaaca gatgtaccag aagtgttgca acctattcga aaagtttttc  2100

cccagcagtt cataccggag gccagttgga atttccagca tggtggaggc catggtgtct  2160

agggcccgaa ttgatgcacg aattgacttc gaatctggaa ggattaagaa agaagagttt  2220

gctgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atag        2274

 

<210>11

<211>2151

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的PA基因

<400>11

atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca     60

atgaaagagt atggggaaga tccgaaaatc gaaacgaaca aattcgcatc aatatgcaca    120

cacttagaag tctgcttcat gtactctgat ttccacttca ttgacgaacg aggcgaatca    180

actattatag aatctggcga tccaaatgcg ttgttgaaac accgatttga aataatcgaa    240

gggagagacc gaacaatggc ctggacagtg gtgaatagta tctgcaacac cacgggagtc    300

gagaaaccca aatttcttcc ggatctgtat gactacaagg agaaccgatt cattgaaatt    360

ggagtaacga ggagggaagt ccacatatac tacctagaga aagccaataa aataaaatcc    420

gagaagacac acatccacat tttctcattc actggagaag agatggccac caaagcagat    480

tacactcttg acgaagagag cagggcaaga atcaagacca ggctgttcac cataaggcag    540

gaaatggcca gcaggggtct atgggattcc tttcgtcagt ccgaaagagg cgaagaaaca     600

attgaagaaa gatttgaaat cacaggaacc atgcgcaggc ttgccgacca aagtctccca     660

ccgaacttct ccagccttga aaactttaga gcctatgtgg atggattcga accgaacggc     720

tgcattgagg gcaagctttc tcaaatgtca aaagaagtga acgccagaat cgagccattt     780

ctaaggacaa caccacgccc cctcagattg cctaatgggc ctctctgctc tcagcggtcg     840

aaattcttgc tgatggatgc tctgaaatta agcattgagg acccaagcca cgaaggggag     900

ggaataccgc tatatgatgc gatcaaatgc atgaaaacat tcttcggatg gaaagagccc     960

aacattatca aaccacatga gaaaggcata aaccccaatt atctcctgac ttggaagcaa    1020

gtgctagcag aacttcagga cattgaaaat gaagagaaga ttccaaagac aaagaacatg    1080

aagaaaacaa gccaattaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccgga aaaggtggac    1140

tttgaagatt gcaaagatgt caacgacctg agacagtacg acagtgatga gccagagccc    1200

agatcactag catgttggat ccagaatgaa ttcaacaagg catgtgaatt gactgattca    1260

agctggatag aacttgatga aataggggaa gatgttgccc caattgagca cattgcaagc    1320

atgagaagga actattttac agcggaggtg tcccactgca gggctactga atacataatg    1380

aagggagtgt acataaatac agctttgctc aatgcatctt gtgcagccat ggatgacttt    1440

caattgattc caatgataag caaatgcaga accaaagaag gaagacggaa aacaaaccta    1500

tatggattca ttattaaagg aagatctcat ttgaggaatg ataccgacgt ggtaaacttt    1560

gtaagtatgg aattttccct taccgacccg aggttggaac cacataaatg ggaaaagtac    1620

tgtgttcttg aaatagggga catgctcctg cgaactgcag taggccaagt gtcaaggccc    1680

atgttcctgt atgtgagaac caatgggact tccaagatca agatgaaatg gggtatggaa    1740

atgagacgct gccttcttca atctctccaa cagattgaga gcatgattga agctgaatcc    1800

tccgtcaaag agaaagacct gaccaaagaa ttctttgaaa acaaatcaga aacatggcca    1860

attggagagt cacccaaggg agtggaggaa ggctccatcg gaaaggtgtg cagaacctta    1920

ctagcaaaat ctgtattcaa cagtctatat gcatctccac aactcgaggg gttctcagct    1980

gaatcgagaa aactgctact cattgttcag gcgcttaggg ataacctgga acctggaacc    2040

ttcgatcttg gagggctata tgaagcaatc gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt    2100

ttgcttaatg catcttggtt caactccttc ctcacacatg cactgagata g             2151

 

<210>12

<211>1683

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的HA基因

<400>12

atggaaacaa tatcactaat agctatgcta ctagtagtaa cagtaagcga tgcagataat    60

atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact aacagaaaag   120

aatgtccctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacat ggcagtatgg gaagctgtgt   180

gcaaaaagct cgccatttat tcatatgtta catcaccgaa ccaatttggg actaatctat   240

gtctatcctt cttgtgatct tttgtgggga agaataggat gatcctgttt accctatagt   300

ttatctggtg gtaatgttcc cctgaacccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg   360

tcacttttta gttctgctag ttcttatcaa aggatccaga tttttccaga cacaatctgg   420

aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga   480

tggttgaccc aaaagaacaa cgcttaccct attcaagacg cccaatacac aaataatcaa   540

gaaaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatac tgcgcagaca   600

aatctgtaca caagaaccga cacaacaaca agtgtggcaa cagaagaaat aaataggacc   660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaatggtt tgcagggaag aattgactat   720

tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa gatccaatgg gaatctaata   780

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat   840

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaaa aaggtggctt aaacacaaca   900

ttgccattcc aaaacgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata tattggaata   960

aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta  1020

ttcggggcca tagcaggatt catagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat  1080

ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa  1140

aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag  1200

tatgaaatta ttgatcatga attcaacgag gttgaaacta gacttaacat gatcaataat  1260

aagattgatg atcaaatcca agacatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt  1320

gaaaaccaga aaacactcga tgaacatgat gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg  1380

aagagggcat tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac  1440

aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag gaggaagtat  1500

caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga  1560

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg  1620

tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata  1680

taa                                                                1683

 

<210>13

<211>1497

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的NP基因

<400>13

atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttac gaacagatgg aaactggtgg agaacgccag    60

aatgccactg agatcagggc atccgttgga agaatggtta gtggcattgg gagattttac   120

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ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctagaa   240

gagcacccca gtgcgggaaa ggacccgaag aaaactggag gtccaattta ccggagaaga   300

gacgggaaat gggtgagaga gctgatcctg tatgacaaag aggagatcag gaggatttgg   360

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ccccggatgt gctctctgat gcaaggatca ctctcccgag gagatctgga gctgcaggtg   540

cagcagtaaa ggggataggg acaatggtga tggaactgat tcggatgata aacgagggat   600

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gatgtgcaac atcctcaaag ggaaattcca aacagcagca caaagagcaa tgatggatca   720

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tccagcacat aagagtcaat tagtgtggat ggcatgccac tctgcagcat ttgaggacct  1020

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gagaagtaga tattgggcta taagaaccag aagcggagga aacaccaacc aacagagggc  1200

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aagagcgacc attatggcag catttaaagg aaacactgag ggtagaacgt ctgacatgag  1320

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gatatacatg aaggatctta tttcttcgga gacaaagcag gggagtatga caattaa     1497

 

<210>14

<211>1401

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的NA基因

<400>14

atgaatccaa atcagaagat aataacaatt ggctctgttt ctctaaccat tgcgataata    60

tgttttctca tgcagattgc catcttaaca acgaccatga cactacattt caggcagaat   120

gaatgcagca acccatcgaa taatcaagtg gtgccatgtg aacctatcat aatagagagg   180

aacacagtgc atttgaatag tactaccata gagaaggaaa tttgtcctaa agtggcagaa   240

tacaagaatt ggtcaaaacc acaatgtcaa attacagggt tcgctccttt ctcaaaggac   300

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tgcagtcttg gcaaatgtta tcaattttca cttgggcagg gaaccactct gaaaaacaag   420

cactcaaatg gcactacaca tgatagaatt cctcacagaa ctcttttaat gaatgagtta   480

ggtgtcccat ttcatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc   540

catgatggga aagcatggtt acatatttgt gtgactgggg atgataaaaa tgctactgct   600

agtatcattt atgatgggat gctggttgac agtattggtt catggtccaa aaacatccta   660

agaactcagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtgcagtagt aatgactgat   720

ggaagtgcat caggaaaggc tgacactaga atattattca taagagaggg aaaaattata   780

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tatataaata tggcagatta tagtattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgttgga   960

gacacaccaa gagatgatga tagctccagc agcagcaact gcagagaccc taataacgaa  1020

agaggggccc caggagtgaa agggtgggcc tttgacgatg ggaatgacat ttggatggga  1080

cgaacaatca aaagtgattc acgctcaggt tatgagactt ttagggtcgt taatggttgg  1140

accacggcta ataacaagtc acagttaaat aggcaagtca tagttgacag tgacagctgg  1200

tctgggtatt ctggtatctt ctctgttgaa ggcaaaaact gcatcaacag gtgtttttat  1260

gtggagttga taagagggag accgcaggag accagagtgt ggtggacttc aaacagcatc  1320

attgtattct gtggaacctc aggtacatat ggaacaggct catggcctgt tggggcgaat  1380

atcaacttca tgcctatata a                                            1401

 

<210>15

<211>982

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的M基因

<400>15

atgagccttc taaccgaggt cgaaacgtat gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc    60

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gctctcatgg aatggataaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta   180

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aagaagctga agagggaaat gacattccat ggggcaaagg aagttgcact cagctactca   360

actggtgcgc ttgccagctg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccgca   420

gaaggggctc ttggcctagt atgtgccact tgtgagcaga ttgctgacgc ccaacatcgg   480

tcccacaggc agatggcgac tactaccaac ccactaatta ggcatgagaa tagaatggta   540

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gaagccatgg aagttgcaag tcaggctagg caaatggtac aggctatgag gacagtcggg   660

actcacccta gctccagtac aggtctaaaa gatgatctta ttgaaaattt gcaggcttac   720

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tgtcaacata gagctggagt aa                                             982

 

<210>16

<211>838

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y2中的NS基因

<400>16

atgaactcca acactgtgtc aagcttccag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa     60

cggtttgcag accaagaact gggtgatgcc ccatttctag accggcttcg ccgggatcag    120

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caagcaatag tggacaaaaa catcacactg aaagcaaatt tcagtgtgat tttcaatcga    420

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<210>17

<211>2280

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的PB2基因

<400>17

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acaaaaacaa ctgtggacca tatggccata atcaagaaat atacatcggg aaggcaggag     120

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acaaatgatg ctggatcaga cagagtgatg gtgtcacctc tggctgtgac gtggtggaac     300

agaaatggac caacgacaag tacagtccat tatccaaagg tctataaaac ctattttgaa     360

aaggtcgaaa ggctaaaaca tggaaccttc ggccccgttc acttccgaaa ccaggttaaa     420

atacgccgca gggttgacat aaacccaggc catgcagatc ttagtgctaa agaagcacaa     480

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tcacagttaa cgataacaaa ggaaaagaag gaggagcttc aggactgcaa aattgcccct     600

ttaatggtgg catacatgtt ggagagagaa ctggttcgca aaacaagatt cctaccagta     660

gctggaggga caagcagtgt gtatatcgaa gtgttgcatt tgacccaagg gacctgctgg     720

gagcaaatgt acacaccggg aggggaagtg agaaatgatg acgttgatca gagtttaatt     780

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ttggagatgt gccatagtac acagattggc gggataagga tggtggacat ccttagacaa     900

aacccaacag aagaacaggc tgtggatata tgcaaagcag caatgggtct aaggatcagt     960

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gatgcaaagg tgctgtttca aaactgggga attgaaccca ttgacaatgt aatggggatg    1380

atcggaatat tgcctgacat gacccccagc acagagatgt cattgagagg agtgagagtt    1440

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cagcagatgc gtgatgtact ggggacattt gacactgtcc aaataataaa gctattacca  1860

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<210>18

<211>2274

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的PB1基因

<400>18

atggatgtca atccgacttt acttttcttg aagtgccagt gcaaaatgct ataagtacca    60

cgttccctta tactggagac cctccataca gccatggaac aggaacagga tacaccatgg   120

acacagtcaa cagaacacat caatactcag aaaagggaaa gtggacaacg aacacagaga   180

ctggagcacc ccaactcaat ccgattgatg gaccattgcc tgaggacaac gagccgagtg   240

ggtatgcaca aacggactgt gtattggaag caatggcttt ccttgaagaa tctcacccag   300

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aactgaccca aggtcgccag acctatgact ggactttgaa tagaaaccaa ccggctgcta   420

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cacagagaac aataggaaag aaaaaacaaa gactgaacaa aaggagctac ctaataagag   660

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tcgcaacacc cgggatgcaa atcagaggat tcgtgtattt tgtagaaaca ctagcgagga   780

gcatctgtga gaaacttgag caatctgggc tcccagtcgg agggaatgag aagaaagcta   840

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aggagtggat aggttctata gaacctgcaa attagttggg ataaacatga gcaagaagaa  1440

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tgagatcatg aagatctgtt ccaccattga agagctcaga cgcagcaaaa atag        2274

 

<210>19

<211>2151

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的PA基因

<400>19

atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatta tcgagcttgc ggaaaagaca      60

atgaaagaat atggggagga tccgaaaatc gaaacgaaca aatttgcagc tatatgcaca     120

cacttagaag tctgcttcat gtactcggat ttccatttca ttgacgaacg aggcgaatca     180

aaaattgtag aatctggcga tgcaaatgca ttactgaaac accgatttga gatagtcgaa     240

gggagagacc gaacaatggc atggacagtg gtgaatagta tctgcaacac cacgggagtc     300

gagaaaccca aatttcttcc agatctatat gactacaaag agaaccgatt cattgaaatt     360

ggagtgacgc ggagggaagt ccacatctac tacctagaaa aagccaacaa gataaaatca     420

gagaagacac acatccacat tttctcattc actggagaag aaatggccac caaatcagat     480

tacactcttg atgaggagag cagggcaagg atcaaaacca ggctgttcac cataaggcag     540

gagatggcaa gcaggggtct atgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg cgaagagaca     600

attgaagaaa gatttgagct cacaggaacc atgcgcaggc ttgccgacca aagtctccca     660

ccgaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga accgaacggc     720

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ctaaggacaa caccacgtcc cctcagatta cctaatgggc ctccctgctc gcagcggtcg     840

aagttcttgc tgatggatgc tctgaaatta agcattgagg acccgagcca tgaaggggag     900

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agctggatag aacttgatga aataggggaa gatgttgccc caattgagca catttttcag    1320

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caactgattc caatgataag caaatgcaga accaaagaag gaagacggaa aacaaaccta    1500

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<210>20

<211>1683

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的HA基因

<400>20

atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagtaagcaa tgcagataaa    60

atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact aacagaaaac   120

aatgtccctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt   180

gcaacaagct tgggacatcc tcttattcta gacacctgta ccattgaagg actaatctat   240

ggcaatcctt cttgtgatct actgttggga ggaagagaat ggtcatatat cgtcgagaga   300

ccatcagctg ttaacggatt gtgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg   360

tcacttttta gttctgctag ttcttatcaa aggatccaga tttttccaga cacaatctgg   420

aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga   480

tggttgaccc aaaagaacaa cgcttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataatcaa   540

gaaaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatac tgtgcagaca   600

aatctgtaca caagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggacc   660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaatggtt tgcagggaag aattgactat   720

tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa ggtccaatgg gaatctaata   780

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat   840

gtaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaaa aaggtggctt aaacacaaca   900

ttgccattcc aaaacgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata cattggaata   960

aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta  1020

ttcggggcca tagcaggatt catagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat  1080

ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa  1140

aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag  1200

tatgaaatta ttgatcatga attcagcgag gttgaaacta gacttaacat gatcaacaat  1260

aagattgatg atcaaatcca agacatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt  1320

gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg  1380

aagagggcat tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac  1440

aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag gaggaagtat  1500

caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagttgga atctgaagga  1560

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg  1620

tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata  1680

taa                                                                1683

 

<210>21

<211>1498

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的NP基因

<400>21

atggcgtctc aaggcaccaa acgatcctat gaacacgatg gaaactggtg gggaacgcca    60

gagtgctact gagatcaggg catctgttgg aagaatggtt agtggcattg ggagattcta   120

catacagatg tgtacagaac tcaaactcag tgacaatgaa gggaggttga tccagaacag   180

tataacaata gagagaatgg tactctctgc atttgatgaa agaaggaaca gatacctgga   240

agagcatccc agtgcgggga aggacccgaa gaaaactgga ggtccaattt accggagaag   300

agacgggaga tgggtgagag agctgatcct gtatgacaaa gaggagatca ggaggatttg   360

gcgtcaagcg aacaatggag aggacgcaac tgctggtctt acccatctga tgatatggca   420

ttccaatctg aatgatgcca cctatcagag aacgagagct ctcgtgcgta ctggaatgga   480

tccccggatg tgctctctga tgcaaggatc aactctcccg aggagatctg gagctgcagg   540

tgcagcagta aaggggatag ggacaatggt gatggaactg attcggatga taaaacgagg   600

gatcaacgac cggaatttct ggagaggcga aaatggaaga agaacaagga ttgcatacga   660

gaggatgtgc aacatcctca aagggaaatt ccaaacagca gcacaaagag caatgatgga   720

tcaagtgcga gagagcagaa atcctgggaa tgctgaaata gaagatctca tttttctggc   780

aaggtctgca ctcatcctga gaggatcagt ggcccataag tcctgcttgc ctgcttgtgt   840

gtacggactt gcagtggcca gtggatatga ctttgagaga gaagggtact ccctggttgg   900

aatagatcct ttccgtctgc ttcaaaacag ccaggtcttt agtctcatta gaccaaatga   960

gaacccagca cataagagtc aattagtgtg gatggcatgc cactctgcag catttgagga  1020

ccttagggtc tcaagtttca tcaaagggac aagaatggtc ccaagaggac agctatccac  1080

tagaggggtt caaattgctt caaatgagaa catggaagca atagactcca atactcttga  1140

actgagaagt agatattggg ctataagaac cagaagcgga gggaacacca accaacagag  1200

ggcgtctgca ggacagatca gcgttcaacc cactttctcg gtacagagaa atcttccctt  1260

cgaaagagcg accattatgg cagcatttac aggaaatact gagggtagaa cgtctgacat  1320

gaggactgaa atcataagaa tgatggaaag tgccagacca gaagatgtgt cattccaggg  1380

gcggggagtc ttcgagctct cggacgaaaa ggcaacgaaa ccgggggtgc cttcctttga  1440

catgaataat gaagggtctt atttcttcgg agacaaagca ggggagtatg acaattaa    1498

 

<210>22

<211>1401

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的NA基因

<400>22

atgaatccaa atcagaagat aatagcaatt ggctctgttt ctctaaccat tgcgataata   60

tgttttctca tgcagattgc catcttaaca acgaccatga cactacactt caggcagaat  120

gaatgcagca acccatcgaa taatcaagtg gtgccatgtg aacctatcat aatagagagg  180

aacacagtgc atttgaatag tactaccata gagaaggaaa tttgtcctaa agtggcagaa  240

tacaagaatt ggtcaaaacc acaatgccaa attacagggt tcgctccttt ctccaaggac  300

aactcaatta ggctttctgc aggtggagat atctgggtga caagagaacc ttatgtgtcg  360

tgcagtcttg gcaaatgtta tcaatttgca cttgggcagg gaaccactct gaaaaacaag  420

cactcaaatg gcactacaca tgatagaatt cctcacagaa ctcttttaat gaatgagtta  480

ggtgtcccat ttcatttggg aaccaaacaa gtgtgcatag catggtctag ttcaagctgc   540

catgatggga aagcatggtt acatatttgt gtgactgggg atgataaaaa tgctactgct   600

agtatcattt atgatgggat tctggttgac agtattggtt catggtccaa aaacatccta   660

agaactcagg agtcagaatg cgtttgcatc aatggaactt gtgcagtagt aatgactgat   720

ggaagtgcat caggaaaggc tgacactaga atattattca taagagaggg aaaaattata   780

aatattagcc cattgtcagg aagtgctcag cacgtggagg aatgctcctg ttacccccgg   840

tatcctgaag tcaggtgtgt ttgcagagac aattggaagg gctccaatag gcccgttcta   900

tatataaata tggcagatta tagtattgag tccagttatg tgtgctcagg acttgttggc   960

gacacaccaa gagatgatga tagctctagc agcagcaact gcagagaccc taataacgaa  1020

agaggggccc caggagtgaa agggtgggcc tttgacgatg ggaatgacat ttggatggga  1080

cgaacaatca aaagtgattc acgctcaggt tatgagactt ttagggtcgt taatggttgg  1140

accacggcta attccaagtc acagataaat aggcaagtca tagttgacaa tgacagctgg  1200

tcagggtatt ctggtatctt ctcagttgaa ggcaaaaact gcatcaacag gtgtttttat  1260

gtggagttga taagagggag accacaggag accagagtgt ggtggacttc aaacagcatc  1320

attgtattct gtggaacctc aggtacatat ggaacaggct catggcctga tggagcgaat  1380

atcaacttca tgcctatata a                                            1401

 

<210>23

<211>982

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的M基因

<400>23

atgagccttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcattccatc aggccccctc   60

aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtctttgctg ggaagaacac agatcttgag  120

gctctcatgg aatggataaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta  180

gggtttgtgt ttacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acggtttgtc  240

caaaacgccc taaatgggaa cggagaccca aacaacatgg acagggcagt taaattatac  300

aagaagctga agagggaaat gacatttcat ggagcaaagg aagttgcact cagttactca  360

actggtgcgc ttgctagctg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac agtggccgca  420

gaaggggctc ttggcctagt atgtgccact tgtgagcaga ttgctgacgc ccaacatcgg   480

tcccacaggc aaatggcgac tactaccaac ccactaatta ggcatgagaa tagaatggta   540

ctagccagca ctactgctaa ggctatggag cagatggctg gatcaagtga acaggcagca   600

gaagccatgg aagtcgcaag tcaggctagg caaatggtgc aggctatgag aacagtcggg   660

actcacccta gctccagtac aggtctaaaa gatgacctta ttgaaaattt gcaggcttac   720

cagaaacgga tgggagtgca actgcagcga ttcaagtgat cctctcgttg ttgcagcgaa   780

cgttattggg atattgcact tgatattgtg gcttcttgat cgtcttttct tcaaatgcat   840

ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgcctgagtc   900

tatgagggaa gaatatcggc aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg atggtcattt   960

tgtcaacata gagctggagt aa                                            982

 

<210>24

<211>838

<212>RNA

<213>H9N2禽流感病毒Y3中的NS基因

<400>24

atgaactcca acactgtgtc aagcttccag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa   60

cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccatttctag accggcttcg ccgagatcag  120

aagtccctga gagggagaag cagcactctt ggtctggaca tcagaactgc tactcgtgaa  180

ggaaagcata tagtggaacg gattttagag gacgagtcag atgaagcatt taaaatgagt  240

attgcttcag tgccagctcc ccgctatcta actgacatga ctcttgaaga aatgtcgaga  300

gattggttaa tgctcattcc caaacagaaa gtgacagggt ccctttgcat tagaatggac  360

caagcaatag tggacaaaaa catcacattg aaagcaaatt tcagtgtgat tttcaatcga  420

cttgaagccc tgatactact tagagctttt acggaagaag gagcaattgt gggcgaaatc  480

tcaccattac cttctcttcc aggacatact gacaaggatg tcaaaaatgc aattggggtc  540

ctcatcggag gatttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga  600

ttcgcttgga gaagcagcga tgaggatggg agacctccac tctctacaaa gtagaaacgg  660

gaaatggaga gaacagctaa gccagaagtt cgaagaaata agatggttga ttgaagaagt  720

acgacataga ttaaagatta cggagaatag ctttgagcaa ataactttta tgcaagcctt  780

acaactattg cttgaagtgg agcaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaa    838

Claims (24)

1.一种分离的禽流感病毒，其基因组由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的RNA片段组成。

2.如权利要求1所述的一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3117。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的分离的禽流感病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求1或2所述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

4.一种用于预防权利要求1或2所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于：含有灭活的权利要求1或2所述的分离的禽流感病毒。

5.权利要求4所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将权利要求1或2所述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

6.如权利要求5所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

7.如权利要求5所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到已灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

8.一种抗体，抗权利要求1或2所述的一种分离的禽流感病毒。

9.一种分离的禽流感病毒，其基因组由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的RNA片段组成。

10.如权利要求9所述的一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3118。

11.一种用于检测权利要求9或10所述的分离的禽流感病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求9或10所述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P 1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

12.一种用于预防权利要求9或10所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于：含有灭活的权利要求9或10所述的禽流感病毒。

13.权利要求12所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将权利要求9或10所述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

14.如权利要求13所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

15.如权利要求13所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

16.一种抗体，抗权利要求9或10所述的一种分离的禽流感病毒。

17.一种分离的禽流感病毒，其基因组由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的RNA片段组成。

18.如权利要求17所述的一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3119。

19.一种用于检测权利要求17或18所述的分离的禽流感病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求17或18所述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1：5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2：5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2：5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2：5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2：5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2：5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2：5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

20.一种用于预防权利要求17或18所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于：含有灭活的权利要求17或18所述的禽流感病毒。

21.权利要求20所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将权利要求17或18所述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1∶256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

22.如权利要求21所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

23.如权利要求21所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2％-5％之间，经充分溶解混合即为水相。

24.一种抗体，抗权利要求17或18所述的一种分离的禽流感病毒。

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