CN102443571A - 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其应用。禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD株，已于2011年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4689。本发明提供的AIV-SD株对鸡具有致病力，但对哺乳动物的毒性很弱。将AIV-SD株病毒液灭活后，可以作为疫苗。接种本发明提供的疫苗后，可以大大增加雏鸡对禽流感病毒的预防能力，大大提高养殖产的经济效益。本发明对于禽流感病毒的防治具有重大价值。

Description

一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其应用
技术领域
本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其应用。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)，是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染性疾病综合征。根据病毒血凝素和神经氨酸酶的区别将A型流感病毒分为不同亚型。自1966年第一株H9N2亚型AIV——A/Turkey/Wisconsin/1/66(Ty/WI/1/66)被分离后，其迅速在世界范围内流行，主要引起家禽呼吸道、产蛋量下降等症状，个别混合感染案例还能引起较高的死亡率，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。目前H9N2亚型AIV已广泛分布于各大洲的多种禽类中，尤其在亚洲，H9N2亚型AIV几乎遍布亚洲的每个角落。我国是亚洲第一株H9N2亚型AIV的分离地，也是饱受病毒危害最严重的国家之一。自1988年亚洲第一株H9N2亚型AIV在我国香港分离后，该亚型病毒在我国境内便迅速传播开来并形成了Ck/BJ/94-like、Ck/Y280/97-like、Ck/SH/F98-like、Qa/HK/G1/97-like、Dk/HK/Y439/97-like等稳定的遗传谱系，且通过基因重排等方式不断变异。值得注意的是，近年甚至出现了H9N2和H5N1病毒重排的现象。
H9N2亚型AIV不仅在禽类中广泛传播，在哺乳动物——猪群中也同样存在病毒的感染和流行。1998年4月，Markwell等从香港的家猪体内首次分离到2株H9N2亚型AIV病毒。2001年，Peiris等证实了H9N2亚型AIV和H3N2亚型人流感病毒在我国东南部猪群中存在共感染的现象。2002～2004年，又不断有H9N2病毒感染我国猪群并导致发病的报道，给养猪业带来了一定的经济损失。进一步遗传进化分析显示，H9N2病毒在猪体内发生了重排，包括鸡源和鸭源H9N2病毒的重排、H9N2亚型和H5N1亚型病毒的重排。H9N2亚型AIV感染并在猪群中的传播，说明该亚型病毒已经突破了种间屏障，实现了从禽到哺乳动物的传播；H9N2亚型重排病毒在猪体内的发现，说明H9N2亚型病毒正在通过“混合器”以重排等方式发生着变异。历史证明1957年“亚洲流感(H2N2)“、1968年“香港流感(H3N2)”以及2009年甲型H1N1流感的大流行，都是含有禽流感病毒基因片段的重排病毒。那么如果H9N2亚型AIV在猪体内重排出了新型病毒，将可能严重威胁动物及人类的健康。
H9N2亚型AIV在禽和猪群中的传播和流行，及其偶尔感染人类的事实，表明H9N2亚型AIV具有重要的公共卫生学意义。很多科学家甚至预言，H9N2病毒很有可能成为下一次人类流感大流行病毒的元凶或基因供体。为此有学者利用雪貂为模型，评估了H9N2亚型AIV对人类的潜在危险性。结果显示试验所用的H9N2亚型AIV毒株均能在雪貂体内复制，有些毒株还能通过直接接触传播；HA蛋白226位的亮氨酸对H9N2亚型AIV在雪貂间地有效传播起着重要作用；H9N2亚型AIV表面蛋白基因和人H3N2病毒内部基因的重排模式，能增强病毒复制能力和传播效率，证明了H9N2亚型AIV对人类具有潜在的危险性。
H9N2亚型病毒并不像H5N1亚型病毒一样对人类具有致死性感染的能力。在所有感染人的案例中，H9N2亚型病毒只引起了轻微的感冒样症状。但近年来有些研究报道称，发现了可致小鼠死亡的H9N2亚型AIV。这给我们敲响了警钟，提醒我们在筛选疫苗的时候既需要考虑疫苗候选株的繁殖能力、免疫原性等疫苗株所必须具有的特性，还必须要考虑疫苗候选毒株对哺乳动物的致病力，避免使用对哺乳动物具有潜在强致病力的疫苗候选株，防止H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物及人类造成潜在威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其应用。
禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD株，已于2011年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4689。禽H9N2亚型流感病毒又称H9N2亚型禽流感病毒。禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza AVirus)AIV-SD株CGMCC No.4689简称AIV-SD株。
AIV-SD株可用于制备禽流感病毒疫苗。所述禽流感病毒疫苗具体可为针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗。
本发明还保护一种制备AIV-SD株病毒液的方法，包括如下步骤：将AIV-SD株接种鸡胚，培养后收集尿囊液，AIV-SD株病毒液。所述鸡胚可为9-10日龄的鸡胚(SPF鸡胚)；所述培养的时间为48至96小时，优选为72小时。
所述方法制备得到的AIV-SD株病毒液也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种禽流感病毒疫苗，它的活性成分为灭活后的AIV-SD株。所述禽流感病毒疫苗具体可为针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗。所述禽流感病毒疫苗的制备方法可包括如下步骤：将所述AIV-SD株病毒液依次进行灭活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。所述禽流感病毒疫苗具体可为针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗。
本发明还保护一种禽流感病毒疫苗的制备方法，是将所述AIV-SD株病毒液依次进行灭活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。所述禽流感病毒疫苗具体可为针对H9N2亚型禽流感病毒的疫苗。
所述灭活的方法具体如下：将所述AIV-SD株病毒液5000×g离心10min，取上清；在所述上清中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时，得到灭活后病毒液。
所述乳化的方法具体如下：将3体积份油相、1体积份水相和1％(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01％(质量百分含量)，得到禽流感病毒疫苗；所述油相的制备方法如下：将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1.6～1.8克硬脂酸铝(如1.75克硬脂酸铝)；所述水相的制备方法如下：将4体积份吐温-80和96体积份所述灭活后的病毒液混匀。
所述疫苗可用于家禽，如鸡，具体可为白杭鸡雏鸡。
本发明提供的AIV-SD株对鸡具有致病力，但对哺乳动物的毒性很弱。将AIV-SD株病毒液灭活后，可以作为疫苗。接种本发明提供的疫苗后，可以大大增加雏鸡对禽流感病毒的预防能力，大大提高养殖产的经济效益。本发明对于禽流感病毒的防治具有重大价值。
附图说明
图1为实施例1中AIV-SD株的RT-PCR鉴定电泳图；M：DNA marker，从上至下的大小依次为：5000，3000，2000，1000，750，500，200，100；C为阳性对照，1～5为AIV-SD株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.3、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的96孔微量血凝板的型号均为：每行12个孔，每列8个孔。
实施例1、禽H9N2亚型流感病毒AIV-SD株的发现和鉴定
一、H9N2亚型禽流感病毒AIV-SD株的发现
本发明的发明人从某鸡场(2010年5月，在山东省潍坊市的鸡场，由刘文军、毕玉海发现)的发病鸡体内分离获得了一株禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza AVirus)，将其命名为AIV-SD株，已于2011年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4689。禽H9N2亚型流感病毒又称H9N2亚型禽流感病毒。禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD株CGMCC No.4689简称AIV-SD株。
二、制备AIV-SD株病毒液
将AIV-SD株接种SPF鸡胚(10日龄)，接种72小时后收集尿囊液(AIV-SD株病毒液)。将AIV-SD株病毒液进行256倍稀释，稀释液即为四单位抗原。
实施例2、禽H9N2亚型流感病毒AIV-SD株的鉴定
一、血凝试验
在96孔微量血凝板的各孔内分别加入25μl 0.9％生理盐水。在第一列孔内分别加入25μl实施例1制备的AIV-SD株病毒液，混匀后，从第一列孔吸出25μl液体加到第二列孔内，依次倍比稀释直至第十一列孔，从第十一个列孔吸出25μl液体弃除。第十二列孔作为阴性对照。在各孔内分别加入25μl 1％鸡红细胞悬液，振荡混匀。室温静置约三十分钟后观察结果。阴性对照孔正常的情况下，能使鸡红细胞完全凝集的最高稀释倍数为病毒液的凝集价。
实施例1制备的AIV-SD株病毒液的凝集价为1∶1024(1∶210)。
二、血凝抑制试验
分别将购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的H3N8亚型禽流感病毒标准阳性血清和H9N2亚型禽流感病毒标准阳性血清进行如下实验：
在96孔微量血凝板上的各孔内分别加入25μl 0.9％生理盐水；在第一列孔和最后一列孔内分别加入25μl禽流感病毒标准阳性血清(最后一列孔作为血清对照孔)；从第一列孔吸出25μl液体加到第二列孔内，依次倍比稀释直至第十一个孔，从第十一孔吸出25μl液体弃除；在最后一列孔内分别加入25μl 0.9％生理盐水，在其它各孔内分别加入25μl实施例1制备的四单位抗原；轻轻摇匀后置室温60min，然后在各孔内分别加入25μl1％鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置约三十分钟(30min-60min均可)后观察结果。能够抑制红细胞凝集的禽流感病毒标准阳性血清的亚型即为AIV-SD株的亚型。
结果表明，AIV-SD株为H9亚型。
三、神经氨酸酶抑制试验
分别将购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的H3N8亚型禽流感病毒标准阳性血清和H9N2亚型禽流感病毒标准阳性血清进行如下实验：
将禽流感病毒标准阳性血清用灭菌后的PBS缓冲液进行10倍稀释，然后取25μl加入试管中；将实施例1制备的AIV-SD株病毒液用灭菌后的PBS缓冲液进行10倍稀释，然后取25μl加入上述试管中；用Para膜封盖管口，37℃反应1小时；然后加50μl入胎球蛋白溶液(胎球蛋白0.5g+20mL pH5.9的PB溶液+20mL去离子水，-20℃分装保存；pH5.9的PB溶液：取81mL 0.4M NaH2PO4水溶液、19mL 0.4M Na2HPO4水溶液，混匀配成0.4Mbuffer，调pH至5.9)，37℃反应2小时(或过夜)；再加入50μl过碘酸钠溶液(过碘酸钠4.28g加入去离子水38mL，加热溶解，室温冷却后加62mL 85％正磷酸水溶液混匀，室温避光保存)，振荡，室温下静置20分钟；加入500μl亚砷酸盐溶液(亚砷酸钠10.0g、无水硫酸钠7.1g，加入去离子水100mL，加热溶解，室温冷却后加0.3mL浓硫酸，室温保存)，并振荡至颜色消失；再加入1.25ml硫代巴比妥酸溶液(无水硫酸钠17.75g、硫代巴比妥酸1.5g，加入去离子水250mL，沸水中加热溶解，室温保存)，并振荡；沸水中煮沸15分钟，观察结果。判定标准：粉红色表明抗血清无抑制作用；无色者表明血清有抑制作用，由此判定神经氨酸酶的亚型。
结果表明，AIV-SD株为N2亚型。
四、分子生物学鉴定
提取AIV-SD株的RNA，反转录为cDNA。根据GENBANK发表的AIV全基因序列设计的一对特异性引物(P1和P2；靶序列为HA基因的部分片段，目的条带为480bp)。以cDNA为模板，用P1和P2组成的引物对进行RT-PCR扩增。
P1：5’-TTGGTATGGATTCCAGCATTC-3’；P2：5’-GATTCCAGCTTGACCCCCTCT-3’。
RT-PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图1。结果表明，AIV-SD毒株为禽流感病毒。
五、全基因组序列的测定
1、RT-PCR引物的合成
根据已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的RT-PCR引物(见表1)。
表1禽流感H9N2病毒各基因片段扩增所用的引物序列
  基因片段   RT-PCR引物序列
  NS-F 5’-TAT TCg TCT CAg ggA gCA AAA gCA ggg Tg-3’
  NS-R 5’-ATA TCg TCT CgT ATT AgT AgA AAC AAg ggT gTT TT-3’
  M-F 5’-TAT TCg TCT CAg ggA gCA AAA gCA ggT Ag-3’
  M-R 5’-ATA TCg TCT CgT ATT AgT AgA AAC AAg gTA gTT TTT-3’
  NA-F 5’-TAT Tgg TCT CAg ggA gCA AAA gCA ggA gT-3’
  NA-R 5’-ATA Tgg TCT CgT ATT AgT AgA AAC AAg gAg TTT TTT-3’
  NP-F 5’-TAT TCg TCT CAg ggA gCA AAA gCA ggg TA-3’
  NP-R 5’-ATA TCg TCT CgT ATT AgT AgA AAC AAg ggT ATT TTT-3’
  HA-F   5’-gTC TCA ggg AgC AAA AgC Agg gg-3’
  HA-R 5’-ATA TCg TCT CgT ATT AgT AgA AAC AAg ggT gTT TT-3’
  PB2-F   5’-TAgg AgC gAA AgC Agg TC-3’
  PB2-R   5’-ggA gTA gAA ACA Agg TCg TTT-3’
  PB1-F   5’-ATT TAg CgA AAg CAg gCA-3’
  PB1-R   5’-Tgg AgT AgA AAC AAg gCA TTT-3’
  PA-F   5’-ggg AgC gAA AgC Agg TAC-3’
  PA-R   5’-CCg gAg TAg AAA CAA ggT ACT T-3’
2、提取实施例1制备的AIV-SD株病毒液的总RNA。
3、以总RNA为模板，分别采用步骤1设计的各对引物进行RT-PCR，以扩增各个基因片段。RT-PCR反应体系见表2。
表2RT-PCR反应体系
  DEPC水   12.4μl
  10×PCR buffer   2.5μl
  dNTPs(2.5mmol/L)   5μl
  Rnasin(30U/μl)   0.6μl
  M-MLV(200U/μl)   0.5μl
  TaqE(2U/μl)   1μl
  Primer-F   0.5μl
  Primer-R   0.5μl
  VRNA   2μl
RT-PCR反应条件：37℃逆转录45min；94℃预变性5min；94℃变性30s，退火45s，72℃延伸，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
各基因片段的扩增长度及反应参数见表3。
表3各基因片段扩增长度及反应参数
  基因片段   退火温度(℃)   扩增长度(bp)   延伸时间(min)
  PB2   58   2341   2.5
  PB1   58   2341   2.5
  PA   58   2233   2.5
  HA   58   1742   2
  NP   58   1565   2
  NA   58   1458   1.5
  M   58   1027   1.5
  NS   58   890   1
4、将步骤3的RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
5、回收琼脂糖凝胶上的目的片段，送公司测序(北京华大基因研究中心)。使用DNAstar的Lasergene V7.1软件包进行序列的分析。各基因片段的长度结果见表4，来源分析结果见表5。NP基因如序列表的序列1所示，其编码的蛋白如序列表的序列2所示。M基因如序列表的序列3所示，编码的一个蛋白如序列表的序列4所示(M1蛋白)，编码的另一个蛋白如序列表的序列5所示(M2蛋白)。NS基因如序列表的序列6所示，编码的一个蛋白如序列表的序列7所示(NS1蛋白)，另一个蛋白如序列表的序列8所示(NS2蛋白)。PB2基因如序列表的序列9所示，其编码的蛋白如序列表的序列10所示。PB1基因如序列表的序列11所示，其编码的蛋白如序列表的序列12所示。PA基因如序列表的序列13所示，其编码的蛋白如序列表的序列14所示。HA基因如序列表的序列15所示，其编码的蛋白如序列表的序列16所示。NA基因如序列表的序列17所示，其编码的蛋白如序列表的序列18所示。
表4各基因片段概况及序列长度
Figure BDA0000100530960000061
Figure BDA0000100530960000071
表5H9N2亚型禽流感SD毒株的基因来源分析
Figure BDA0000100530960000072
注：Y280，Y280-like病毒，代表毒株为A/duck/Hong Kong/Y280/97；F98，F98-like病毒，代表毒株为A/Chicken/Shanghai/F/98；G1，Gl-like病毒，代表毒株为A/Quail/Hong Kong/G1/97；H，H-like病毒，代表毒株为A/chicken/Shandong/H/09。
实施例3、AIV-SD株病毒液EID50的测定
1、将实施例1制备的AIV-SD株病毒液用灭菌后的PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。
2、将稀释液接种SPF鸡胚(10日龄)，每个鸡胚接种0.1ml，接种后72小时后收集尿囊液。每种稀释液设置三个重复试验，即接种3个鸡胚。
3、测定尿囊液的HA效价
在96孔微量血凝板的各孔内分别加入25μl 0.9％生理盐水。在第一列孔内分别加入25μl尿囊液，混匀后，从第一列孔吸出25μl液体加到第二列孔内，依次倍比稀释直至第十一列孔，从第十一个列孔吸出25μl液体弃除。第十二列孔作为阴性对照。在各孔内分别加入25μl 1％鸡红细胞悬液，振荡混匀。室温静置约三十分钟后观察结果。阴性对照孔正常的情况下，能使鸡红细胞完全凝集的最高稀释倍数为病毒液的凝集价。如果尿囊液的凝集价≥24时，对应的稀释液判断为阳性。
各个稀释液的结果见表6。
表6各个稀释液的HA效价结果
  稀释度为107的稀释液   三个重复试验的结果均为阳性
  稀释度为108的稀释液   三个重复试验的结果均为阳性
  稀释度为109的稀释液   三个重复试验中，一个的结果为阳性
  稀释度为1010的稀释液   三个重复试验的结果均为阴性
4、根据Reed-Muench氏法计算EID50
按Reed-Muench氏法计算EID50，中间数据见表7。
表7按Reed-Muench氏法计算EID50的中间数据
注：A、B和C项为原始数据；D项为B项减去C项之值；E项为C项从下向上加的值；F项为D项从上往下加的值；G项为E项比上E和F项之和；H项为E项比上E和F项之和的百分数结果。从表7可见，半数鸡胚感染量的稀释度(即EID50)介于10-8与10-9之间。
距离比＝(高于50％的百分数-50)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)＝(100-50)/(100-33.3)＝0.75。
EID50＝高于50％的病毒稀释度的负对数+距离比＝8+0.75＝8.75。
使50％鸡胚感染的稀释度为10-8.75，当实施例1制备的AIV-SD株病毒液进行108.75倍稀释时，0.1ml中含1个EID50，即每毫升实施例1制备的AIV-SD株病毒液中的病毒含量为109.75EID50。
实施例4、AIV-SD株对小鼠的致病性
6周龄BALB/c雌鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。
将6周龄BALB/c雌鼠随机为2组(每组小鼠8只)，经舒泰麻醉，当结膜反射失去、且显腹式呼吸时分别进行如下处理：
感染组：每只雌鼠鼻腔接种50μl实施例1制备的AIV-SD株病毒液(109.75EID50/ml)；
对照组：每只雌鼠鼻腔接种50μl灭菌后的PBS缓冲液。
从接种开始计时，整个实验进行14天。
每日观察小鼠的饮食、活动、背毛、体重等临床症状。整个实验过程中，感染组小鼠和对照组小鼠的采食、活动、体重、背毛等临床症状均无明显差异。接种后第14天，各组小鼠的背毛均整洁。与接种当天的体重相比，接种后第14天，感染组小鼠体重增重的平均值为13.97％，对照组小鼠体重增重的平均值为13.04％。
接种后第3天剖杀小鼠(每组剖杀3只)，无菌采集小鼠肺脏，加入1ml灭菌后的PBS缓冲液研磨，得到研磨原液。检测研磨原液的HA效价，方法同实施例3的步骤3。感染组的3只小鼠中，只有一只小鼠的肺脏研磨原液的凝集价大于≥24(为阳性结果)，另外两只小鼠的肺脏研磨原液的凝集价为0。对照组的3只小鼠的肺脏研磨原液的凝集价均为0。
接种后第14天，采集各组剩余小鼠的血液，5000×g离心3min，收集血清，进行如下检测：在96孔微量血凝板的各孔内依次加入25μl 0.9％生理盐水；在第一列孔和第二列孔内各加入25μl血清(最后一列孔作为血清对照孔)；从第二列孔起作倍比稀释至第十一列孔，从第十一列孔吸出25μl液体弃除；在最后一列孔内加入25μl 0.9％生理盐水，在其它各孔内均加入25μl实施例1制备的四单位抗原；轻轻摇匀后置室温60min，然后在各孔内均加入25μl 1％鸡红细胞悬液，振荡混匀。置室温静置约三十分钟后观察结果。获自各个小鼠的血清均不能抑制红细胞凝集。
实施例5、AIV-SD株作为疫苗的应用
一、疫苗的制备
1、将实施例1制备的AIV-SD株病毒液5000×g离心10min，取上清。
2、在上清中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0.1％，37℃灭活24小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)，期间振摇3～4次，得到灭活病毒液。
3、乳化
油相制备：94体积份注射用白油和6体积份加司本-80，充分混合，然后加硬脂酸铝(每100毫升混合液加入1.75克硬脂酸铝)，逐渐搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相制备：取4体积份灭菌吐温-80，加入96体积份灭活病毒液，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
乳化：取油相3体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相1体积份，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞水溶液，使其终浓度为0.01％，得到灭活疫苗。
二、对雏鸡免疫的效力
将10日龄雏鸡(品种为SPF白杭鸡，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)分为四组，每组10只，分别进行如下处理：
第一组：注射灭活疫苗，每只雏鸡皮下注射0.1ml；
第二组：注射灭活疫苗，每只雏鸡皮下注射0.2ml；
第三组：注射灭活疫苗，每只雏鸡皮下注射0.4ml；
第四组(空白对照组)：注射生理盐水，每次每只雏鸡皮下注射0.2ml。
试验中采用单次免疫，免疫后第14天，各组雏鸡均肌肉注射实施例1制备的AIV-SD株病毒液，攻毒剂量均为107EID50，之后再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数(即该组中未死亡的雏鸡只数)，结果见表8。
表8AIV-SD株作为疫苗的应用效果
  鸡群只数   攻毒剂量EID50   攻毒保护数
  第一组   10   107   9
  第二组   10   107   10
  第三组   10   107   10
  第四组   10   -   0
雏鸡效力试验表明：以0.1ml剂量免疫雏鸡，攻毒保护率在90％以上(存活雏鸡的口腔和泄殖腔不排毒)；以0.2ml剂量和0.4ml剂量进行免疫，攻毒保护率为100％(存活雏鸡的口腔和泄殖腔不排毒)；空白对照组的鸡均全部发病并死亡(从口腔、泄殖腔均能分离到病毒)，保护率为0％。
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Figure IDA0000100531040000191

Claims (8)

1.禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2 Influenza A Virus)AIV-SD株，它的保藏编号为CGMCC No.4689。
2.权利要求1所述禽H9N2亚型流感病毒AIV-SD株在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
3.制备AIV-SD株病毒液的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述禽H9N2亚型流感病毒AIV-SD株接种鸡胚，培养后收集尿囊液，即为AIV-SD株病毒液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述鸡胚为9-10日龄的鸡胚；所述培养的时间为48至96小时。
5.权利要求3或4所述方法制备得到的AIV-SD株病毒液。
6.一种禽流感病毒疫苗，它的活性成分为灭活后的权利要求1所述禽H9N2亚型流感病毒AIV-SD株。
7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将权利要求5所述AIV-SD株病毒液依次进行灭活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。
8.一种制备禽流感病毒疫苗的方法，是将权利要求5所述AIV-SD株病毒液依次进行灭活和乳化，得到禽流感病毒疫苗。
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