CN101508978A - 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其生物学特性，以及其在生物学上的应用，保藏编号为CCTCC NO：V200812；从分子水平阐明了本病毒与其他分离毒株的差异，并证明该病毒株可以用作禽流感疫苗的候选株以及H9亚型AIV血凝和血凝抑制实验(HA－HI)的抗原。该毒株对了解中国鸡源H9N2禽流感病毒的分子进化及抗原性变异具有重要意义。

Description

一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其生物学特性，以及其在生物学上的应用。

背景技术

禽流感病毒(AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb，编码至少11个病毒蛋白。由于AIV负链、分节段的RNA病毒性质，病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。AIV据其致病性可分为高致病性AIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus，HPA1V)和低致病性AIV(LowPathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5和H9亚型为主。

自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染。H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AI不仅对我国的养殖业造成了严重损失，而且对人类健康也构成了威胁。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践证明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。

世界范围内的H9N2 AIV可分为北美谱系和欧亚谱系。而欧亚谱系又可分为：A/chicken/beijing/1/1994-like(BJ 94)分支、A/quail/Hongkong/G1/1997-like(G1 97)分支、A/duck/Hongkong/Y439/1997-like(Y439 97)分支以及国内近年来出现的A/shanghai/F/1998(F 98)分支。鸡群是中国国内数量最大的禽群，也是人类最常接触到的禽类。所以对鸡群进行长期的AIV分子流行病学监测，密切观注其传播和进化情况，具有重要的公共卫生学的意义。

发明内容

本发明的发明人提供了一种重组的鸡源的A/chicken/Shandong/B4/2007 H9N2禽流感病毒毒株，并提供了该毒株的全基因组序列，阐明其8个基因片段与国内经典的H9N2病毒株在系统进化上的差异，从而为H9N2病毒的分子进化和流行病学研究提供资料，同时提供了该毒株的分离、鉴定和纯化的方法以及该毒株的部分生物学性质，以明确其作为H9N2流感疫苗侯选毒株和HA-HI实验抗原的可行性。

发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V200812。

该病毒的全基因序列如说明书中所示，其中其HA、NA、NS基因隶属于BJ 94分支，NP、PA、PB2和PB1基因隶属于F 98分支，M基因属于G1 97分支，加之该病毒的全基因组序列测定表明，因此，这是一株重组毒株。

针对该病毒的特性，发明人采用的分离及鉴定方法如下：

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液的HA效价，并据此制备4单位病毒，用标准的H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定病毒为H9亚型AIV与NDV的混合感染。

为了得到纯化的病毒，发明人采用的纯化方法如下：

首先使用ND阳性血清中和法进行初步纯化，然后再用有限稀释法进一步纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定表明获得了纯化的H9亚型AIV。

通过上述方法得到的纯化的H9亚型AIV，可以进行下述的各种操作，其确定其各种性质：

1.病毒在鸡胚中的生长特性该病毒在鸡胚中可高滴度生长，血凝素效价稳定在2¹⁰左右。

2.毒株EID₅₀的测定将毒株10倍系列稀释后，各取0.2ml接种11日龄SPF鸡胚。收集96小时内死亡的鸡胚尿囊液，测定HA效价，确定鸡胚感染情况。计算EID₅₀，确定毒株对鸡胚的毒力。该病毒对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)为10^-5.75/0.2ml。

3.病毒的交叉血凝抑制实验及HA抗原相关性分析分别制备12株AIV分离毒株的油乳剂灭活苗，免疫SPF鸡，在隔离饲养器内制备单因子血清，用于交叉HI试验，检测该H9N2病毒的HA抗原是否广谱。结果该病毒与其余11株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.84，表明这株病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，可用做H9N2禽流感疫苗的候选毒株。

4.病毒的全基因组序列测定参考genbank上已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)的RT-PCR引物。优化不同基因片段的RT-PCR反应体系和循环参数，分别扩增H9亚型AIV各基因片段。RT-PCR产物进行胶回收，与pEASY-T1载体连接，转化DH5α感受态细胞。挑取白色菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定为阳性者进行测序。为了保证测序结果的准确性，每个基因片段各测3个阳性克隆的序列，该病毒的全基因组序列测定表明，这是一株重组毒株，其HA、NA、NS基因隶属于BJ94分支，NP、PA、PB2和PB1基因隶属于F98分支，M基因属于G197分支。其具体的基因组序列如说明书中所示，说明书中序列表按照PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，NS的顺序顺次排列为1-8。

通过该毒株生物学性质的测定可知：A/chicken/Shandong/B4/2007 H9N2可在鸡胚中高滴度增殖，而且其血凝素蛋白(HA)抗原性好，因此可以作为H9N2流感疫苗侯选毒株，用于灭活疫苗或基因工程疫苗的研发，可采用现有的疫苗加工方法；也可以用作HA-HI实验抗原，检测待检血清中是否存在针对H9亚型血凝素抗原的抗体。

保藏信息

保藏时间：2008年12月8日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心  CCTCC

保藏编号：CCTCC NO：V200812

保藏单位地址：中国武汉大学

分类命名：H9N2流感病毒CK SD B4 07

A/chicken/Shandong/B4/2007

具体实施方式

实施例1

一株重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株A/chicken/Shandong/B4/2007，该病毒的分离和鉴定方法如下：

1.病料的处理与鸡胚尿囊腔接种

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取其余鸡胚的尿囊液。

2.病毒的鉴定

制备1％浓度的鸡红血球，通过血凝试验(HA)检测尿囊液的HA效价，对于HA效价大于4者，制备4单位病毒。以4单位病毒为待检抗原，与标准的H5和H9亚型禽流感病毒阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行血凝抑制试验(HI)，鉴定病毒的类型。

实验结果

收获的鸡胚尿囊液HA效价为7-10，据此制备的4单位病毒对标准NDV、H5和H9阳性血清的HI效价分别为：8，0，6.该实验结果表明，该鸡胚尿囊液中含有H9亚型AIV和NDV，而没有H5亚型AIV。

该病毒的纯化方法如下：

1.ND阳性血清中和法初步纯化使用ND阳性血清去除上述混合感染了两种病毒的鸡胚尿囊液中的NDV：将上述含有混合毒的尿囊液与等体积的ND无菌阳性血清混合，37℃作用1小时，然后接种11日龄的SPF鸡胚。收获24-96小时内的鸡胚尿囊液，重复上述的中和步骤，鸡胚传代1次。收获的含毒尿囊液用于下述的纯化。

2.有限稀释法进一步纯化

经中和法纯化得到的鸡胚尿囊液做10^-4-10^-9倍的倍比稀释，取各稀释度的尿囊液分别接种11日龄的SPF鸡胚尿囊腔。收获的病毒通过HA和HI实验检测是否含有H9亚型AIV。

取稀释倍数最低的含毒尿囊液同上法连续传代2次进行纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定纯化效果。结果表明，已完全除去了混合感染毒中的NDV，获得了H9亚型AIV的纯化毒株。

实施例2

病毒HA抗原性分析

实验方法：

1.H9单因子血清的制备

将H9N2亚型AIV分离毒株11株以及A/chicken/Shandong/B4/2007，分别制备油乳剂灭活苗。以上述疫苗分别免疫1月龄的SPF鸡，在隔离饲养器内饲养制备单因子血清。共免疫两次，之间间隔2周，第二次免疫14天收集血液，分别制备阳性血清。

2.交叉HI试验

以上述12株病毒为抗原，分别制备其4单位病毒，与上述12种单因子血清进行交叉HI试验，检测这些H9N2病毒的HA抗原的反应性。实验重复三次。取三次实验的平均值用于R值分析，从而确定上述H9N2病毒HA抗原之间的相关性。抗原相关性的判定标准如下：

抗原间的相关性R＝√(r1×r2)，

R一2株病毒间的抗原性差异

r1一甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴度

r2一乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度

如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R<0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R<0.5，表明两个毒株间抗原性的明显差异；R值越小，抗原性差异越大。

试验结果：

表1  不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果

表2  不同H9N2 AIV毒株间的HA抗原相关性

不同H9N2亚型AIV毒株间的HI交叉试验结果以及HA抗原相关性分析结果分别见表1和表2.由表2可见，A/chicken/Shandong/B4/2007(SD B4 07)与其余11株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.84，表明该病毒与其余毒株的HA抗原相关性好，可作为H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。

实施例3

该病毒全基因组序列的测定

实验方法：

1.RT-PCR引物的合成

参考genbank上已发表的H9亚型AIV序列资料，设计并合成了AIV基因组8个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS)的RT-PCR引物(见表3)。

表3  禽流感病毒各基因片段扩增用引物序列

2.病毒RNA的提取

以含毒的鸡胚尿囊液为RNA提取的材料，按照Trizol试剂盒(Invitragen)说明书进行操作。

3.各基因的RT-PCR

使用TAKARA公司的PrimeScript^TMOne Step RT-PCR Kit，反应体系为50ul：RNase FreedH₂O 30.5μl，10×Buffer 5μl，Enhancer Solution 1μl，dNTP Mixture 2μl，RNaseInhibitor 1μl，PrimeScript^TMRTase 0.5μl，EX Taq^TMHS 1μl，RNA样品6μl，上下游引物各1.5μl。RT-PCR反应条件为：先用50℃ 30min进行反转录，94℃ 5min预变性，然后94℃ 50s变性，退火A(见表4)1min，72℃延伸1-3min(见表4)进行5个循环；然后退火B(见表4)1min，72℃延伸1-3min(见表4)进行25个循环。最后72℃延伸10min，4℃结束反应。

表4  各基因片段的PCR扩增长度和PCR反应参数

4.扩增产物的回收纯化

RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，按Gel Extraction kit的说明回收和纯化核酸。

5.基因的克隆及酶切鉴定

RT-PCR产物经回收纯化后与pEasy-T1载体(TransGen公司)连接并转化到DH5α感受态细胞(自备)。挑取在Amp+的LB培养基上生长的白色菌落，37℃摇震过夜培养，按PlasmidMini kit I(OMEGA公司)的说明提质粒。提取的质粒通过电泳与空质粒的大小相比较，初步鉴定为阳性者进行双酶切鉴定(限制性内切酶HindIII、Xba I购自Fermentas公司)。酶切体系为20μl，其中待鉴定质粒8μl，DEPC水8μl，10×buffer Tango 2μl，HindIII和Xba I各1μl。

6.AIV分离株8个基因片段的序列测定及分析

每个片段取三个经质粒酶切鉴定为阳性的克隆菌，送公司测序(北京博尚，北京华大，北京迪安百泰公司)。对于分段扩增的片段(HA和PB1)，对测序结果进行拼接。使用DNAstar的Lasergene v7.1软件包进行序列的分析。用其中的Seqman程序进行试验毒株和参考毒株序列的编辑及推定的氨基酸的翻译；用MegAlign程序中的Jotun Hein方法比较序列的同源性并绘制系统进化树。各结果如下：

1.各基因的长度、蛋白编码情况以及系统进化分析所使用的核酸范围见表5。

表5  各基因片段概况及系统进化分析所使用的序列区域

2.实验毒株全基因的进化树

图1为HA基因的系统进化树；

图2为NA基因的系统进化树；

图3为M基因的系统进化树；

图4为NS基因的系统进化树；

图5为NP基因的系统进化树；

图6为PA基因的系统进化树；

图7为PB1基因的系统进化树；

图8为PB2基因的系统进化树。

3.表6详细列出了本毒株与参考毒株的全基因的基因型。

表6  实验毒株与参者毒株的全基因组的基因型

附1各个数字所代表的基因类型：1为BJ 1 94，2为SH F 98，3为HK G1 97，4为Y439分支，5为CK HK G9 97

实施例4 该病毒用于HA-HI实验用抗原的制备方法和实验方法

1.抗原的制备方法：

以HN L2 08为种毒，接种10-11日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，无菌收取24-120h内死亡、存活鸡胚尿囊液，加入0.2％甲醛溶液37℃灭活24h，同时加入0.02％叠氮钠作为防腐剂，4℃冰箱内保存。

2.抗原HA效价测定

取96孔血凝板，于前两排每孔加入0.01MPBS缓冲液25ul，每排第一孔加入25ul抗原，以2倍倍比稀释至12孔，加入1％鸡红细胞悬液，混匀后置室温(20-25℃)作用30min，判定HA效价，两排测定的HA效价应一致，否则重新检测。同时设0.01MPBS缓冲液作为阴性对照。

3.HI试验的方法

取96孔血凝板，每孔加入0.01MPBS缓冲液25ul，每排第一孔加入25ul待捡血清，以2倍倍比稀释至11孔。根据抗原HA效价配制4单位抗原，每孔加入4单位抗原25ul，混匀后置室温作用30min。然后加入1％鸡红细胞悬液混匀后置室温作用30min，判定血清样品的HI效价。

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

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ttcattgacg aacgaggcga atcaacgatt atagaatctg gcgatccaaa tgcgttattg    240

aaacaccgtt ttgaaataat cgaagggaga gaccgaacaa tggcctggac agtggtgaat    300

agtatctgca acaccacggg agtcgagaaa cccaaatttc ttccagatct gtatgactac    360

aaggaaaacc gattcattga aattggagta acgcggagag aagtccacat atactaccta    420

gagaaagcca ataaaataaa atctgagaag acacacatcc acattttctc attcactgga    480

gaagagatgg ccaccaaggc agattacact cttgacgacg agagcagggc aagaatcaaa    540

accaggctgt tcaccataag gcaggaaatg gccagcaggg gtctatggga ttcctttcgt    600

cagtccgaaa gaggcgaaga aacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aactatgcgc    660

aggcttgccg accaaagtct cccaccgaac ttctccagcc ttgaaaactt tagagcctat    720

gtggatggat tcgaaccgaa cggctgcatt gagggcaagc tttctcaaat gtcaaaagaa    780

gtgaacgcca gaatcgagcc atttctaagg acaacgccac gccccatcag attgcctaat    840

gggcctccct gctctcagcg gtcgaaattc ttgctgatgg atgctctgaa attaagcatt    900

gaggacccga gccacgaagg ggaggggata ccgctatatg atgcgatcaa atgcatgaaa    960

acattcttcg gatggaaaga gcccaacatt atcaaaccac atgagaaagg cataaacccc    1020

aattatctcc tgacttggaa gcaggtgcta tcagaacttc aggacattga aaatgaagag    1080

aagatcccaa agacaaagaa catgaaaaaa acaagccaat tgaagtgggc actcggtgag    1140

aacatggcac cggaaaaggt ggactttgaa gattgcaaag atgtcagtga cctgaaacag    1200

tacgacagtg atgagccaga gcccagatca ctagcatgtt ggatccagaa tgaatttaac    1260

aaggcatgtg aattgactga ttcaagctgg atagaacttg atgaaatagg ggaagatgtt    1320

gccccaatcg aacacattgc aagcatgaga cggaactatt tcacagcgga ggtgtcccac    1380

tgcagggcta ctgaatacat aatgaaggga gtgtacataa atacagcttt gctcaatgca    1440

tcttgtgcgg ccatggatga cttccaactg attccaatga taagcaaatg cagaaccaaa    1500

gaaggaagaa ggaaaacaaa cctatatgga ttcattataa agggaagatc tcatttgagg    1560

aatgataccg acgtggtaaa ttttgtaagt atggaatttt cccttactga cccgaggttg    1620

gaaccacata aatgggaaaa gtactgtgtt cttgaaatag gggacatgct tctgcgaact    1680

gcagtaggcc aagtgtcaag gcccatgttc ctgtatgtga gaaccaatgg gacttccaag    1740

atcaagatga aatggggtat ggaaatgaga cgctgccttc ttcaatctct tcaacagatt    1800

gagagcatga ttgaagctga atcctccgtc aaagagaaag acttgaccaa agaattcttt    1860

gaaaacaaat cagaaacatg gccaattggg gagtcaccca agggagtgga ggaaggctcc    1920

atcggaaagg tgtgcagaac cttactagca aaatctgtat tcaacagcct atatgcatct    1980

ccacaactcg aggggttctc agctgaatcg agaaaactgc tactcattgt tcaggcgctt    2040

agggacaacc tggaacctgg aaccttcgat cttggagggc tatatgaagc aatcgaggag    2100

tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcatcct ggttcaactc cttcctcaca    2160

catgcactga gatagttgtg gcaatgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta    2220

ccttgtttct act                                                       2233

<210>4

<211>1094

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>4

agcaaaagca ggggaatttc acaaccactc aagatggaag tagtatcact aataactata    60

ctactagtag tgacagtaag caatgcagac aaaatctgca tcggctacca atcaacaaac    120

tccacagaaa ctgtagacac gctaacagaa aacaatgttc ctgttacaca tgccaaagaa    180

ttgctccaca cagagcacaa tgggatgcta tgtgcaacaa atctgggtca tcctcttatc    240

ctagacacct gtaacattga aggattaatc tatggcaacc cttcctgtga tctactgttg    300

ggaggaagag aatggtccta cattgtagaa aggccatcgg ctgtcaatgg attgtgttac    360

ccagggaatg tagaaaacct agaagaacta aggtcacttt ttagctctgc tagttcttat    420

caaagagtcc agatctttcc agacacaatc tggaatgttt cttacagtgg gacaagcaaa    480

gcatgttcag attcattcta cagaagcatg agatggttga ctcaaaagag caacgcttac    540

cctattcaag acgcccaata cacaaataat agagggaaga acatcctctt catgtggggc    600

ataaaccacc cacccacaga cactacgcag acaaatctat acacaaggac tgacacaaca    660

acaagtgtgg cgacagaaga tataaataga accttcaaac cgttgatagg gccaaggcct    720

cttgtcaatg gtcagcaagg aagaattgat tattactggt ctatattgaa accaggtcag    780

acactgagag taagatccaa tgggaatcta attgctccat ggtatggaca cattctttca    840

ggagagagtc acggaagaat actgaagact gatttaaaca gtggtaactg tgtagtgcaa    900

tgtcagacag aaagaggtgg cttaaatact acattgccat tccaaaatgt aagtaagtat    960

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aggaatgtgc ctgctagatc aagcagaggt ctatttgggg ctatagctgg attcatagag    1080

ggaggttggt cagg                                                      1094

<210>5

<211>1559

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>5

gcagggtaga taatcactca ctgagtgaca tcaacatcat ggcgtctcaa ggcaccaaac    60

gatcctatga acagatggaa actggtggag aacgccagaa tgctactgag atcagggcat    120

ctgttggaag aatggttagc ggcattggga gattctacat acagatgtgt acagaactca    180

aactcagtga caatgaaggg agactgatcc agaacagtat aacaatagag agaatggtac    240

tctctgcatt tgatgaaaga aggaacagat acctggaaga gcaccccagt gcgggaaagg    300

acccgaagaa aactggaggt ccaatttacc gaagaagaga cgggaaatgg gtgagggagc    360

tgatcctgta tgacaaagag gagatcagga ggatttggcg tcaagcgaac aatggagagg    420

acgcaactgc tggtcttacc catctgatga tatggcattc caacctgaat gatgccacct    480

atcagagaac gagagctctc gtgcgtactg gaatggatcc caggatgtgc tctctgatgc    540

aaggatcaac tctcccgagg agatctggag ctgcaggtgc agcagtgaag gggataggga    600

caatggtgat ggaactgatt cggatgataa aacgagggat caacgaccgg aatttctgga    660

gaggcgaaaa tggaagaaga acaaggattg catacgagag gatgtgcaac atcctcaaag    720

ggaaattcca aacagcagca caaagagcaa tgatggatca agtgcgagag agcagaaatc    780

ctgggaatgc tgaaatagaa gatctcattt ttctggcaag gtctgcactc atcctgagag    840

gatcagtagc ccataagtcc tgcttgcctg cttgtgtata cggacctgca gtggccagtg    900

gatatgactt tgagagagaa gggtactccc tggttggaat agatcctttc cgtctgcttc    960

aaaacagcca ggtctttagt ctcattagac caaatgagaa cccagcacat aagagccaat    1020

tagtgtggat ggcatgccac tctgcagcat ttgaggacct tagagtctca agtttcatca    1080

gagggacaag aatggtccca agaggacagc tatccactag aggggttcaa attgcttcaa    1140

atgagaacat ggaaacaatg gactccaaca ctcttgaacc gagaagtaga tattgggcta    1200

taagaaccag aagcggagga aacaccaacc aacagagggc atctgcggga cagatcagcg    1260

ttcaacccac tttctcggta cagagaaatc ttcccttcga aagagcgacc attatggcag    1320

catttacagg aaatactgag ggtagaacgt ctgacatgag gactgaaatc ataagaatga    1380

tggaaagtac cagaccagaa gatgtgtcat tccaggggcg gggagtcttc gagctctcgg    1440

acgaaaaggc aacgaacccg atcgtgcctt cctttgacat gaataatgaa ggatcttatt    1500

tcttcggaga caatgcagag gagtatgaca attgaagaaa aaataccctt gtttctact     1559

<210>6

<211>1450

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>6

agcaaaagca ggagtaaaaa tgaacccaaa tcagaagata atagcaattg gctctgtttc    60

tctaaccatt gcgataatat gttttctcat gcagattgcc atcttaacaa cgactatgac    120

actacacttc aggcagactg aatgcagcaa cccatcgaat aatcaagtgg tgccatgtga    180

acctataata atagagagga acacagtgca tttgaatagt actaccatag agaaggaaat    240

ttgtcctaaa gtggcagaat acaagaattg gtcaaaacca caatgccaaa ttacagggtt    300

cgctcctttc tcaaaggaca actcaattag gctttctgca ggtggagata tctgggtgac    360

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aaccaccctg aaaaacaagc actcaaatgg cactacacat gatagaattc ctcacagaac    480

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tgataaaaat gctactgcta gtatcattta tgatgggatg cttgttgaca gtattggttc    660

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tagggtcatt aatggttgga ccatggctaa ttccaagtca cagacaaata gacaagtcat    1200

agttgacagt gacaactggt ctgggtattc tggtatcttc tctgttgaag gcaaaaactg    1260

catcaacagg tgtttttatg tggagttgat aagaggaaga ccacaggaga ccagagtgtg    1320

gtggacttca aatagcatca ttgtattctg tggaacctca ggtacctatg gaacaggctc    1380

atggcctgat ggagcgaata tcaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttaaaaaa    1440

aaactccttg                                                           1450

<210>7

<211>1027

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>7

agcaaaagca ggtagatgtt taaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct    60

ctctatcatt ccaccaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagacttg aggatgtttt    120

tgcagggaag aacacagatc ttgaggctct catggaatgg ataaagacaa gaccaatcct    180

gtcacctctg actaagggga ttttagggtt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg    240

aggactgcag cgtagacggt tcgtccaaaa cgccctaaat gggaatggag acccaaacaa    300

catggacagg gcagttaaat tatacaagaa gctgaagagg gaaatgacat ttcatggagc    360

aaaggaagtt gcactcagtt actcaactgg tgcgcttgcc agctgcatgg gtctcatata    420

caacaggatg ggaacagtga ccgcagaagg ggctcttggc ctagtatgtg ccacttgtga    480

gcagattgct gacgcccaac ataggtccca caggcagatg gcgactacta ccaacccact    540

aattaggcat gagaatagaa tggtactagc cagcactacg gctaaggcta tggagcagat    600

ggctggatca agtgaacagg cagcagaagc catggaagtc gcaagtcagg ctaggcaaat    660

ggtgcaggct atgagaacag tcgggactca tcctagctcc agtacaggtc taaaagatga    720

ccttattgaa aatttgcagg cttaccagaa acggatggga gtgcaactgc agcgattcaa    780

gtgatcctct cgttgttgca gcaaacgtta ttgggatatt gcacttgata ttgtggattc    840

ttgatcgtct tttcttcaaa tgcatttatc gtcgctttaa atacggtttg aaaggagggc    900

cttctacgga aggagtgcct gagtctatga gggaagaata tcggcaggaa cagcagaatg    960

ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagagct gaagtaaaaa actaccttgt    1020

ttctact                                                              1027

<210>8

<211>883

<212>DNA

<213>Avian Influenza virus

<400>8

gcagggtgac aaaaacataa tggattccaa cactgtgtca agcttccagg tagactgctt    60

cctttggcat gtccgcaaac ggtttgcaga ccaagaactg ggtgatgccc cattcctaga    120

ccggcttcgc cgggatcaga agtccctgag aggaagaagc agcactcttg gtctggacat    180

aagaactgcc actcgtgaag ggaagcatat agtggagcgg attttggagg aagagtcaga    240

tgaagcattc aaaatgacta ttgcttcagt gccagctcca cgctatctaa ctgacatgac    300

tcttgaagaa atgtcgagag attggttaat gctcattccc aaacagaaag tgacagggtc    360

cctttgcatt agaatggacc aagcaatagt ggacaaaacc atcacattga aagcaaattt    420

cagtgtgatt ttcaatcgac tggaagccct aatactactt agagctttta cagaagaagg    480

agcaatagtg ggcgaaatct caccattacc ttctcttcca ggacatactg atgaggatgt    540

caaaaatgca attggggtcc tcatcggagg atttgaatgg aatgataaca cagttcgagt    600

ctctgaaact ctacagagat tcgcttggag aagcagcaat gaggatggga gacctccact    660

ctctccaaag tagaaacggg aaatggagag aacagttaag ccagaagttc gaagaaataa    720

gatggttgat tgaagaagta cgacatagat taaagattac agagaatagc tttgaacaaa    780

taacatttat gcaagcctta caactattgc ttgaagtgga gcaagagata agaactttct    840

cgtttcagct tatttaatga taaaaaacac ccttgtttct act                      883

Claims (5)

1.一株鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其保藏编号为：CCTCC NO：V200812。

2.如权利要求1所述的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其特征在于：在鸡胚中高滴度增殖，血凝素效价稳定在2¹⁰；其血凝素蛋白(HA)抗原谱广；对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)为10^-5.75/0.2ml。

3.分离和纯化权利要求1所述鸡源H9N2禽流感病毒毒株的方法，包括如下步骤：

病毒的分离及鉴定方法如下：

取发病鸡的内脏器官加入灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心10分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体；加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心10分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时；每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液；

通过血凝试验检测尿囊液的HA效价，对于HA效价大于4者，制备4单位病毒，用标准的H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒阳性血清进行HI试验，鉴定病毒为H9亚型禽流感病毒鉴定病毒为H9亚型AIV与NDV混合感染；

该病毒的纯化方法如下：

ND阳性血清中和法初步纯化

使用ND阳性血清去除上述混合感染了两种病毒的鸡胚尿囊液中的NDV：将上述含有混合毒的尿囊液与等体积的ND无菌阳性血清混合，37℃作用1小时，然后接种11日龄的SPF鸡胚；收获24-96小时内的鸡胚尿囊液，重复上述的中和步骤，鸡胚传代1次；收获的含毒尿囊液用于下步的纯化；

有限稀释法进一步纯化

经中和法纯化得到的鸡胚尿囊液做10^-4-10^-9倍的倍比稀释，取各稀释度的尿囊液分别接种11日龄的SPF鸡胚尿囊腔；收获的病毒通过HA和HI实验检测是否含有H9亚型AIV；

取稀释倍数最低的含毒尿囊液同上法连续传代2次进行纯化；最终收获的含毒尿囊液再次通过H5和H9亚型AIV阳性血清以及新城疫病毒(NDV)阳性血清进行HI试验，鉴定纯化效果，即可纯化毒株。

4.如权利要求1所述的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其用作H9N2亚型禽流感疫苗株。

5.如权利要求1所述的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，其用作H9N2亚型AIV血凝和血凝抑制实验(HA-HI)用抗原。

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