CN102634488A - H9n2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法，按如下步骤进行：a.将H9N2亚型禽流感病毒株用生理盐水作10倍连续稀释至10-8，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后置于37℃继续孵育，每日照蛋；b.逐个收获接种72~120h死亡鸡胚及120h活胚的尿囊液，分别测定每个鸡胚尿囊液的HA价，并以最高稀释度病毒感染的一枚鸡胚中的尿囊液作为传代接种物；c.依次重复a、b步骤两次，重复过程中a步骤的H9N2亚型禽流感病毒株为b步骤所产生的传代接种物；d.将最后一次b步骤所产生的传代接种物用生理盐水作10倍稀释，10倍稀释液接种于10枚10～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后继续孵育，每日照蛋，收获接种72～120h死亡鸡胚尿囊液，分装安瓿，-80℃温度保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法。
背景技术
禽流感（Avian Influenza，AI）又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征。流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）根据对禽的致病性大小可以分为非致病性、低致病性（Low Pathogenic Avian Influenza, LPAI）和高致病性（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）三种。动物感染禽流感病毒后症状不一，感染非致病性禽流感没有明显症状；感染低致病性禽流感可有轻度呼吸道症状，病禽出现零星死亡；感染高致病性禽流感最严重，被感染鸡群的死亡率通常是百分之百。
H9N2亚型禽流感（H9 subtype avian influenza virus）仍是我国当前低致病性禽流感流行的主型 ，1995年唐秀英等从四川省某发病鸡群中分离到一株H9N2毒株，从西昌发病鸡群中分离到了2株H9N2毒株。此后又从我国部分地区的发病鸡群、鸭群中，分离到16株H9N2病毒。近几年，对我国部分省市商品鸡场进行的禽流感血清学调查中发现，221个禽流感阳性鸡群中H9亚型阳性鸡群占阳性群总数的93.67％，H5亚型阳性鸡群、H4亚型阳性鸡群、H14亚型阳性鸡群占阳性鸡群总数的6.33％，证实了H9N2亚型禽流感在我国广泛存在。
以前观念认为禽流感和人是有种属屏障的，但近几年的禽流感感染人事件表明，这种屏障正在减弱或消失，不仅在鸡、鸭、鹅、候鸟等禽类上发生，而且也已经波及到老虎、海狮、人等哺乳类动物，爆发的规模及危害也在不断加大。1997年香港Peiris等从类似流感症状的病人分离到H9亚型流感病毒一例，2003年又有两例病人分离到H9亚型病毒。刘红旗等研究发现H9N2亚型在中国大陆形成了一个稳定的亚系，这不仅对养禽业有巨大危害，而且严重威胁人类健康。并且，新的研究表明，H9N2亚型部分流行株的致病力明显变异，尤其对肉仔鸡，死亡率可达到30％以上；对产蛋高峰期的蛋鸡，其产蛋下降幅度大，恢复困难。
目前，人们已经广泛开展对H9N2亚型禽流感的研究，而实验室的质量控制一直都是人们所关注的，针对内部质量控制，现有实验室基本上都使用自己制备的H9N2亚型禽流感样品，不仅样品制备过程费时费力，而且很难保持活菌的稳定，难以实现不同实验室结果的比对。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 将H9N2亚型禽流感病毒株用生理盐水作10倍连续稀释至10-8，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 ml，接种后置于37℃继续孵育，每日照蛋；
b. 逐个收获接种72~120h死亡鸡胚及120 h活胚的尿囊液，分别测定每个鸡胚尿囊液的HA价，并以最高稀释度病毒感染的一枚鸡胚中的尿囊液作为传代接种物；
c. 依次重复a、b步骤两次，重复过程中a步骤的H9N2亚型禽流感病毒株为b步骤所产生的传代接种物；
d. 将最后一次b步骤所产生的传代接种物用生理盐水作10倍稀释，将10倍稀释液接种于10枚10～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后继续孵育，每日照蛋，收获接种72～120 h死亡鸡胚尿囊液，分装安瓿，-80℃温度保存。
本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的H9N2亚型禽流感病毒标准样品稳定性高、均匀性好，可以为H9N2亚型禽流感病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
附图说明
图1是本发明实施例标准样品HA、NA基因RT-PCR扩增电泳图。
图2是本发明实施例标准样品HA基因核苷酸序列系统发育树。
图3是本发明实施例标准样品NA基因核苷酸序列系统发育树。
具体实施方式
a. 取购于国家兽医微生物菌种保藏中心的H9N2亚型禽流感病毒株，采用微量法进行初步鉴定，结果红细胞凝集试验（HA试验）的HA效价为28，红细胞凝集抑制试验（HI）的HI效价为25。将该毒株用生理盐水作10倍连续稀释至10-8，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 ml，接种后置于37℃继续孵育，每日照蛋；
b. 逐个收获接种毒株后72~120h死亡鸡胚及接种毒株后120 h活胚的尿囊液，分别测定每个鸡胚尿囊液的HA价，结果病毒感染鸡胚毒株的最高稀释度为10-7，以最高稀释度（10-7）病毒感染的一枚鸡胚中的尿囊液作为传代接种物；
c. 依次重复a、b步骤两次，重复过程中a步骤的H9N2亚型禽流感病毒株为b步骤所产生的传代接种物；
d. 将最后一次b步骤所产生的传代接种物用生理盐水作10倍稀释，取10倍稀释液接种于10枚10～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后继续孵育，每日照蛋，收获接种72～120 h死亡鸡胚尿囊液，分装安瓿，-80℃温度保存，即为H9N2亚型禽流感病毒标准样品。
标准样品的检验：
1．荧光RT-PCR鉴定
1.1 RNA的提取：离心管中加入Trizol裂解液600μL，本发明实施例标准样品200μL，同时设阳性对照、阴性对照。加入氯仿200μL震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500 μL加入到500μL异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；轻轻弃去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，加入75%的酒精600μL，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；轻轻弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，用微量加样器尽量吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5 μL的DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存备用。
1.2 配置反应液：反应体系25μL，采用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，包含反应液14μL，反转录酶0.5μL及Taq DNA聚合酶0.5μL，1.1中的RNA液10μL。
1.3 荧光RT-PCR程序设定：50℃ 30min，93℃ 3min，一个循环；93℃ 5s，60℃ 40s（收集荧光信号），40个循环。
结果：H9亚型检测阳性，ND及其它亚型AIV未检测到。表明所检测的标准样品比较纯。
2．HA、NA基因的RT-PCR扩增、测序及分析
2.1 RNA提取步骤同1.1。
2.2 反转录体系
5×M-MLV Buffer 4μL，dNTPs（各2.5mmol/L） 2μL，M-MLV（5U/μL）1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，反转录引物（20pmol/μL）1μL，2.1中的RNA液11.5μL，总反应体系为20μL，其中的反转录引物为5’AGCAAAAGCAGG3’（人工合成）。
2.3 反转录条件
42℃水浴1h-2h。
2.4 PCR扩增反应体系
10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPs（各2.5mmol/L）0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）1μL，H9HA、H9NA的上游引物、下游引物（20pmol/μL）各1μL，2.3的反转录产物0.5μL，用无菌水补充至25μL。
H9HA的上、下游引物分别是：
5’AGCAAAAGCAGGGGAATTTCAC3’；
5’AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC3’；
H9NA的上、下游引物分别是：
5’AGCAAAAGCAGGAGTAAAAATG3’；
5’CAAGGAGTTTTTTTCTAAAATTGC3’；
所用引物均为人工合成。
2.5 PCR扩增条件：
94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存。
2.6 电泳图
电泳结果如图1所示。结果显示有明显条带产生，且与预计大小相符。其中1：DL2000 Marker；2：NA基因PCR产物；3：HA基因PCR产物；4：阴性对照。
2.7 测序
由大连宝生物公司，通过ABI 3730进行测序。
HA基因全长1742bp，测序结果如下：
AGCAAAAGCAGGGGAATTTCACAACCACTCAAGATGGAAGTAGTATCACTAATAACTGTACTACTAGTAGTAACAGTAAGCAATGCAGATAAAATCTGCATCGGCTACCAATCAACAAACTCCACAGAAACTGTAGACACACTAACGGAAAACAATGTTCCTGTGACAGATGCCAAAGAATTACTCCACACAGAGCACAATGGGATGCTGTGTGCAACAGACCTGGGACATCCTCTCATTCTAGACACCTGTACCATTGAAGGACTGATCTATGACAACCCTTCTTGTGATCTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGTTGAAAGACCATCGGCTGTTAATGGAATGTGTTACCCCGGGAATGTAGAAAACCTAGAGGAACTAAGGTCACTTTTTAGTTCTGCTAGTTCCTACCAAAGAATCCAGATCTTTCCAGACACAATCTGGAATGTGTCCTACAGTGGAACAAGCAACGCATGTTCAGATTCATTCTACAGGAGCATGAGATGGTTGACTCAAAAGAACAACGCTTACCCTATTCAAGACGCCCAATACACAAATAATAGAGGAAAGAGCATTCTTTTCATGTGGGGCATAAATCACCCGCCCACCGATACTGTACAGACAAATCTGTACACAAGGACTGACACAACAACAAGTGTGGCAACAGAAGATATAAATAGGACCTTCAAACCATTGATAGGGCCAAGGCCCCTTGTTAATGGTCAGCAGGGGAGAATTGATTATTATTGGTCAATATTGAAACCAGGTCAGACATTGAGAGTAAGGTCCAATGGGAATCTAATCGCTCCATGGTATGGACACATTCTTTCAGGAGAGAGCCATGGAAGAATCCTGAAGACTGATTTAAAAAGTGGTAACTGTGTAGTGCAATGTCAGACAGAAAGAGGTGGCTTAAATACTACATTGCCATTCCACAATGTCAGTAAATATGCATTTGGAAACTGCCCAAAATATGTTGGAGTAAAGAGTCTCAAACTGGCAGTTGGTCTGAGGAATGTGCCTGCTAGATC
AAGTAGAGGACTATTTGGGGCCATAGCTGGATTCATAGAGGGAGGTTGGTCAGGGCTAGTCGCTGGTTGGTATGGGTTCCAGCATTCAAATGATCAAGGGGTTGGTATGGCTGCAGATAGAGACTCAACTCAAAAGGCAATTGACAAAATAACATCAAAAGTGAATAATATAGTCGATAAAATGAACAAACAATATGAAATTATTGATCATGAATTCAGTGAGGTTGAAGCTAGACTCAACATGATCAATAATAAGATTGATGACCAAATTCAAGACATATGGGCATATAACGCAGAATTGCTAGTGCTGCTTGAAAACCAGAAAACACTCGATGAGCATGATGCGAATGTAAACAATCTATATAACAAAGTGAAGAGGGCACTGGGTTCCAATGCAATGGAAGATGGGAAAGGATGTTTCGAGCTATACCATAAATGTGATGATCAGTGCATGGAGACAATTCGGAACGGGACCTATAACAGGAGAAAGTACAAAGAGGAATCAAGACTAGAGAGACAGAAAATAGAAGGGGTCAAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACAAAATCCTCACAATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTGTGATTGCAATGGGGTTTGCTGCCTTCCTTTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCTTGCAGATGCAACATTTGTATATAATTGGCAAAAACACCCTTGTTTCTACT
NA基因全长1458bp，测序结果如下：AGCAAAAGCAGGAGTGAAAATGAATCCAAATCAGAAGATAATAGCAATTGGCTCTGTTTCTCTAACTATTACGATAATATGTTTCCTCATGCAGATTGCCATCTTAACAACGACTATGACACTACATTTCAAGCAGAATGAATGCAGCAACCCATCGAATAATCAAGTAGTGCCATGTGAACCAATCATAATAGAGAGGAACATAGTGCATTTGAATAGTACTACCATAGAGAAGGAAATTTGTCCTAAAGTGGCAGAATACAAGAATTGGTCAAAACCACAATGTCAAATTACAGGGTTCGCTCCTTTCTCAAAGGACAACTCAATTAGGCTTTCCGCAGGTGGGGATATCTGGGTGACAAGAGAACCTTATGTGTCGTGCGGTCTTGGTAAATGTTATCAATTTGCACTTGGGCAGGGAACCACTTTAAAAAACAAACACTCAAATGGCACTACACATGACAGAATTCCTCATAGAACCCTTTTAATGAATGAGTTAGGTGTCCCGTTTCATTTGGGAACCAAACAAGTGTGCATAGCATGGTCCAGCTCAAGCTGCCATGATGGGAAAGCATGGTTACATATTTGTGTCACTGGGGATGATAAAAATGCGACTGCTAGTATCATTTATGATGGGATGCTTGTTGACAGTATTGGTTCATGGTCCAAAAACATCCTCAGAACTCAGGAGTCAGAATGCGTTTGCATCAATGGAACTTGTACAGTAGTAATGACTGATGGAAGTGCATCAGGAAAGGCTGACACTAGAATACTATTCATAAGAGAGGGGAAAATTCTGCATATTAGCCCATTGTCAGGAAGTGCTCAGCATGTGGAGGAATGCTCCTGTTACCCCCGGTATCCAGAAGTTAGGTGTGTTTGCAGAGACAATTGGAAGGGATCCAATAGGCCCGTTCTATATATAAATATGGCAGATTATAGTATTGAGTCCAGTTATGTGTGCTCAGGACTTGTTGGCGATACACCAAGAAATGATGATAGCTCCAGCAGCAGCAACTGCAGGGATCCTAATAACGAGAGAGGGGCCCCAGGAGTGAAAGGGTGGGCCTTTGACGATGGAAATGATATTTGGATGGGACGGACAATCAAAGATGATTCACGCTCAGGTTATGAGACTTTCAGGGTCGTTGGTGGTTGGACCACGGCTAATTCCAAGTCACAGATAAATAGACAAGTCATAGTTGACAGTGACAACTGGTCTGGGTATTCTGGTATCTTCTCTGTTGAAGGCAAAAACTGCATCAACAGGTGTTTTTATGTGGAGTTGATAAGAGGAAGACCACAGGAGACTAAGGTGTGGTGGACTTCAAATAGCATCATTGTATTTTGTGGAACCTCAGGTACCTATGGAACAGGCTCATGGCCTGATGGGGCGAATATCAACTTCATGCCTATATAAGCTTTCGCAATTTTAGAAAAAAACTCCTTGTTTCTACT
2.8 序列分析
该毒株为H9HA基因全序列，全长1742bp，编码560aa，包含55个强碱性氨基酸，60个强酸性氨基酸，177个疏水性氨基酸，185个极性氨基酸。分子量大小为62.642KD。将H9HA基因序列提交NCBI数据库进行核苷酸序列相似性检索，结果表明该毒株序列与欧亚谱系序列核苷酸相似性最高，见表1。
。
表1 H9 HA基因核苷酸序列blast结果
经Philip软件绘制进化树如图2所示，结果表明该毒株与A/chicken/Yokohama/aq45/2002（H9N2）的核苷酸相似性最高，位于同一分支。
该毒株为H9NA基因，序列全长1458bp，编码466aa,其中包括44个强碱性氨基酸，44个强酸性氨基酸，137个疏水性氨基酸，162个极性氨基酸。分子量大小为51.476KD。将H9NA基因测得序列提交NCBI数据库进行核苷酸序列相似性检索，结果表明，该毒株序列与欧亚谱系序列核苷酸相似性最高，见表2。
| NA基因注册号 | 毒株名称 | 核苷酸相似性 |
| EU429707.1 | A/duck/Eastern China/48/2001(H9N2) | 98% |
| DQ000239.1 | A/pheasant/GuanDong/GZ1/03(H9N2) | 98% |
| EU429699.1 | A/duck/Eastern China/66/2003(H9N2) | 98% |
| AB256708.1 | A/chicken/Yokohama/aq45/2002(H9N2) | 99% |
| DQ064418.1 | A/chicken/Guangxi/9/99(H9N2) | 98% |
| DQ064414.1 | A/chicken/Guangdong/5/97(H9N2) | 98% |
| CY005520.1 | A/chicken/Nanchang/4-301/2001(H9N2) | 98% |
| CY005526.1 | A/duck/Nanchang/4-361/2001(H9N2) | 98% |
| EU516305.1 | A/swine/Shandong/w4/2003(H9N2) | 98% |
| DQ874395.1 | A/chicken/Guangdong/SS/94(H9N2) | 98% |
表2 H9 NA基因核苷酸序列blast结果
经Philip软件绘制进化树如图3所示，结果表明本毒株与A/chicken/Yokohama/aq45/2002(H9N2)的核苷酸相似性最高，位于同一分支。
综上所述，本发明实施例的HA和NA基因的核苷酸序列均与A/chicken/Yokohama/aq45/2002(H9N2)的相似性最高，达99%，系统发育树也表明二者的亲缘关系也最近，由同一毒株衍化而来。
3．鸡胚半数感染量（EID50）和鸡胚半数致死量（ELD50）的测定
将过滤除菌后的本发明实施例标准样品用生理盐水10倍稀释至10-8，每个稀释度分别接种10d非免疫鸡胚8枚，0.1mL/枚，35℃培养，其间每隔6h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚，48h后检测HA效价，按Reed-Muench两氏法计算EID50 和ELD50。检测结果为EID50和ELD50为108.5/mL。
4．均匀性
随机选取本发明实施例的标准样品60份，分成A、B两组，即2×15份样品A和样品B，按照“禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒使用说明书”中样品测试的要求，采用荧光PCR方法，在重复条件下测试2×15份样品A和2×15份样品B。结果数据用单因素方差分析（ANOV）进行统计处理（表3），统计步骤及结果如表4、表5：
4.1方差分析公式如表3
表3
| 变异来源 | 离均差平方和, SS | 自由度, ν | 均方, MS | F值 |
| 总变异 | ∑X2-C | N-1 | ||
| 样品间(组间)变异 |  |
k-1 | SS样品间/ν样品间 | MS样品间/MS分析 |
| 分析(组内)变异 | SS总-SS样品间 | N-k | SS分析/ν分析 |
4.2样品A均匀性试验结果如表4
表4
4.3 样品B均匀性试验方差分析结果如表5
表5
按α=0.05，ν 1=14，ν 2=15 查附表，F临界值= 2.35>1.05，表明样品间没有显著性差异。
5．稳定性
采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度（-20℃）下的稳定性试验，随机取本发明实施例标准样品24份，分成A、B两组，每个月同一天A、B两组各检测1份，共计12个月，结果见表6；另一种是在较高的温度（模拟样品的运输条件4℃）下的稳定性试验，随机取本发明实施例标准样品14份，分成C、D两组，每1天C、D两组各检测1份，共计7天，测试结果见表7。
表6
表7
6．定值
随机选本发明实施例的标准样品10份，用GB/T19438.4-2004中 H9亚型禽流病毒荧光RT-PCR检测方法进行定值试验，结果完全一致，均为H9亚型禽流感病毒核酸阳性。
本发明实施例标准样品经中国检验检疫科学研究院、山东检验检疫局、珠海检验检疫局、山西检验检疫局、大连疾病预防控制中心协作试验，定值结果统计见表8。
表8
应用GB/T19438.2-2004规定的方法，对发明实施例标准样品的定值实验，结果表明均为H9亚型禽流感病毒核酸阳性。
Claims (1)
1.一种H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 将H9N2亚型禽流感病毒株用生理盐水作10倍连续稀释至10-8，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 ml，接种后置于37℃继续孵育，每日照蛋；
b. 逐个收获接种72~120h死亡鸡胚及120 h活胚的尿囊液，分别测定每个鸡胚尿囊液的HA价，并以最高稀释度病毒感染的一枚鸡胚中的尿囊液作为传代接种物；
c. 依次重复a、b步骤两次，重复过程中a步骤的H9N2亚型禽流感病毒株为b步骤所产生的传代接种物；
d. 将最后一次b步骤所产生的传代接种物用生理盐水作10倍稀释，将10倍稀释液接种于10枚10～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后继续孵育，每日照蛋，收获接种72～120 h死亡鸡胚尿囊液，分装安瓿，-80℃温度保存。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104046595A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-17 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法 |
| CN104046596A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-17 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊膜分离方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005113756A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Method |
| CN101508978A (zh) * | 2009-01-04 | 2009-08-19 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 |
-
2012
- 2012-03-27 CN CN2012100827551A patent/CN102634488A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005113756A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Method |
| CN101508978A (zh) * | 2009-01-04 | 2009-08-19 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李呈军: "中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究", 《万方数据知识服务平台》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104046595A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-17 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法 |
| CN104046596A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-17 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊膜分离方法 |
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| Goekjian et al. | Avian influenza viruses and avian paramyxoviruses in wintering and breeding waterfowl populations in North Carolina, USA | |
| Morales Jr et al. | Biologic characterization of H4, H6, and H9 type low pathogenicity avian influenza viruses from wild birds in chickens and turkeys | |
| Tumpey et al. | Evaluation of a high-pathogenicity H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat | |
| Reid et al. | The detection of a low pathogenicity avian influenza virus subtype H9 infection in a turkey breeder flock in the United Kingdom | |
| Ferreri et al. | Improved detection of influenza A virus from blue‐winged teals by sequencing directly from swab material | |
| Akhter et al. | Molecular and serological detection of avian influenza H9N2 virus in asymptomatic commercial layers in Faisalabad District, Punjab | |
| Liu et al. | Genetic conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China | |
| Abolnik et al. | Characterisation of a highly pathogenic influenza A virus of subtype H5N2 isolated from ostriches in South Africa in 2004 | |
| Raj et al. | Determining the protective efficacy of Toll-like receptor ligands to minimize H9N2 avian influenza virus transmission in chickens | |
| Löndt et al. | Failure to infect pigs co-housed with ducks or chickens infected experimentally with A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) highly pathogenic avian influenza virus | |
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| Ladman et al. | Virulence of low pathogenicity H7N2 avian influenza viruses from the Delmarva peninsula for broiler and leghorn chickens and turkeys | |
| Alyas et al. | Isolation and characterization of avian influenza H9N2 viruses from different avian species in Pakistan 2016–17 | |
| Awad et al. | Incidence of avian influenza among commercial and native breeds in West Delta region. | |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120815 |