CN103013929B - 禽流感病毒及其检测试剂盒和疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及分离的禽流感病毒新毒株，本发明公开了一种H9N2禽流感病毒。本发明还公开了一种检测H9N2禽流感病毒的试剂盒，以及一种用于预防的H9N2禽流感病毒的疫苗，以及抗H9N2禽流感病毒的抗体。通过本发明的试剂盒，可以迅速的检测或者排除是否是由本发明的这种基因型的H9N2禽流感病毒所致的禽流感，从而尽快的控制禽流感疫情。同时，接种本发明的疫苗，可以预防本发明的这种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。并且本发明还可以为禽流感病毒监测系统提供生物信息。

Description

禽流感病毒及其检测试剂盒和疫苗

本申请是申请号为“201010192680.3”、申请日为“2010年06月04日”、发明名称为“禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗”的分案申请。

技术领域：

本发明属于生物技术领域,涉及三种H9N2禽流感病毒的新毒株及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗。

背景技术：

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病。禽类感染禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)后,症状可表现为非显性感染、亚临诊感染,或轻度呼吸道疾病、产蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多种形式。根据AIV对易感鸡致病性的差异,可将AIV分为高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽类所导致的禽流感对养禽业具有毁灭性的打击,故被国际兽疫局规定为A类疾病;而一些低致病性AIV，如H9AIV的感染虽然对感染禽的致死率低,但可引起产蛋量的减少和淘汰率的上升,并造成免疫抑制,引起其他疫病的发生或混合感染，对养禽业造成的经济损失也相当可观。因此,AI一直是威胁世界养禽业的主要疾病之一，世界各国都十分重视对AIV的研究工作。已有研究表明来自于禽类的H9N2禽流感病毒能偶尔从禽类传染给哺乳动物，包括人和猪。Ck/Bei-like和G1-like H9N2禽流感病毒在1990底首次从人和猪中分离到。2003年分离到的人H9N2禽流感病毒是一个新的重组体，很可能来源于当地的活禽市场。这种跨种间传播表明目前的H9N2禽流感病毒对人仍有潜在的感染性。AIV存在着广泛的抗原漂移和抗原转变现象,其抗原变异频率很高。因此测定AIV的全基因序列，对于研究禽流感病毒的检测、分布、流行规律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意义。本研究分离鉴定了2002-2008年上海地区活禽市场的H9N2亚型禽流感病毒，经全基因序列测定分为三种基因型，对这三种基因型毒株的8个基因片段进行关键位点的分析以及基因进化关系分析，表明这三种基因型与目前报道的基因型存在差异，为H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三种新的基因型，分别命名为Y1,Y2,Y3。

发明内容：

本发明提供了三种H9N2禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗，所述的这三种H9N2禽流感病毒及用于检测、预防禽流感病毒的试剂盒和疫苗要解决现有技术中无法确认和预防新的禽流感病毒从而导致新的禽流感疫情在禽类或者人类传播的技术问题。

本发明提供了一种分离的禽流感病毒（Y1），其基因组由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3117。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1:5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2:5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2:5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2:5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2:5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的分离的禽流感病毒。

本发明还提供了一种用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在109.6-109.8ELD50，HA价在1：256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b），一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后,再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2%－5%之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗上述的一种分离的禽流感病毒（Y1）。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒（Y2），其基因组由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3118。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1:5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2:5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2:5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2:5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2:5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的禽流感病毒。

本发明还提供了上述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1：256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b），一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后,再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2%－5%之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗上述的一种分离的禽流感病毒（Y2）。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒（Y3），其基因组由SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的RNA片段组成。

本发明还提供了一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3119。

本发明还提供了一种用于检测上述的分离的禽流感病毒的试剂盒，含有上述的分离的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反转录反应液和含有引物的PCR反应液，所述的PCR反应液中的引物为：

HA基因上游引物P1:5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’；

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’，

下游引物P2:5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’；

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’；

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’，

下游引物P2:5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’；

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’，

下游引物P2:5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’；

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’，

下游引物P2:5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’；

PB1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’，

下游引物P2:5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’；

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’，

下游引物P2:5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

本发明还提供了一种用于预防上述的禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述的禽流感病毒。

本发明还提供了上述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将上述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1：256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b），一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)，一个制备疫苗水相的步骤；

e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后,再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。

进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2%－5%之间，经充分溶解混合即为水相。

本发明还提供了一种抗体，抗权利要求1所述的一种分离的禽流感病毒（Y3）。

本发明借助MEGA3.1分析软件,对这三种基因型H9N2禽流感病毒的8个基因片段分别进行了系统发育树的绘制和分析。这三种基因型毒株属于Ck/Bei系，均为四重重组体，并且这三种基因型与目前报道的Ck/Bei系中的基因型不同，因此为RT-PCR检测这三种新基因型8个基因片段提供了模板序列。通过本发明的试剂盒，可以迅速的检测或者排除是否是新的禽流感由本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒所致，从而尽快的控制禽流感疫情。同时，接种本发明的疫苗，可以预防本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。使用本发明的抗体，可以治疗本发明的三种基因型的H9N2禽流感病毒的感染。

本发明对分离的三种H9N2禽流感病毒进行了保藏。第一种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研究所），保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCC NO:3117。第二种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研究所），保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCC NO:3118。第三种分离的H9N2禽流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院（中科院微生物研究所），保藏日期为2009年6月12号，保藏号为CGMCCNO:3119。

本发明还可以对禽流感病毒监测系统提供生物信息。对这三种基因型病毒关键位点的分析能提供这三种基因型是否有向人类感染的威胁以及8个片段重排的规律，尤其是有无H5片段的存在等，提供是否有向高致病性禽流感转变的可能性，并为我国H9N2禽流感病毒种子库提供储备，并为病毒的追踪溯源提供序列信息。

附图说明：

图1是H9N2禽流感病毒中HA基因片段的进化关系图。

图2是H9N2禽流感病毒中NA基因片段的进化关系图。

图3是H9N2禽流感病毒中PB2基因片段的进化关系图。

图4是H9N2禽流感病毒中PB1基因片段的进化关系图。

图5是H9N2禽流感病毒中PA基因片段的进化关系图。

图6是H9N2禽流感病毒中M基因片段的进化关系图。

图7是H9N2禽流感病毒中NP基因片段的进化关系图。

图8是H9N2禽流感病毒中NS基因片段的进化关系图。

具体实施方式：

实施例1病毒的获得

于2002年至2008年从上海地区的活禽批发市场获得商品代三黄鸡，采集活禽样品包括气管或泄殖腔拭子，将采集样品放在含有抗菌素的pH值7.0~7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内。将鉴定为阳性样品的棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子，样品液经1000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。取处理好的样品以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9日龄~11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于35℃~37℃孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，通过下面的实施例对从鸡胚尿囊液中的病毒进行基因测序和鉴定，是三种新的甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，对此进行了保藏，保藏号分别为：CGMCC NO：3117（Ck/SH/Y1/06）、CGMCC NO：3118（Ck/SH/Y1/07）、CGMCC NO：3119（Ck/SH/Y1/08）。

实施例2三种基因型H9N2禽流感病毒的全基因测序

2.1于2002年至2008年从上海地区的活禽批发市场获得商品代三黄鸡，共分离、鉴定了三种基因型H9N2禽流感病毒：A/Chicken/Shanghai/Y1/06(简写为Ck/SH/Y1/06，基因型Y1)；A/Chicken/Shanghai/Y1/07(简写为Ck/SH/Y1/07,基因型Y2)；

A/Chicken/Shanghai/Y1/08(简写为Ck/SH/Y1/08,基因型Y3)。病毒鉴定用的H9亚型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所。设计用于扩增H9亚型AIV所有8个基因片段的特异引物由宝生物(大连)工程公司合成。

HA基因上游引物P1:5’-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3’；

下游引物P2:5’-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3’。

M基因上游引物P1：5’-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3’;

下游引物P2:5’-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3’。

NA基因上游引物P1：5’-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3’;

下游引物P2:5’-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3’。

NP基因上游引物P1：5’-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3’;

下游引物P2:5’-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3’。

NS基因上游引物P1：5’-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3’;

下游引物P2:5’-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3’。

PA基因上游引物P1：5’-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3’;

下游引物P2:5’-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3’。

PB 1基因上游引物P1：5’-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3’;

下游引物P2:5’-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3’。

PB2基因上游引物P1：5’-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3’;

下游引物P2:5’-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3’。

2.2将阳性样本接种SPF鸡胚，取感染鸡胚尿囊液用TRIzol抽提试剂进行RNA的抽提。

2.3 8个基因片段RT-PCR扩增如下：采用20μL的cDNA合成体系置于0.2mL反应管中,取溶于DEPC处理水中的AIV RNA样品9μL,分别加入上游引物3μL,5倍RT-PCR缓冲液4μL,dNTPs(10mmol/L)2.5μL,RNA酶抑制剂0.5μL,AMV反转录酶2μL,用无RNase的超纯水加至总体积为20μL,置于PCR仪中进行cDNA合成,以30℃10min,42℃60min,进入PCR扩增。

PCR反应体系100μL:在PCR反应管中分别加入cDNA10μL,上、下游引物各3μL(20pmol/μL),10×LA PCR Buffer10μL,dNTPs(2.5mmol/L)10μL,MgCl₂(25mmol/L)8μL,LA Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),灭菌超纯水加至100μL,置于PCR仪中进行PCR扩增。首先95℃预变性2min,然后进行以94℃30s,55℃60s（HA,PB1,M,NP这4个基因的退火温度为55℃,PB2,NS,PA,NA的退火温度为52℃）,72℃180s的PCR循环,进行40个循环后于72℃延伸10min。

2.48个基因片段的cDNA克隆、鉴定和测序：RT-PCR产物电泳经凝胶回收后，按pMD18-T载体说明书进行连接、转化，用EcoRI和HindIII进行双酶切鉴定；鉴定为阳性克隆后送英骏生物有限公司测序。

其具体实施步骤如下：

2.4.1RT-PCR产物电泳

取RT-PCR产物加10×loading buffer，在1%琼脂糖凝胶（含0.1ug/ml的溴化乙锭）中，以TAE缓冲液（0.04M Tris—acetate，1mMEDTA）电泳0.5hr，电泳结束后，在紫外线下观察。

2.4.2RT-PCR产物回收

1)将目的片段切下；

2)先冻融，再捣碎；

3)加500ul平衡酚混匀，置-20℃，60min；

4)取出后立即离心，5000g×5min；

5)小心地将水相转移至另一EP管中；

6)在原EP管内加200ulTE（PH8.0）,充分混匀。必要时可用玻棒再次捣碎，置-20℃，30min；

7)离心，500g×5min，将水相转移并合并至含有上次水相的EP管中；

8)加等体积酚、氯仿：异戊醇各抽提一次；

9)在转移出的水相中加1/10体积3mol乙酸钠（PH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置-20℃30min；

10)离心，12000g×15min。弃上清，70%乙醇洗涤一次，真空干燥；

11)沉淀用7ul TE缓冲液（PH8.0）溶解,-20℃保存备用；

上述操作也可通过相关公司生产的胶回收试剂盒进行回收。

2.4.3回收的产物与pMD18-T载体的连接

SolutionI：5ul;

pMD18-T Vector：0.5ul;

PCR Product:4.5ul;

4℃连接12h-24h。

2.4.4感受态细胞的制备

1）划平板，尽量形成单一菌落，使性质均一（一定要熟悉E.coli的颜色、大小、亮度，什么时候最好），37℃过夜，16h。选择分散、单个菌落，一般8h可见菌落，16h差不多；

2）挑取单个菌落，接种到3-5mlLB培养过夜（37℃振摇，200-300rpm）；

3）取1ml菌液到LB中，37℃，2-4h，200-300rpm振荡培养至OD₅₅₀=0.3-0.5，此时正好是E.coli对数生长期早期，生命力最好；

4）放入冰水中，停止增殖，保持该状态10-15min；

5）离心，弃上清，留沉淀于冰浴中（4℃，4000g×10min）；

6）0.1MCaCI₂（4℃预冷），体积多一些没关系，作用20-30min，时间可以长一些；

7）4℃，4000g×10min离心，去CaCI₂；

8）加CaCI₂，量只有上一次的1/5到1/10；

9）分装200ul于EP管中。

置4℃冰箱，12-24h即可用于转化。

2.4.5细菌的转化

1）无菌操作取一定量的感受态细胞（200ul）置冰浴；

2）加入需1.4.3制备的连接物10ul，轻轻手腕旋转或吹打以充分混匀；

3）取出置42℃热休克90S，不要摇动，立刻冰浴1-2min;

4）每管加预热的LB800ul,37℃振摇45min-1h,以复苏抗性；

5）稍离心一下，弃去部分上清，剩200ul左右全部涂板，带有Amp抗性的平板；待液体被吸收后，置37℃培养12-18hr；

6）观察见有数个单、小菌落，继续培养，挑选单菌落接种到含Amp的LB液体培养基中

2.4.6重组质粒的提取及酶切鉴定

1）从摇床中取出上述培养物，取1.5ml于EP管中，1，2000rpm，1min；

2）弃上清，加预冷的溶液I 100ul,用枪吹起菌体；

3）加新鲜配制溶液II200ul,通过手腕混匀；

4）加预冷溶液III150ul,倒转混匀，12000rpm，5min；

5）上清移于另一EP管中，加等体积酚/氯仿，混匀，12000rpm,5min；

6）上清移于另一EP管中，并加2倍体积冷无水乙醇-20℃沉淀一段时间，12000rpm,5min；

7）弃上清，加1ml70%乙醇洗涤沉淀，弃去，完全干燥沉淀，并用20ul TE（ph8.0，含20ug/mlRNase）重悬沉淀。用EcoRI和HindIII进行双酶切鉴定。发现阳性克隆的送英骏公司测序(具体见序列表)。

实施例3HA基因氨基酸序列分析

推导的氨基酸序列分析表明，三种基因型毒株均含有7个潜在的糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr,X为除Pro以外的任意氨基酸)，其中5个位于HA1部分(29aa～31aa、141aa～143aa、218aa～220aa、298aa～300aa、305aa～307aa)，2个位于HA2部分(492aa～494aa、551aa～553aa)。裂解位点序列分析发现，所有毒株均为RSSR↓GLF，对禽类为低致病力。构成受体结合位点的氨基酸(109aa、161aa、163aa、191aa、202aa、203aa)除198位氨基酸变化较大外,其它位点在所有毒株中都是相当保守的。此外本研究表明Ck/SH/Y1/06在HA基因226位点为Gln，证明为人类非易感性的H9亚型AIV，而其余2个毒株在该位点为Leu，表明有向人类感染的嗜性（如表1所示）。

表1HA基因几个关键位点的比较

Note:#Receptor-binding sites（受体结合位点）,their locations are（它们的具体位置）:a(109aa),b(161aa),c(163aa),d(191aa),e(198aa),f(202aa),g(203aa);*Potential glycoylation sites（潜在糖基化位点）,their locationsare（它们的具体位置）:1(29aa-31aa),2(141aa-143aa),3(218aa-220aa),4(298aa-300aa),5(305aa-307aa),6(492aa-494aa),7(551aa-553aa);Ck:chicken（鸡）;SH:Shanghai（上海）。

实施例4绘制系统发育树

借助MEGA3.1分析软件,对三种基因型毒株的8个基因片段分别进行了系统发育树的绘制和分析（如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7和图8所示）。分析结果表明这三种基因型毒株属于Ck/Bei系，均为四重重组体，这三种基因型不同于以往报道的Ck/Bei系中的H9N2禽流感病毒基因型，本研究中这三种基因型组成情况见表2，目前已报道的Ck/Bei系中的基因型组成情况见表3，本研究中这三种基因型其内源性基因中含有H5N1的片段（表2中的Gs/GD系为H5N1病毒）。

表2.2002-2008年上海地区鸡群中三种新基因型H9N2禽流感病毒的基因组成情况

Abbreviations（缩写）:Ck/Bei,Ck/Beijing/1/94-like（Ck/Beijing/1/94系）;Dk,duck（duck系）;G1,Qa/HK/G1/97-like（Qa/HK/G1/97系）;Gs/GD,Gs/GD-l ike（Gs/GD系）；Ck:chicken（chicken系）;SH:Shanghai.

表3.中国H9N2禽流感病毒Ck/Bei系的不同基因型的基因组成情况

Abbreviations（缩写）:?,unknown avian host or lineage;Aq,aquatic bird;Ck,chicken;Ck/Bei,Ck/Beijing/1/94-like;Dk,duck;G1,Qa/HK/G1/97-like;Gs/GD,Gs/GD-like;H5N1/01,H5N1/01-like;MP,minor poultry species,鹌鹑除外;Qa,quail.

实施例5三种基因型H9N2禽流感病毒8个基因片段RT-PCR诊断试剂盒

试剂盒的组成包括：病毒RNA抽提液、RT反转录反应液和PCR反应液。

其中，病毒RNA的抽提采用TRIzol法，由于TRIzol法抽提病毒RNA为本领域的常规技术，在这里不再赘述。

RT反转录反应液组成如下：随机引物,5倍RT-PCR缓冲液,dNTPs(10mmol/L),RNA酶抑制剂,AMV反转录酶，无RNase的超纯水。

PCR反应液组成如下：上、下游引物(20pmol/μL),10×LA PCR Buffer,dNTPs(2.5mmol/L),MgCl₂(25mmol/L),LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)。

这三种基因型H9N2禽流感病毒8个基因片段的上、下游引物情况如下表：

5.1RT-PCR诊断试剂盒使用说明

取11μL的RT反转录反应液和9μL的病毒RNA置于0.2mL反应管中，以30℃10min,42℃60min,置于PCR仪中进行cDNA合成；取5μL的上述cDNA产物和45μL的PCR反应液置于0.2mL反应管中，首先95℃预变性2min,然后进行以94℃30s,55℃60s（HA,PB1,M,NP这4个基因的退火温度为55℃,PB2,NS,PA,NA的退火温度为52℃）,72℃180s的PCR循环,进行40个循环后于72℃延伸10min。RT-PCR产物经琼脂糖电泳后判定结果，8个片段长度见上表。

实施例6三种基因型H9N2禽流感病毒的灭活疫苗

6.1疫苗抗原液制备及毒价测定

将这三种基因型H9N2禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种9日龄非免疫鸡胚，37℃培养72h(弃去24h内死亡鸡胚)，4℃冷藏24h后，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1：256-512。病毒液置-18℃冰箱中保存备用。

6.2抗原液灭活

将福尔马林溶液加入病毒液中，福尔马林溶液终浓度为0.2%，置37℃温箱内摇动作用1.6小时后，经接种9日龄SPF鸡胚检验合格后作为制备抗原液。

6.3油相佐剂制备

以注射用专用白油(杭州炼油厂)、司本-80(上海大众药业)和硬脂酸铝（上海远航试剂厂），按一定比例（94%轻质白油，6%司本-80，再加2%硬脂酸铝）配制混合，经高温灭菌后备用。

6.4疫苗水相制备

将一定量的吐温-80(上海大众药业)经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度为3%，经充分溶解混合即为水相。

6.5疫苗配制

将一定比例的油相与水相（比例为1：1）在立式胶体磨机中预混后,再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂。

6.6无菌及安全检验

随机抽取4瓶疫苗，分别接种鲜血琼脂培养基，37℃培养48小时，无菌生长。另取免疫剂量的3倍量，颈部皮下注射10日龄非免雏鸡6羽，观察2周，无任何不良反应。

6.7理化性状检查

疫苗色泽正常，3000rpm离心15分钟不分层，37℃放置21天不破乳。

6.8免疫效果评估

取SPF4周龄公鸡，在清洁条件下隔离饲养。为预防试验期间被感染并模仿实际生产条件，所以鸡在接种这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗前均用Lasota株NDV弱毒疫苗及鸡传染性法氏囊弱毒疫苗免疫，5d后注射这三种基因型H9N2禽流感油乳灭活苗。在接种这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗后2、3、4、5周后分别采血，测定对H9亚型AIV HI抗体效价。

以0.5ml一次肌肉注射后2、3、4和5周采血，分离血清测定其对H9亚型AIV的滴度。2周后大多数鸡都已表现出不同程度的HI抗体。在3周后，所有免疫鸡都产生抗H9的HI抗体，且较2周时显著上升，这一HI抗体滴度在5周龄时上升至最高值，这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗：Y1平均可达10log2，Y2平均可达8.6log2，Y3平均可达9.6log2。而且个体间差异减少。

据有关资料表明，当HI抗体的平均值达到4log2就有保护力，但有时能分离到病毒。当达到5log2以上时其保护率达100%并且分离不到病毒。以上试验说明这三种基因型H9N2禽流感油乳剂灭活苗免疫效果较好，能抵抗AIV的侵袭，性能稳定。

序列表

 

 <110>  上海市动物疫病预防控制中心

<120>  禽流感病毒及其检测试剂盒和疫苗

<160>  24    

<170>  PauenuIn version 3.1

                    

 

<210>  1

<211>  2280

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1 中的PB2基因

<400>  1

auggaaagaa uaaaagaauu aagagaccua augucgcaau cccgcacccg cgagauacua     60

acgagaacca cuguggauca uauggccaua aucaagaagu acacaucagg aaggcaagag    120

aagaacccug cucucagaau gaaauggaug auggcuauga aauacccaau cacagcagac    180

aagagaauaa uggaggcgau ccccgaaagg aaugagcaag ggcagacgcu uuggagcaag    240

acaaaugaug cuggaucaga cagggugaug gugucucccc ucgcuguaac uugguggaac    300

aggaaugggc cuacaacaag uacuguccau uacccaaagg uuuacaaaac auacuuugag    360

aagguugaga gguuaaagca uggaaccuuu ggucccgucc acuuccgaaa ucaaauuaaa    420

auacgccgcc ggguugacau aaacccgggu caugcagauc ucagugcuaa agaagcacaa    480

gauguuauca uggagguugu uuuuccaaau gaagugggag ccagaauauu gacaucagaa    540

ucgcaguuga caauaacaaa agagaagaaa gaagagcucc aggauuguaa gauugcuccu    600

uuaaugguag cauacauguu ggaaagggaa cuaguccgga aaaccagauu ccuaccggua    660

gcagguggaa caagcagcgu uuacauugaa guauugcauu ugacucaagg gaccugcugg    720

gaacagaugu acacaccagg cggagaagug agaaaugaug auguugacca gaguuugauc    780

aucgcugcca gaaauauugu uaggagagcu acggugucgg cagauccauu ggcaucauua    840

uuagaaaugu gccacagcac acaaauuggu gggauaagga ugguggacau ccuuaggcaa    900

aauccaacug aggaacaagc uguggauaua ugcaaagcag caaugggcuu gaggaucagu    960

ucaucuuuua gcuuuggagg cuucacuuuc aaaagaacaa gugggucguc ugucaagaag   1020

gaagaggaag ugcucacagg caaucuccaa acacugaaga uaagaguaca ugagggguac   1080

gaggaauuca caaugguugg gcagagagca acagcuaucc ugaggaaagc aaccagaaga   1140

cugauucagc ugauaguaag uggaagagau gaacaaucag ucgcugaagc gaucauugua   1200

gcaauggugu ucucacagga agauugcaug auaaaagcgg ucagggguga ucugaauuuc   1260

guaaauagag caaaccaaag acuaaacccc augcaucaac uccuuaggca cuuucaaaaa   1320

gaugcaaagg ugcuauuuca aaacugggga auugaaccua uugacgaugu cauggggaug   1380

aucggaauau uaccugacau gacuccaagc acagagaugu cacugagagg aguaagaguu   1440

aguaagaugg gaguggauga auauuccagc acugagagag ugguaguaag uauugaccgu   1500

uucuuaaggg uucgagauca gcggggaaac guacucuuau cccccgagga ggucagcgaa   1560

acacagggga cugagaaguu gacaauaaca uauucaucac caaugaugug ggaaaucaac   1620

ggucccgaau cagugcuagu uaacaccuau caguggauca uuagaaauug ggagacugug   1680

aagauucaau ggucucaaga cccaacaaug cuguacaaua aaguggaguu ugaaccguuc   1740

caauccuugg ugccuaaagc uaccagaggu caauauagug gauuugugag aacacuauuc   1800

caacagaugc gugacguauu gggaacauuu gauacuguac agauaauaaa gcugcuacca   1860

uuugcggccg ccccaccaga gcagagcaga augcaguuuu cuucucuaac ugugaaugua   1920

agaggaucgg gaaugcgaau acucguaagg ggcaacuccc caguguucaa cuauaauaag   1980

gcaaccaaaa ggcuuaccau ucuuggaaag gaugcagguu cauuagcaga agauccagau   2040

gagggaacag caggagugga aucugcagua cugaggggau uccuaauucu aggcaaagag   2100

gacaaaaggu auggaccagc auugagcauc aaugaacuga gcaaucuugc gaaaggggag   2160

aaagcuaaug ugcuuauagg gcaaggagac guaguguugg ugaugaaacg gaaacgggac   2220

ucuagcauac uuacugacag ccagacagcg accaaaagga uucggauggc caucaauuag   2280

 

 

<210>  2

<211>  2274

<212>  RNA

<213>   H9N2禽流感病毒Y1中的PB1基因

<400>  2

auggauguca auccgacuuu acuuuucuug aaagugccgg ugcaaaaugc uauaaguacc     60

acguucccuu auacuggaga cccuccauac agccauggaa caggaacagg auacaccaug    120

gacacaguca acagaacaca ucaauacuca gaaaagggaa aauggacaac gaacacagag    180

acuggagcac cccaacucaa uccgauugau ggaccauugc cugaggacaa cgagccgagu    240

ggguaugcac aaacggauug uguauuggaa gcaauggcuu uccuugaaga aucucaccca    300

gggaucuuug aaaacucgug ucucgaaacg auggaaauug uucagcaaac aagaguggau    360

aaacuuaccc aaggucgcca gaccuaugac uggacguuga auagaaauca gccggcugcu    420

acugcauugg ccaacacuau agagguauuc agaucgaaug gccugacagc caaugaauca    480

ggaagguuga uagauuuccu caaggacgua auggaaucga uggauaagga agaaauggag    540

auuacaacac auuuccagag aaagaggaga gugagggaca acaugaccaa aaaaaugguc    600

acacagagaa caauaggaaa gaaaaaacaa agacugaaca aaaggagcua ccuaauaaga    660

gcacugacau ugaacacaau gacaaaggau gcugaaagag gcaaguugaa aaggagggca    720

aucgcaacac ccgggaugca aaucagagga uucguguauu uuguagaaac acuagcgagg    780

aguaucugug agaaacuuga gcaaucuggg cucccugucg gagggaauga gaagaaagcu    840

aaauuggcaa auguugugag gaagaugaug acuaauucac aagauacaga gcucuccuuc    900

acaauuacug gagacaacac caaauggaau gagaaucaga acccccggau guuucuagca    960

augauaacau acaucacaag aaaccaacca gaaugguuua gaaaugucuu aagcauugcu   1020

ccuauaaugu ucucaaauaa gauggcgaga uuagggaaag gauacauguu cgaaaguaag   1080

agcaugaagu uacggacaca aauaccagcg gaaaugcucg caaauauuga ccugaaauac   1140

uucaacaaau caacaagaga gaaaaucgag aaaauaagac cucuacuaau agauggcaca   1200

gccucauuga guccuggagu gaugaugggc auguucaaca uguugaguac agucuuagga   1260

gucucaaucc uuaaucucgg ccagaagaag uacaccaaaa ccacauauug gugggacgga   1320

cuccaauccu cugaugacuu cgcccucaua gugaaugcac cgaaucauga gggaauacag   1380

gcaggggugg auagguucua uagaaccugc aaguuaguug ggaucaacau gagcaagaag   1440

aaauccuaca uaaaucggac aggaacauuc gaauucacaa gcuuuuucua ccgcuaugga   1500

uucguagcca acuucaguau ggaguugccc aguuuuggag uaucugggau uaaugaguca   1560

gcugacauga gcauuggugu uacaguaaua aagaacaaua ugauaaacaa cgaccuugga   1620

ccagcaacag cucagauggc ccuucagcua uuuaucaaag acuacagaua cacauaccga   1680

ugucacaggg gugauacgca aauucaaacg aggagagcau ucgagcugaa gaagcugugg   1740

gagcagaccc guucgaaggc aggauuguug guuucagaug gagggccaaa ccuguacaau   1800

auccggaacc uccacauucc agaggucugc uugaaauggg aauugaugga ugaagacuac   1860

caaggccggc uguguaaucc ucugaacccg uuugucaguc auaaggaaau ugauuccguc   1920

aacaaugcug uggugaugcc agcucauggc ccagccaaaa gcauggagua ugaugccguu   1980

gcaacuacac auucauggau uccuaagagg aaucgcucca uucucaacac cagccaaagg   2040

ggaauucuug aggaugaaca gauguaccag aaguguugca accuauucga aaaguucuuc   2100

cccagcaguu cauaccggag gccaguugga auuuccagca ugguggaggc cauggugucu   2160

agggcccgaa uugaugcacg aauugacuuc gaaucuggaa ggauuaagaa agaggaguuu   2220

gcugagauca ugaagaucug uuccaccauu gaagagcuca gacggcaaaa auag         2274

 

 

<210>  3

<211>  2151

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的PA基因

<400>  3

auggaagacu uugugcgaca augcuucaau ccaaugaucg ucgagcuugc ggaaaaggca     60

augaaagaau auggggaaga uccgaaaauc gaaacgaaca aauucgcagc aauaugcaca    120

cacuuagaag ucugcuucau guacucggau uuccacuuca uugacgaacg aggcgaauca    180

acaauuauag aaucuggcga uccaaaugcg uuggugaaac accugauuga acuaauucga    240

agggagagcc cgaucaaaug gcuugacagu ggugaauagu aucggcaaca ccacgggagu    300

cgagaauccc aaaugucuuc cggaucugua ugacugcaag gaagaccgau ucauugaaau    360

uggaguaacg aggagggaag uccacauauc uccuagagaa agccaauaaa auaaaauccg    420

agaagacacc cauccacauu uucucauuca cuggagaaga gauggccacc aaagcagauu    480

acacucuuga cgaagagagc agggcaagaa ucaaaaccag gcuguucacc auaaggcagg    540

aaauggccag caggggucua ugggauuccu uucgucaguc cgaaagaggc gaagaaacaa    600

uugaagaaag auuugaaauc acaggaacca ugcgcaggcu ugccgaccaa aguaucccac    660

cgaacuucuc cagccuugaa aacuuuagag ccuaugugga uggauucgaa ccgaacggcu    720

gcauugaggg caagcuuucu caaaugucaa aagaagugaa cgccagaauc gagccauuuc    780

uaaggacaac accacgcccc cucagauugc cuaaugggcc ucccugcucu cagcggucga    840

aauucuugcu gauggaugcu cugaaauuaa gcauugagga cccgagccac gaaggggagg    900

gaauaccgcu auaugaugcg aucaaaugca ugaaaacauu cuucggaugg aaagagccca    960

acauuaucaa accacaugag aaaggcauaa accccaauua ucuccugacu uggaagcagg   1020

ugcuagcaga acuucaggac auugaaaaug aagagaagau uccaaagaca aagaacauga   1080

agaaaacaag ccaauuaaag ugggcacucg gugagaacau ggcaccggaa aagguggacu   1140

uugaagauug caaagauguc aacgaccuga aacaguacga cagugaugag ccagagccca   1200

gaucacuagc auguuggauc cagaaugaau ucaacaaggc augugaauug acugauucaa   1260

gcuggauaga acuugaugaa auaggggaag auguugcccc aauugagcac auugcaagca   1320

ugagaaggaa cuauuuuaca gcggagagug uccacugcag ggcuacugaa uacauaauga   1380

agggagugua cauaaauaca gcuuugcuca augcaucuug ugcggccaug gaugacuuuc   1440

aacugauucc aaugauaagc aaaugcagaa ccaaagaagg aagacggaaa acaaaccuau   1500

auggauucau uauaaaagga agaucucauu ugaggaauga uaccgacgug guaaacuuug   1560

uaaguaugga auuuucccuu accgacccga gguuggaacc acauaaaugg gaaaaguacu   1620

guguucuuga aauaggggac augcuccugc gaacugcagu aggccaagug ucaaggccca   1680

uguuccugua ugugagaacc aaugggacuu ccaagaucaa gaugaaaugg gguauggaaa   1740

ugagacgcug ccuuccuuca aucucuccaa cagauugaga gcaugauuga agcugaaucc   1800

uccgucaaag agaaagaccu gaccaaagaa uucuuugaaa acaaaucaga aacauggcca   1860

auuggagagu cacccaaggg aguggaggaa ggcuccaucg gaaaggugug cagaaccuua   1920

cuagcaaaau cuguauucaa cagccuauau gcaucuccac aacucgaggg guucucagcu   1980

gaaucgagaa aacugcuacu cauuguucag gcgcuuaggg auaaccugga accuggaacc   2040

uucgaucuug gagggcuaua ugaagcaauc gaggagugcc ugauuaauga ucccuggguu   2100

uagcuuaaug uaucuugguu caacuccuuc cucacacaug cacugagaua g            2151

 

 

<210>  4

<211>  1683

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的HA基因

<400>  4

auggaaacaa uaucacuaau agcuauacua cuaguaguga cagugagcac ugcagacaaa     60

aucugcaucg gauaccaauc aacaaacucc acagagacug uagacacgcu aacagaaaac    120

aauguuccug ugacacaugc caaagaauug cuccacacgg agcacaaugg gaugcuaugu    180

gcaacaaauc ugggacaucc ucuuauccua gacaccugua acauugaagg acuaaucuau    240

ggcaacccuu ccugugaucu acuguuggga ggaagagaau gguccuacau uguagaaaga    300

ccaucggcug ucaauggauu guguuauccc gggaauguag aaaaucuaga agaacuaagg    360

ucacguuuua guucugcuag uucuuaccag agaauccaga ucuuuccaga cgcaaucugg    420

aaugugucuu acagugggac aagcaaagca uguucugacu cauucuacag aagcaugaga    480

ugguugacuc aaaagagcaa cgcuuacccu auucaagacg cccaauacac aaauaauaga    540

gggaagaaca uucuuuucau guggggcaua aaucacccac ccaccgacac uguacagaca    600

aaucuguaca caaggacuga cacaauaaca aguguggcga cugaagauau aaauagaacc    660

uucaaaccau ugauagggcc aaggccucuu guaaaugguc agcagggaag gauugauuau    720

uauuggucga uauugaaacc aggucaaaca cugagaauaa gauccaaugg gaaucuaauu    780

gcuccauggu auggacacgu ucuuucggga gagagccaug gaagaauacu aaagacugau    840

guaaacagug guaacugugu ggugcaaugu cagacagaaa aaggugguuu aaauacuaca    900

uugccauucc aaaauguaag uaaguaugca uuuggaaacu gcccaaagua uguuggcgua    960

aagagucuca aauuggcagu uggucugagg aaugugccug cuagaucaag cagaggacua   1020

uuuggggcua uagcuggauu cauagaggga gguuggucag gccuagucgc ugguugguau   1080

ggauuccagc auucaaauga ccaagggguu gguauggcag cagauaggga uucgacucaa   1140

aaggcaauug acaaaauaac aucuaaagug aauaauauag ucgauaaaau gaacaaacag   1200

uaugaaauua uugaucauga auucagcgag guugaaaccc gacucaacau gaucaauaau   1260

aagauugaug accaaauuca agacauaugg gcauauaaug cagaaaugcu agugcugcuu   1320

gaaaaccaga aaacacucga ugagcaugau gcgaauguga acaaucuaua uaauaaagug   1380

aagagagcau uagguuccaa ugcaguggaa gaugggaaag gguguuucga gcuauaccau   1440

aaaugugaug accagugcau ggaaacaauu cgaaacggga ccuacaacag gagaaaguau   1500

aaggaggaau caaaacuaga aagacagaaa auagaagggg ucagacugga aucugaagga   1560

acuuacaaaa uccucaccau uuauucgacu gucgccucau cucuugugau ugcaaugggg   1620

uuugcugccu ucuuguucug ggccaugucc aauggaucuu gcagaugcaa cauuuguaua   1680

uaa                                                                 1683

 

 

<210>  5

<211>  1497

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的NP基因

<400>  5

auggcgucuc aaggcaccaa acgaucuuac gaacacgaug gaaacuggug gagaacgcca     60

gaaugcuacu gagaucaggg caucuguugg aagaaugguu aguggcauug ggagauucua    120

cauacagaug uguacagaac ucaaacucag ugacaaugaa gggaggcuga uccagaacag    180

uauaacaaua gagagaaugg uacucucugc auuugaugaa agaaggaaca gauaccugga    240

agagcacccc aguucgggaa aggacccgaa gaaaacugga gguccaauuu accggagaag    300

agacgggaaa ugggugagag agcugauccu guaugacaaa gaggagauca ggaggauuug    360

gcgucaagcg aacaauggag aggacgcaac ugcuggucuu acccaucuga ugauauggca    420

uuccaaccug aaugaugcca ccuaucagag aacgagagcu cucgugcgua cuggaaugga    480

uccccggaug ugcucucuga ugcaaggauc aacucucccg aggagaucug gagcugcagg    540

ugcagcagua aaggggauag ggacaauggu gauggaacug auucggauga uaaaacgagg    600

gaucaacgac cggaauuucu ggagaggcga aaauggaaga agaacaagga uugcauacga    660

gaggaugugc aauauccuca aagggaaauu ccaaacagca gcacaaagag caaugaugga    720

ucaagugcga gagagcagaa auccugggaa ugcugaaaua gaagaucuca uuuuucuggc    780

aaggucugca cucauccuga gaggaucagu ggcccauaag uccugcuugc cugcuugugu    840

guacggacuu gcaguggcca guggauauga cuuugagaga gaaggguacu cccugguugg    900

aauagauccu uuccgucugc uucaaaacag ccaggucuuu agucucauua gaccaaauga    960

gaacccagca cauaagaguc aauuagugug gauggcaugc cacucugcag cauuugagga   1020

ccuuaggguc ucaaguuuca ucagagggac aagaaugguc ccaagaggac agcuauccac   1080

uagagggguu caaauugcuu caaaugagaa cauggaagca auggacucca acacucuuga   1140

acugagaagu agauauuggg cuauaagaac cagaagcgga ggaaacacca accaacagag   1200

ggcaucugca ggacagauca gcguucaacc cacuuucucg guacagagaa aucuucccuu   1260

cgaaagagcg accauuaugg cagcauuuac aggaaacacu gaggguagaa cgucugacau   1320

gaggacugaa aucauaagaa ugauggagag ugccagacca gaagaugugu cauuccaggg   1380

gcggggaguc uucgagcucu cggacgaaaa ggcaacgaac ccgaucgugc cuuccuuuga   1440

caugaauaau gaaggaucuu auucuucgga gacaaagcag gggaguauga caauuaa      1497

 

 

<210>  6

<211>  1401

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的NA基因

<400>  6

augaauccaa aucagaagau aauaacaauu ggcucuguuu cucuaacuau ugcggcaaua     60

ugcuuccuca ugcagauugu caucuuagca acgacuauga cacuaccuuu caagcagaau    120

gaaugcagca accccucgaa uaaccaagua gugccaugug aaccaaucau aauagaaagg    180

aacauagugc auuggaauaa uacuaccauc gagaaggaaa uuuguccuaa aguggcagaa    240

uacaagaauu ggucaaaacc ccaaugucaa aucacagggu ucgcuccuuu cuccaaggac    300

aacucaauua ggcuuuccgc aaguggggau aucuggguga caagagaacc uuaugugucg    360

uguggucuug guaaauguua ucaauuugca cuuggacagg gaaccacuuu gaaaaacaaa    420

cacucaaaug guacuacgca ugauagaauc ccucauagaa cccuuuuaau gaaugaguug    480

ggugucccgu uucauuuggg aaccaaacaa gugugcauag caugguccag cucaagcugu    540

caugauggga aagcaugguu acauguuugu gucacuggug augauaaaaa ugcgacugcu    600

aguaucauuu augacgggau gcuuguugac aguauugguu cauggucuaa aaacauccuc    660

agaacucagg agucugagug cguuugcauc aauggaacuu guacaguagu aaugacugau    720

ggaagugcau caggaaaggc ugacacuaga cuauuauuca uaagagaggg aaagauugua    780

cacauuagcc cauugucagg aagugcucag cauguggagg aauguuccug uuacccccgg    840

uauccagaag uaaggugugu uuguagagac aauuggaagg gcuccaauag gcccguucua    900

uauauaaaug uggcagauua uaguauugag uccaguuaug ugugcucagg acuugucggc    960

gacacaccaa gaaaugauga uagcuccagc agcagcaacu gcagggaucc uaauaacgag   1020

agaggggccc caggagugaa agggugggcc uuugacacug gaaaugacau uuggauggga   1080

cgaacgauca aaguggauuc acgcucaggu uaugagacuu uuagagucgu uggugguugg   1140

accacggcua auuucaaguc acagauaaau agacaaguca uaguugacag ugacaacugg   1200

ucaggguauu cugguaucuu cucuguugaa ggcaaaaacu gcauuaacag guguuuuuau   1260

guggaguuga uaagaggaag accacaggag acuaagauau gguggacuuc aaauagcauc   1320

auuguauuuu guggaaccuc agguaccuau ggaacaggcu cauggccuga uggggcgaau   1380

aucaacuuca ugccuauaua a                                             1401

 

 

<210>  7

<211>  982

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的M基因

<400>  7

augagccuuc uaaccgaggu cgaaacguau guucucucua ucaucccauc aggcccccuc     60

aaagccgaga uagcgcagag acuugaagau gucuuugcag ggaagaacac agaccuugag    120

gcucucaugg aauggcuaaa gacaagacca aucuugucac cucugacuaa agggauuuua    180

ggguuugugu ucacgcucac cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgauuuguc    240

caaaaugccc uaaaugggaa uggagaccca aacaacaugg acagggcagu caaacuauac    300

aagaagcuga agagggaaau gacguuccau ggagcaaagg agguugcacu caguuacuca    360

acuggugcgc uugccaguug caugggucuc auauacaacc gaaugggaac ggugaccaca    420

gaaguggcuc ugggccuagu augugccacu ugugagcaga uugcugauuc acaucauagg    480

ucucacagac aaauggcgac aacuaccaac ccacuaauca ggcaugagaa cagaauggua    540

cuagccagca cuacagcuaa ggcaauggag caaauggcug gaucgaguga gcaggcagcg    600

gaagccaugg agguugcaag ucaggcuagg cagauggugc aggcgaugag gacuauugga    660

acucaaccua gcuccagugc aggccugaaa gaugaucuua uugaaaauuu gcaggcauac    720

cagaaacgga ugggagugca gaugcaacga uucaagugau ccucucauua uugcagcaag    780

cgucauuggg auauugcacu ugauauugug gauucuugau cgucuuuucu ucaaaugcau    840

uuaucgucgc uuuaaauacg guuugaaaag agggccuucu acggaaggag ugccugaguc    900

uaugagggaa gaauaucggc aggagcaaca gagugcugug gauguugacg auggucauuu    960

ugucaacaua gagcuggagu aa                                             982

 

 

<210>  8

<211>  838

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y1中的NS基因

<400>  8

augaacucca acacuguguc aagcuuucag guagacugcu uucuuuggca uguccgcaaa     60

cgguuugcag accaagaacu gggugaugcc ccauuucuag accggcuucg ccgggaucag    120

aagucccuga gaggaagaag cagcacucuu ggucuggaca ucagaaccgc cacucgugaa    180

ggaaagcaua uaguggagcg aauuuuggag gaagagucag acgaagcauu uaaaaugacu    240

auugcuucag ugccagcucc acgcuaucua acugacauga cucuugaaga aaugucaaga    300

gauugguuaa ugcucauucc caaacagaaa gugacagggu cccuuugcau uagaauggac    360

caagcaauag uggacaaaaa caucacauug aaagcaaauu ucagugugau uuucaaucga    420

uuggaagccc uaauacuacu uagagcuuuu acggaugaag gagcaauagu gggcgaaauc    480

ucaccauuac cuucucuucc aggacauacu gacaaggaug ucaaaaaugc aauugggguc    540

cucaucggag gauuugaaug gaaugauaac acaguucgag ucucugaaac ucuacagaga    600

uucgcuugga gaagcagcga ugaggauggg agaccuccac ucucuccaaa guagaaacgg    660

gagauggaga gaacaguuaa gccagaaauu ugaagaaaua agaugguuga uugaagaagu    720

acgacauagg uuaaagauua cagagaauag cuuugaacaa auaacuuuua ugcaagccuu    780

acaacuauug cuugaagugg agcaagagau aagaacuuuc ucguuucagc uuauuuaa      838

 

 

<210>  9

<211>  2280

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的PB2基因

<400>  9

auggagagaa uaaaagaauu aagagaccua augucgcaau cccgcacccg cgagauacua     60

acgagaacca cuguggauca uauggccaua aucaagaagu acacaucagg acggcaagag    120

aaaaaaccug cucucagaau gaaauggaug auggcuauga aauacccaau cacagcagac    180

aaaagaauag uggaggugau ucccgaaagg aaugagcaag ggcagacgcu uuggagcaag    240

acaaaugaug cuggaucaga cagggugaug gugucucccc ucgcuguaac uugguggaac    300

aggaaugggc cuauaacaag uacuguucau uacccaaagg uuuacaaaac auacuuugag    360

aaaguugaga gguuaaagca uggaaccuuu ggucccgucc acuuccgaaa ucaaauuaaa    420

auacgccgcc ggguugacau aaacccgggu caugcagauc uaagugcuaa agaagcacaa    480

gauguuauca uggagguugu uuuuccaaau gaagugggag ccagaauauu gacaucagaa    540

ucgcaguuga caauaacaaa agagaagaaa gaagagcucc aggauuguaa gauugcuccu    600

uuaaugguag cauacauguu ggaaagggaa cuaguccgaa aaaccagauu ccuaccggug    660

gcagguggaa caagcagcgu uuacauugaa guauugcauu ugacucaagg gaccugcugg    720

gaacagaugu acacuccagg cggagaagug agaaaugaug auguugacca gaguuugauc    780

auugcugcca gaaacauugu uaggagagcu acggugucgg cagauccauu ggcaucauua    840

uuagaaaugu gccacagcac acaaauuggu gggauaagga ugguggacau ccuuaggcaa    900

aauccgacug aggaacaagc uguggauaua ugcaaagcag caaugggcuu gaggaucaau    960

ucaucuuuua gcuuuggagg cuucacuuuc aaaagaacaa gugggucguc ugucaagaag   1020

gaagaggaag ugcucacagg caaucuccaa acacugaaga uaagaauaca ugagggguac   1080

gaggaauuca caaugguugg gcggagagca acagcuaucc ugaggaaagc aaccagaaga   1140

cugauucagc ugauaguaag uggaagagau gaacaaucag ucgcugaagc gaucauugua   1200

gcaauggugu ucucacagga agauugcaug auaaaagcgg ucagagguga ucugaauuuc   1260

guaaauagag caaaucaaag auuaaacccc augcaucaac uccuuaggca cuuccaaaaa   1320

gaugcaaaag ugcuauuuca aaacugggga auugaaccca uugacgaugu cauggggaug   1380

aucggaauau uaccugacau gacuccaagc acagaguugu cacugagagg aguaagaguu   1440

aguaagaugg ggguggauga auauuccagc accgagagag ugguaguaag uauugaccgu   1500

uucuuaaggg uucgagauca gcggggaaau guacucuuau cccccgagga ggucagcgag   1560

acacagggga cagagaaauu gacaauaaca uauucaucac caaugaugug ggaaaucaac   1620

gguccugaau cagugcuagu uaacaccuau caguggauca uuagaaauug ggagaaugua   1680

aagauucaau ggucucaaga cccaacaaug cuguacaaua agguggaguu ugaaccguuc   1740

caauccuugg ugccuaaagc uaucagaggu caauauagug gauuugugag aacauuauuc   1800

caacagaugc gugacguauu gggaacauuu gauacuguac agauaauaaa gcugcuacca   1860

uuugcggccg ccccaccaga gcagagcaga augcaguuuu cuucucuaac ugugaaugug   1920

agaggaucgg gaaugcgaau acucguaagg ggcaacuccc caguguucaa cuauaauaag   1980

gcaaccaaaa ggcuuaccau ucuuggaaag gaugcagguu cauuagcaga agauccagau   2040

gagggaacag caggagugga aucugcagua cugaggggau uccuaauucu aggcaaagag   2100

gacaaaaggu auggaccggc auugagcauc aaugaacuga gcaaucuugc gaaaggggag   2160

aaagcuaaug ugcuuauagg gcaaggagac auaguguugg uaaugaaacg gaaacgggac   2220

ucuagcauac uuacugacag ccagacagcg accaaaagaa uucggauggc caucaauuaa   2280

 

 

<210>  10

<211>  2274

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的PB1基因

<400>  10

auggauguca auccgacuuu acuuuucuug aaagugccag ugcaaaaugc uauaaguacc     60

acguucccuu auacuggaga cccuccauac agccauggaa caggaacagg auacaccaug    120

gacacaguca acagaacaca ucaauacuca gaaaagggaa aguggacaac gaacacagag    180

acuggagcac cccaacucaa uccgauugac ggaccauugc cugaggacaa cgagccgagu    240

ggguaugcac aaacggacug uguuuuggaa gcaauggcuu uccuugaaga aucucaccca    300

gggaucuuug aaaacucaug ucucgaaacg auggaaauug uucagcaaac aagaguggau    360

aaacugaccc aaggucgcca gaccuaugac uggacuuuga auagaaauca accggcugcu    420

acugcauugg ccaacacuau agagguauuc agaucgaaug gccugacagc caaugaauca    480

ggaagguuga uagauuuccu caaggacgua auggaaucga uggauaagga agaaauggag    540

auuacaacac auuuccagag aaagaggaga gugagggaca acaugaccaa gaaaaugguc    600

acacagagaa caauaggaaa gaaaaaacaa agacugaaca aaaggagcua ccuaauaaga    660

gcacugacau ugaacacaau gacaaaggau gcugaaagag gcaaguugaa aaggagggca    720

aucgcaacac ccgggaugca aaucagagga uucguguauu uuguagaaac acuagcgagg    780

agcaucugug agaaacuuga gcaaucuggg cucccugucg gagggaauga gaagaaagcu    840

aaauuggcaa auguugugag gaagaugaug acuaauucac aagauacaga gcucuccuuc    900

acaauuacug gagacaacac caaauggaau gagaaucaga acccccggau guuucuagca    960

augauaacau acaucacaag aaaccaacca gaaugguuua gaaaugucuu aagcauugcu   1020

ccuauaaugu ucucaaauaa gauggcgaga uuagggaaag gauacauguu cgaaaguaag   1080

agcaugaagu uacggacaca aauaccagcg gaaaugcucg caaauauuga ccugaaauac   1140

uucaacaaau caacaagaga gaaaaucgag aaaauaagac cucuacuaau agauggcaca   1200

gccucauuga guccuggagu gaugaugggc auguucaaca uguugaguac agucuuagga   1260

gucucaaucc uuaaucucgg ccagaagaag uacaccaaaa ccacauauug gugggacggg   1320

cuccaauccu cugaugacuu cgcccucaua gugaaugcac cgaaucauga gggaauacag   1380

gcaggagugg auagguucua uagaaccugc aaauuaguug ggauaaacau gagcaagaag   1440

aaauccuaca uaaaucggac aggaacauuc gaauucacaa gcuuuuucua ccgauaugga   1500

uucguagcca acuucaguau ggaguugccc aguuuuggag ugucugggau uaaugaguca   1560

gcugacauga gcauuggugu uacaguaaua aagaacaaua ugauaaacaa cgaccuugga   1620

ccagcaacag cucagauggc ccuucagcua uuuaucaaag acuacagaua cacauaccga   1680

ugucacaggg gugauacgca aauucaaacg aggagagcau ucgagcugaa gaagcugugg   1740

gagcagaccc guucgaaggc aggauuguug guuucagaug gagggccaaa ccuguacaau   1800

auccggaacc uccacauucc agaggucugc uugaaauggg aauugaugga ugaagacuac   1860

caaggcaggc uguguaaucc ucugaacccg uuugucaguc auaaggaaau ugauuccguc   1920

aacaaugcug uggugaugcc agcucacggc ccagccaaaa gcauggagua ugaugccguu   1980

gcaacuacac auucauggau uccuaagagg aaucgcucca uucucaacac cagccaaagg   2040

gggauucuug aggaugaaca gauguaccag aaguguugca accuauucga aaaguuuuuc   2100

cccagcaguu cauaccggag gccaguugga auuuccagca ugguggaggc cauggugucu   2160

agggcccgaa uugaugcacg aauugacuuc gaaucuggaa ggauuaagaa agaagaguuu   2220

gcugagauca ugaagaucug uuccaccauu gaagagcuca gacggcaaaa auag         2274

 

 

<210>  11

<211>  2151

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的PA基因

<400>  11

auggaagacu uugugcgaca augcuucaau ccaaugaucg ucgagcuugc ggaaaaggca     60

augaaagagu auggggaaga uccgaaaauc gaaacgaaca aauucgcauc aauaugcaca    120

cacuuagaag ucugcuucau guacucugau uuccacuuca uugacgaacg aggcgaauca    180

acuauuauag aaucuggcga uccaaaugcg uuguugaaac accgauuuga aauaaucgaa    240

gggagagacc gaacaauggc cuggacagug gugaauagua ucugcaacac cacgggaguc    300

gagaaaccca aauuucuucc ggaucuguau gacuacaagg agaaccgauu cauugaaauu    360

ggaguaacga ggagggaagu ccacauauac uaccuagaga aagccaauaa aauaaaaucc    420

gagaagacac acauccacau uuucucauuc acuggagaag agauggccac caaagcagau    480

uacacucuug acgaagagag cagggcaaga aucaagacca ggcuguucac cauaaggcag    540

gaaauggcca gcaggggucu augggauucc uuucgucagu ccgaaagagg cgaagaaaca    600

auugaagaaa gauuugaaau cacaggaacc augcgcaggc uugccgacca aagucuccca    660

ccgaacuucu ccagccuuga aaacuuuaga gccuaugugg auggauucga accgaacggc    720

ugcauugagg gcaagcuuuc ucaaauguca aaagaaguga acgccagaau cgagccauuu    780

cuaaggacaa caccacgccc ccucagauug ccuaaugggc cucucugcuc ucagcggucg    840

aaauucuugc ugauggaugc ucugaaauua agcauugagg acccaagcca cgaaggggag    900

ggaauaccgc uauaugaugc gaucaaaugc augaaaacau ucuucggaug gaaagagccc    960

aacauuauca aaccacauga gaaaggcaua aaccccaauu aucuccugac uuggaagcaa   1020

gugcuagcag aacuucagga cauugaaaau gaagagaaga uuccaaagac aaagaacaug   1080

aagaaaacaa gccaauuaaa gugggcacuu ggugagaaca uggcaccgga aaagguggac   1140

uuugaagauu gcaaagaugu caacgaccug agacaguacg acagugauga gccagagccc   1200

agaucacuag cauguuggau ccagaaugaa uucaacaagg caugugaauu gacugauuca   1260

agcuggauag aacuugauga aauaggggaa gauguugccc caauugagca cauugcaagc   1320

augagaagga acuauuuuac agcggaggug ucccacugca gggcuacuga auacauaaug   1380

aagggagugu acauaaauac agcuuugcuc aaugcaucuu gugcagccau ggaugacuuu   1440

caauugauuc caaugauaag caaaugcaga accaaagaag gaagacggaa aacaaaccua   1500

uauggauuca uuauuaaagg aagaucucau uugaggaaug auaccgacgu gguaaacuuu   1560

guaaguaugg aauuuucccu uaccgacccg agguuggaac cacauaaaug ggaaaaguac   1620

uguguucuug aaauagggga caugcuccug cgaacugcag uaggccaagu gucaaggccc   1680

auguuccugu augugagaac caaugggacu uccaagauca agaugaaaug ggguauggaa   1740

augagacgcu gccuucuuca aucucuccaa cagauugaga gcaugauuga agcugaaucc   1800

uccgucaaag agaaagaccu gaccaaagaa uucuuugaaa acaaaucaga aacauggcca   1860

auuggagagu cacccaaggg aguggaggaa ggcuccaucg gaaaggugug cagaaccuua   1920

cuagcaaaau cuguauucaa cagucuauau gcaucuccac aacucgaggg guucucagcu   1980

gaaucgagaa aacugcuacu cauuguucag gcgcuuaggg auaaccugga accuggaacc   2040

uucgaucuug gagggcuaua ugaagcaauc gaggagugcc ugauuaauga ucccuggguu   2100

uugcuuaaug caucuugguu caacuccuuc cucacacaug cacugagaua g            2151

 

 

<210>  12

<211>  1683

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的HA基因

<400>  12

auggaaacaa uaucacuaau agcuaugcua cuaguaguaa caguaagcga ugcagauaau     60

aucugcaucg gcuaucaauc aacaaacucc acagaaacug uagacacacu aacagaaaag    120

aaugucccug ugacacaugc caaagaauug cuccacacau ggcaguaugg gaagcugugu    180

gcaaaaagcu cgccauuuau ucauauguua caucaccgaa ccaauuuggg acuaaucuau    240

gucuauccuu cuugugaucu uuugugggga agaauaggau gauccuguuu acccuauagu    300

uuaucuggug guaauguucc ccugaacccc gggaauguag aaaaucuaga agagcuaagg    360

ucacuuuuua guucugcuag uucuuaucaa aggauccaga uuuuuccaga cacaaucugg    420

aaugugucuu acagugggac aagcaaagca uguucagauu cauucuacag aagcaugaga    480

ugguugaccc aaaagaacaa cgcuuacccu auucaagacg cccaauacac aaauaaucaa    540

gaaaagaaca uucuuuucau guggggcaua aaucacccac ccaccgauac ugcgcagaca    600

aaucuguaca caagaaccga cacaacaaca aguguggcaa cagaagaaau aaauaggacc    660

uucaaaccau ugauaggacc aaggccucuu gucaaugguu ugcagggaag aauugacuau    720

uauuggucgg uauugaaacc gggucaaaca cugcgaauaa gauccaaugg gaaucuaaua    780

gcuccauggu auggacacau ucuuucagga gagagccacg gaagaauccu gaagacugau    840

uuaaaaaggg guagcugcac agugcaaugu cagacagaaa aagguggcuu aaacacaaca    900

uugccauucc aaaacguaag uaaguaugca uuuggaaacu gcucgaaaua uauuggaaua    960

aagagucuca aacuugcagu uggucugagg aaugugccuu cuagaucuag uagaggacua   1020

uucggggcca uagcaggauu cauagaggga gguuggucag gacuaguugc ugguugguau   1080

ggauuccagc auucaaauga ccaagggguu gguauggcag cagauagaga cucaacccaa   1140

aaggcaauug auaaaauaac auccaaagug aauaacauag ucgacaaaau gaacaagcag   1200

uaugaaauua uugaucauga auucaacgag guugaaacua gacuuaacau gaucaauaau   1260

aagauugaug aucaaaucca agacauaugg gcauauaaug cagaauugcu aguucugcuu   1320

gaaaaccaga aaacacucga ugaacaugau gcaaauguaa acaaucuaua uaauaaagug   1380

aagagggcau uggguuccaa ugcgguggaa gaugggaaag gauguuucga gcuauaccac   1440

aaaugugaug accagugcau ggagacaauu cggaacggga ccuacaacag gaggaaguau   1500

caagaggaau caaaauuaga aagacagaaa auagaggggg ucaagcugga aucugaagga   1560

acuuacaaaa uccucaccau uuauucgacu gucgccucau cucuugugau ugcaaugggg   1620

uuugcugccu ucuuguucug ggccaugucc aauggaucuu gcagaugcaa cauuuguaua   1680

uaa                                                                 1683

 

 

<210>  13

<211>  1497

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的NP基因

<400>  13

auggcgucuc aaggcaccaa acgaucuuac gaacagaugg aaacuggugg agaacgccag     60

aaugccacug agaucagggc auccguugga agaaugguua guggcauugg gagauuuuac    120

auacaaaugu guacagaacu caaacucagu gacaaugaag ggaggcugau ccagaacagu    180

auaacaauag agagaauggu acucucugca uuugaugaaa gaaggaacag auaccuagaa    240

gagcacccca gugcgggaaa ggacccgaag aaaacuggag guccaauuua ccggagaaga    300

gacgggaaau gggugagaga gcugauccug uaugacaaag aggagaucag gaggauuugg    360

cgucaagcga acaauggaga ggacgcaacu gcuggucuua cccaucugau gauauggcau    420

uccaaccuga augaugccac cuaucagaga acaagagcuc ucgugcguac uggaauggau    480

ccccggaugu gcucucugau gcaaggauca cucucccgag gagaucugga gcugcaggug    540

cagcaguaaa ggggauaggg acaaugguga uggaacugau ucggaugaua aacgagggau    600

caacgaccgg aauuucugga gaggcgaaaa uggaagaaga acaaggauug cauacgagag    660

gaugugcaac auccucaaag ggaaauucca aacagcagca caaagagcaa ugauggauca    720

agugcgagag agcagaaauc cugggaaugc ugagauagaa gaucucauuu uucuggcaag    780

gucugcacuc auccugagag gaucaguggc ccauaagucc ugcuugccug cuuguguaua    840

cggacuugca guggccagug gauaugacuu ugagagagaa ggguacuccc ugguuggaau    900

agauccuuuc cgucugcuuc aaaacagcca ggucuuuagc cucauuagac caaaugagaa    960

uccagcacau aagagucaau uaguguggau ggcaugccac ucugcagcau uugaggaccu   1020

uagggucuca aguuucauca gagggacaag aaugguccca agaggacagc uauccacuag   1080

agggguucaa auugcuucaa augagaacau ggaagcaaug gacuccaaua cucuugaacu   1140

gagaaguaga uauugggcua uaagaaccag aagcggagga aacaccaacc aacagagggc   1200

aucugcagga cagaucagcg uucaacccac uuuuucggua cagagaaauc uucccuucga   1260

aagagcgacc auuauggcag cauuuaaagg aaacacugag gguagaacgu cugacaugag   1320

gacugaaauc auaagaauga uggaaagugc cagaccagaa gaugugucau uccaggggcg   1380

gggagucuuc gagcucucgg acgaaaaggc aacgaacccg aucgugccuu ccuuugacau   1440

gauauacaug aaggaucuua uuucuucgga gacaaagcag gggaguauga caauuaa      1497

 

 

<210>  14

<211>  1401

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的NA基因

<400>  14

augaauccaa aucagaagau aauaacaauu ggcucuguuu cucuaaccau ugcgauaaua     60

uguuuucuca ugcagauugc caucuuaaca acgaccauga cacuacauuu caggcagaau    120

gaaugcagca acccaucgaa uaaucaagug gugccaugug aaccuaucau aauagagagg    180

aacacagugc auuugaauag uacuaccaua gagaaggaaa uuuguccuaa aguggcagaa    240

uacaagaauu ggucaaaacc acaaugucaa auuacagggu ucgcuccuuu cucaaaggac    300

aacucaauua ggcuuucugc agguggagau aucuggguga caagagaacc uuaugugucg    360

ugcagucuug gcaaauguua ucaauuuuca cuugggcagg gaaccacucu gaaaaacaag    420

cacucaaaug gcacuacaca ugauagaauu ccucacagaa cucuuuuaau gaaugaguua    480

ggugucccau uucauuuggg aaccaaacaa gugugcauag cauggucuag uucaagcugc    540

caugauggga aagcaugguu acauauuugu gugacugggg augauaaaaa ugcuacugcu    600

aguaucauuu augaugggau gcugguugac aguauugguu caugguccaa aaacauccua    660

agaacucagg agucagaaug cguuugcauc aauggaacuu gugcaguagu aaugacugau    720

ggaagugcau caggaaaggc ugacacuaga auauuauuca uaagagaggg aaaaauuaua    780

acuaucagcc cauugucagg aagugcucag cacguggagg aaugcuccug uuacccccgg    840

uauccugaag ucaggugugu uugcagagac aauuggaagg gcuccaauag gcccguucua    900

uauauaaaua uggcagauua uaguauugag uccaguuaug ugugcucagg acuuguugga    960

gacacaccaa gagaugauga uagcuccagc agcagcaacu gcagagaccc uaauaacgaa   1020

agaggggccc caggagugaa agggugggcc uuugacgaug ggaaugacau uuggauggga   1080

cgaacaauca aaagugauuc acgcucaggu uaugagacuu uuagggucgu uaaugguugg   1140

accacggcua auaacaaguc acaguuaaau aggcaaguca uaguugacag ugacagcugg   1200

ucuggguauu cugguaucuu cucuguugaa ggcaaaaacu gcaucaacag guguuuuuau   1260

guggaguuga uaagagggag accgcaggag accagagugu gguggacuuc aaacagcauc   1320

auuguauucu guggaaccuc agguacauau ggaacaggcu cauggccugu uggggcgaau   1380

aucaacuuca ugccuauaua a                                             1401

 

 

 

<210>  15

<211>  982

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的M基因

<400>  15

augagccuuc uaaccgaggu cgaaacguau guucucucua ucaucccguc aggcccccuc     60

aaagccgaga ucgcgcagag acuugaagau gucuuugcag ggaagaacac agaucuugag    120

gcucucaugg aauggauaaa gacaagacca auccugucac cucugacuaa ggggauuuua    180

ggguuugugu ucacgcucac cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgguuuguc    240

caaaaugccc uaaaugggaa uggagaccca aacaacaugg acagggcagu uaaauuauac    300

aagaagcuga agagggaaau gacauuccau ggggcaaagg aaguugcacu cagcuacuca    360

acuggugcgc uugccagcug caugggucuc auauacaaca ggaugggaac agugaccgca    420

gaaggggcuc uuggccuagu augugccacu ugugagcaga uugcugacgc ccaacaucgg    480

ucccacaggc agauggcgac uacuaccaac ccacuaauua ggcaugagaa uagaauggua    540

cuagccagca cuacggcuaa ggcuauggag cagauggcug gaucaagcga acaggcagca    600

gaagccaugg aaguugcaag ucaggcuagg caaaugguac aggcuaugag gacagucggg    660

acucacccua gcuccaguac aggucuaaaa gaugaucuua uugaaaauuu gcaggcuuac    720

cagaaacgga ugggagugca acugcagcga uucaagugau ccucucguug uugcagcaag    780

cauuguuggg auauugcacu ugauauugug gauucuugau cgucuuuucu ucaaaugcau    840

uuaucgucgc uuuaaauacg guuugaaaag agggccuucu acggaaggag ugccugaguc    900

uaugagggaa gaauaucggc aggaacagca gaaugcugug gauguugacg cuggucauuu    960

ugucaacaua gagcuggagu aa                                             982

 

 

 

<210>  16

<211>  838

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y2中的NS基因

<400>  16

augaacucca acacuguguc aagcuuccag guagacugcu uucuuuggca uguccgcaaa     60

cgguuugcag accaagaacu gggugaugcc ccauuucuag accggcuucg ccgggaucag    120

aaaucccuga gaggaagaag cagcacucuu ggucuggaca ucagaaccgc cacucgugaa    180

ggaaagcaua uaguggagcg aauuuuggag gaagagucag acgaagcauu uaaaaugacu    240

auugcuucag ugccagcucc acgcuaucua acugacauga cucuugaaga aaugucaaga    300

gauugguuaa ugcucauucc caaacagaaa gugacagggu cccuuugcau uagaauggac    360

caagcaauag uggacaaaaa caucacacug aaagcaaauu ucagugugau uuucaaucga    420

cuggaagccc uaauacuacu uagagcuuuu acggaugaag gagcaauagu gggcgaaauc    480

ucaccauuac cuucucuucc aggacauacu gacaaggaug ucaaaaaugc aauugggguc    540

cucaucggag gauuugaaug gaaugauaac acaguucgag ucucugaaac ucuacagaga    600

uucgcuugga gaagcagcga ugaggauggg agaccuccac ucucuccaaa guaggaacgg    660

gagauggaga gaacaguuaa gccagaaguu ugaagaaaua agaugguuga uugaagaagu    720

acgacauagg uuaaagauua cagagaauag cuuugaacaa auaacuuuua ugcaagccuu    780

acaacuauug cuugaagugg agcaagagau aagaacuuuc ucguuucagc uuauuuaa      838

 

 

<210>  17

<211>  2280

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的PB2基因

<400>  17

auggaaagaa uaaaagaacu aagagauuug augucacagu cucgcacucg cgagauacug     60

acaaaaacaa cuguggacca uauggccaua aucaagaaau auacaucggg aaggcaggag    120

aagaauccug cccuuaggau gaaguggaug auggcgauga aauauccaau uacagcagac    180

aaaaggauaa uggagaugau cccggaaaga aaugagcaag gucagacccu uuggagcaag    240

acaaaugaug cuggaucaga cagagugaug gugucaccuc uggcugugac gugguggaac    300

agaaauggac caacgacaag uacaguccau uauccaaagg ucuauaaaac cuauuuugaa    360

aaggucgaaa ggcuaaaaca uggaaccuuc ggccccguuc acuuccgaaa ccagguuaaa    420

auacgccgca ggguugacau aaacccaggc caugcagauc uuagugcuaa agaagcacaa    480

gaugucauca uggaggucgu auucccaaac gaaguuggag ccaggauauu gacaucagag    540

ucacaguuaa cgauaacaaa ggaaaagaag gaggagcuuc aggacugcaa aauugccccu    600

uuaauggugg cauacauguu ggagagagaa cugguucgca aaacaagauu ccuaccagua    660

gcuggaggga caagcagugu guauaucgaa guguugcauu ugacccaagg gaccugcugg    720

gagcaaaugu acacaccggg aggggaagug agaaaugaug acguugauca gaguuuaauu    780

auugcugcua gaaauauugu uagaagagca acaguaucag cagacccguu ggcuucgcuu    840

uuggagaugu gccauaguac acagauuggc gggauaagga ugguggacau ccuuagacaa    900

aacccaacag aagaacaggc uguggauaua ugcaaagcag caaugggucu aaggaucagu    960

ucauccuuca gcuuuggagg cuucacuuuc aaaagaacaa gugggucguc ugucaagaag   1020

ggaggagaag ugcucacagg caaccuccaa acauugaaaa uaagaguaca ugaaggauau   1080

gaggaauuca caauggucgg gcgaagagca acagccauuc uaaggaaagc aaccagaaga   1140

cugauccaac ugauagugag ugggaaagac gagcaaucaa ucgccgaggc aaucauagug   1200

gcaauggugu ucucacaaga ggauuguaug auaaaggcag ugagagguga uuugaacuuu   1260

gucaacagag cgaaccagcg gcuaaauccc augcaucaac uccugaggca uuuccaaaag   1320

gaugcaaagg ugcuguuuca aaacugggga auugaaccca uugacaaugu aauggggaug   1380

aucggaauau ugccugacau gacccccagc acagagaugu cauugagagg agugagaguu   1440

aguaaaaugg gaguagauga auauuccagu acugagagag uggucgugag uauugaucgc   1500

uucuugaggg uccgagacca gaggggaaac guacuccugu cuccugaaga gguuagugaa   1560

acacagggaa cagaaaagcu gacgauaaca uauucaucgu ccaugaugug ggagaucaau   1620

gguccggaau cagugcuagu uaacacauau caauggauca uuagaaauug ggaaacugua   1680

aagauucaau ggucccaaga cccuacaaug cuauacaaua agauggaguu ugaacccuuu   1740

caaucccuag ugccuaaagc ugccagaggc caauauagug gauucguaag ggugcuauuc   1800

cagcagaugc gugauguacu ggggacauuu gacacugucc aaauaauaaa gcuauuacca   1860

uuugcagcag ccccgccgga gcagaguagg augcaguucu cuucucuaac ugugaacgug   1920

agggguucag gaaugagaau aguugugaga ggcaauucuc cuguguucaa cuacaacaag   1980

gcaaccaaga ggcuuacagu acuuggaaag gaugcaggug cauugaugga agacccagau   2040

gagggaacag caggagugga aucugcggua uugagaggau uucugauucu gggcaaagaa   2100

gacaaaagau augggccagc auugagcauc aacgaauuga gcaaucuugc gaaaggggag   2160

aaggcuaaug uguugauagg gcaaggagac gugguguugg uaaugaaacg gaaacgggac   2220

ucuagcauac uuacugacag ucagacagcg accaaaagga uucggauggc caucaauuag   2280

 

 

<210>  18

<211>  2274

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的PB1基因

<400>  18

auggauguca auccgacuuu acuuuucuug aagugccagu gcaaaaugcu auaaguacca     60

cguucccuua uacuggagac ccuccauaca gccauggaac aggaacagga uacaccaugg    120

acacagucaa cagaacacau caauacucag aaaagggaaa guggacaacg aacacagaga    180

cuggagcacc ccaacucaau ccgauugaug gaccauugcc ugaggacaac gagccgagug    240

gguaugcaca aacggacugu guauuggaag caauggcuuu ccuugaagaa ucucacccag    300

ggaucuuuga aaacucgugu cucgaaacga uggaaauugu ucagcaaaca agaguggaua    360

aacugaccca aggucgccag accuaugacu ggacuuugaa uagaaaccaa ccggcugcua    420

cugcauuggc caacacuaua gagguauuca gaucgaaugg ccugacagcc aaugaaucag    480

gaagguugau agauuuccuc aaggacguaa uggaaucgau ggauaaggaa gaaauggaga    540

uuacaacaca uuuccagaga aagaggagag ugagggacaa caugaccaag aaaaugguca    600

cacagagaac aauaggaaag aaaaaacaaa gacugaacaa aaggagcuac cuaauaagag    660

cacugacauu gaacacaaug acaaaggaug cugaaagagg caaguugaaa aggagagcaa    720

ucgcaacacc cgggaugcaa aucagaggau ucguguauuu uguagaaaca cuagcgagga    780

gcaucuguga gaaacuugag caaucugggc ucccagucgg agggaaugag aagaaagcua    840

aauuggcaaa uguugugagg aagaugauga cuaauucaca ggauacagag cucuccuuca    900

caauuacugg agacaacacc aaauggaaug agaaucagaa cccccggaug uuucuagcaa    960

ugauaacaua caucacaaga aaccaaccag aaugguuuag aaaugucuua agcauugcuc   1020

cuauaauguu cucaaauaag auggcgagau uagggaaagg auacauguuc gaaaguaaga   1080

gcaugaaguu acggacacaa auaccagcgg aaaugcucgc aaauauugac cugaaauacu   1140

ucaacaaauc aacaagagag aaaaucgaga aaauaagacc ucuacugaua gauggcacag   1200

ccucauugag uccuggagug augauggcga ugucaacaug uugaguacag ucuuaggagu   1260

cucaauccuu aaucucggcc agaagaagua caccaaaaac acguauuggu gggacggacu   1320

ccaauccucu gaugacuucg cccucauagu gaaugcaccg aaucaugagg gaauacaggc   1380

aggaguggau agguucuaua gaaccugcaa auuaguuggg auaaacauga gcaagaagaa   1440

auccuacaua aaucggacag gaacauuuga auucacaagc uuuuucuacc gauauggauu   1500

cguagccaac uucaguaugg aguugcccag uuuuggagug ucugggauua augagucagc   1560

ugacaugagc auugguguua caguaauaaa gaacaauaug auaaacaaug accuuggacc   1620

agcaacagcu cagauggccc uucagcuguu uaucaaagac uacagauaca cauaccgaug   1680

ucacaggggu gauacgcaaa uucaaacgag gagagcauuc gagcugaaga agcuguggga   1740

gcagacccgu ucgaaggcag gauuguuggu uucagaugga gggccaaacc uguacaauau   1800

ccggaaccuc cacauucccg aggucugcuu gaaaugggaa uugauggaug aagacuacca   1860

aggcaggcug uguaauccuc ugaacccguu ugucagucau aaggaaauug auucugucaa   1920

caaugcugug gugaugccag cucacggccc agccaaaagc auggaguaug augccguugc   1980

aacuacacau ucauggauuc cuaagaggaa ucgcuccauu cucaacacca gccaaagggg   2040

gauucuugag gaugaacaga uguaccagaa guguugcaac cuauucgaaa aguucuuccc   2100

cagcaguuca uaccggaggc caguuggaau uuccagcaug guggaggcca uggugucuag   2160

ggcccgaauu gaugcacgaa uugacuucga aucuggaagg auuaagaaag aagaguuugc   2220

ugagaucaug aagaucuguu ccaccauuga agagcucaga cgcagcaaaa auag         2274

 

 

<210>  19

<211>  2151

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的PA基因

<400>  19

auggaagacu uugugcgaca augcuucaau ccaaugauua ucgagcuugc ggaaaagaca     60

augaaagaau auggggagga uccgaaaauc gaaacgaaca aauuugcagc uauaugcaca    120

cacuuagaag ucugcuucau guacucggau uuccauuuca uugacgaacg aggcgaauca    180

aaaauuguag aaucuggcga ugcaaaugca uuacugaaac accgauuuga gauagucgaa    240

gggagagacc gaacaauggc auggacagug gugaauagua ucugcaacac cacgggaguc    300

gagaaaccca aauuucuucc agaucuauau gacuacaaag agaaccgauu cauugaaauu    360

ggagugacgc ggagggaagu ccacaucuac uaccuagaaa aagccaacaa gauaaaauca    420

gagaagacac acauccacau uuucucauuc acuggagaag aaauggccac caaaucagau    480

uacacucuug augaggagag cagggcaagg aucaaaacca ggcuguucac cauaaggcag    540

gagauggcaa gcaggggucu augggauucc uuucgucagu ccgagagagg cgaagagaca    600

auugaagaaa gauuugagcu cacaggaacc augcgcaggc uugccgacca aagucuccca    660

ccgaacuucu ccagccuuga aaauuuuaga gccuaugugg auggauucga accgaacggc    720

ugcauugagg gcaagcuuuc ucagauguca aaagaaguga augcuagaau agagccauuu    780

cuaaggacaa caccacgucc ccucagauua ccuaaugggc cucccugcuc gcagcggucg    840

aaguucuugc ugauggaugc ucugaaauua agcauugagg acccgagcca ugaaggggag    900

gggauaccgc uauaugaugc aauaaagugc augaaaacau uuuucgguug gaaagagccc    960

cacauuauca aaccacauga gaaaggcaua aaccccaauu accuucuggc uuggaagcag   1020

gugcuggcag aaauucagga cauugaaaau gaagagagga ucccaaaaac aaagaacaug   1080

aagaaaacaa gccaauugaa gugggcgcuc ggugaaaaca uggcaccaga aaaaguggac   1140

uuugaagauu gcaaggaugu cagcgaucug aaacaguaug acagugauga gccagagccc   1200

agaucacuag cauguuggau ccagagugaa uuuaacaagg caugugaauu gacugauuca   1260

agcuggauag aacuugauga aauaggggaa gauguugccc caauugagca cauuuuucag   1320

augagaagga acuauuuuac agcggaggug ucccacugca gggcuacuga auacauaaug   1380

aagggagugu acauaaauac agcuuugcuc aaugcaucuu gugcggccau ggaugacuuu   1440

caacugauuc caaugauaag caaaugcaga accaaagaag gaagacggaa aacaaaccua   1500

uauggauuca uuauaaaggg aagaucucau uugaggaaug auacugacgu gguaaauuuu   1560

gugaguaugg aguuuucccu uaccgacccg agguuggaac cacauaaaug ggaaaaguac   1620

uguguucuag aaauagggga caugcuccug cgaacugcag auaggccaag ugucaagacc   1680

cauguuccuu guaugugaga accaauggga cuuccaaaau caagaugaaa ugggguaugg   1740

aaaugagacg cugccuucuu caaucucucc agcagauuga gagcaugauu gaagcugaau   1800

cuuccgucaa agagaaagac uugaccaaag aauucuuuga aaacaaauca gaaacauggc   1860

caauuggaga gucacccaag ggaguggagg aaggcuccau cggaaaggug ugcagaaccu   1920

ugcuggcaaa aucuguauuc aacagccuau augcaucucc acaacucgag ggguucucag   1980

cugaaucgag aaaacugcua cucauuguuc aggcgcuuag ggauaaccug gaaccuggaa   2040

ccuucgaucu uggagggcua uaugaagcaa ucgaggagug ccugauuaau gaucccuggg   2100

uuugcuuaau gcaucuugcu caacuccuuc cucacacaug cauagagaua g            2151

 

 

<210>  20

<211>  1683

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的HA基因

<400>  20

auggaaacaa uaucacuaau aacuauacua cuaguaguaa caguaagcaa ugcagauaaa     60

aucugcaucg gcuaucaauc aacaaacucc acagaaacug uagacacacu aacagaaaac    120

aaugucccug ugacacaugc caaagaauug cuccacacag agcauaaugg gaugcugugu    180

gcaacaagcu ugggacaucc ucuuauucua gacaccugua ccauugaagg acuaaucuau    240

ggcaauccuu cuugugaucu acuguuggga ggaagagaau ggucauauau cgucgagaga    300

ccaucagcug uuaacggauu guguuauccc gggaauguag aaaaucuaga agagcuaagg    360

ucacuuuuua guucugcuag uucuuaucaa aggauccaga uuuuuccaga cacaaucugg    420

aaugugucuu acagugggac aagcaaagca uguucagauu cauucuacag aagcaugaga    480

ugguugaccc aaaagaacaa cgcuuacccu guucaagacg cccaauacac aaauaaucaa    540

gaaaagaaca uucuuuucau guggggcaua aaucacccac ccaccgauac ugugcagaca    600

aaucuguaca caagaaccga cacaacaacg aguguggcaa cagaagaaau aaauaggacc    660

uucaaaccau ugauaggacc aaggccucuu gucaaugguu ugcagggaag aauugacuau    720

uauuggucgg uauugaaacc gggucaaaca cugcgaauaa gguccaaugg gaaucuaaua    780

gcuccauggu auggacacau ucuuucagga gagagccacg gaagaauccu gaagacugau    840

guaaaaaggg guagcugcac agugcaaugu cagacagaaa aagguggcuu aaacacaaca    900

uugccauucc aaaacguaag uaaguaugca uuuggaaacu gcucgaaaua cauuggaaua    960

aagagucuca aacuugcagu uggucugagg aaugugccuu cuagaucuag uagaggacua   1020

uucggggcca uagcaggauu cauagaggga gguuggucag gacuaguugc ugguugguau   1080

ggauuccagc auucaaauga ccaagggguu gguauggcag cagauagaga cucaacccaa   1140

aaggcaauug auaaaauaac auccaaagug aauaacauag ucgacaaaau gaacaagcag   1200

uaugaaauua uugaucauga auucagcgag guugaaacua gacuuaacau gaucaacaau   1260

aagauugaug aucaaaucca agacauaugg gcauauaaug cagaauugcu aguucugcuu   1320

gaaaaccaga aaacacucga ugagcaugau gcaaauguaa acaaucuaua uaauaaagug   1380

aagagggcau uggguuccaa ugcgguggaa gaugggaaag gauguuucga gcuauaccac   1440

aaaugugaug accagugcau ggagacaauu cggaacggga ccuacaacag gaggaaguau   1500

caagaggaau caaaauuaga aagacagaaa auagaggggg ucaaguugga aucugaagga   1560

acuuacaaaa uccucaccau uuauucgacu gucgccucau cucuugugau ugcaaugggg   1620

uuugcugccu ucuuguucug ggccaugucc aaugggucuu gcagaugcaa cauuuguaua   1680

uaa                                                                 1683

 

 

 

<210>  21

<211>  1498

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的NP基因

<400>  21

auggcgucuc aaggcaccaa acgauccuau gaacacgaug gaaacuggug gggaacgcca     60

gagugcuacu gagaucaggg caucuguugg aagaaugguu aguggcauug ggagauucua    120

cauacagaug uguacagaac ucaaacucag ugacaaugaa gggagguuga uccagaacag    180

uauaacaaua gagagaaugg uacucucugc auuugaugaa agaaggaaca gauaccugga    240

agagcauccc agugcgggga aggacccgaa gaaaacugga gguccaauuu accggagaag    300

agacgggaga ugggugagag agcugauccu guaugacaaa gaggagauca ggaggauuug    360

gcgucaagcg aacaauggag aggacgcaac ugcuggucuu acccaucuga ugauauggca    420

uuccaaucug aaugaugcca ccuaucagag aacgagagcu cucgugcgua cuggaaugga    480

uccccggaug ugcucucuga ugcaaggauc aacucucccg aggagaucug gagcugcagg    540

ugcagcagua aaggggauag ggacaauggu gauggaacug auucggauga uaaaacgagg    600

gaucaacgac cggaauuucu ggagaggcga aaauggaaga agaacaagga uugcauacga    660

gaggaugugc aacauccuca aagggaaauu ccaaacagca gcacaaagag caaugaugga    720

ucaagugcga gagagcagaa auccugggaa ugcugaaaua gaagaucuca uuuuucuggc    780

aaggucugca cucauccuga gaggaucagu ggcccauaag uccugcuugc cugcuugugu    840

guacggacuu gcaguggcca guggauauga cuuugagaga gaaggguacu cccugguugg    900

aauagauccu uuccgucugc uucaaaacag ccaggucuuu agucucauua gaccaaauga    960

gaacccagca cauaagaguc aauuagugug gauggcaugc cacucugcag cauuugagga   1020

ccuuaggguc ucaaguuuca ucaaagggac aagaaugguc ccaagaggac agcuauccac   1080

uagagggguu caaauugcuu caaaugagaa cauggaagca auagacucca auacucuuga   1140

acugagaagu agauauuggg cuauaagaac cagaagcgga gggaacacca accaacagag   1200

ggcgucugca ggacagauca gcguucaacc cacuuucucg guacagagaa aucuucccuu   1260

cgaaagagcg accauuaugg cagcauuuac aggaaauacu gaggguagaa cgucugacau   1320

gaggacugaa aucauaagaa ugauggaaag ugccagacca gaagaugugu cauuccaggg   1380

gcggggaguc uucgagcucu cggacgaaaa ggcaacgaaa ccgggggugc cuuccuuuga   1440

caugaauaau gaagggucuu auuucuucgg agacaaagca ggggaguaug acaauuaa     1498

 

 

<210>  22

<211>  1401

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的NA基因

<400>  22

augaauccaa aucagaagau aauagcaauu ggcucuguuu cucuaaccau ugcgauaaua     60

uguuuucuca ugcagauugc caucuuaaca acgaccauga cacuacacuu caggcagaau    120

gaaugcagca acccaucgaa uaaucaagug gugccaugug aaccuaucau aauagagagg    180

aacacagugc auuugaauag uacuaccaua gagaaggaaa uuuguccuaa aguggcagaa    240

uacaagaauu ggucaaaacc acaaugccaa auuacagggu ucgcuccuuu cuccaaggac    300

aacucaauua ggcuuucugc agguggagau aucuggguga caagagaacc uuaugugucg    360

ugcagucuug gcaaauguua ucaauuugca cuugggcagg gaaccacucu gaaaaacaag    420

cacucaaaug gcacuacaca ugauagaauu ccucacagaa cucuuuuaau gaaugaguua    480

ggugucccau uucauuuggg aaccaaacaa gugugcauag cauggucuag uucaagcugc    540

caugauggga aagcaugguu acauauuugu gugacugggg augauaaaaa ugcuacugcu    600

aguaucauuu augaugggau ucugguugac aguauugguu caugguccaa aaacauccua    660

agaacucagg agucagaaug cguuugcauc aauggaacuu gugcaguagu aaugacugau    720

ggaagugcau caggaaaggc ugacacuaga auauuauuca uaagagaggg aaaaauuaua    780

aauauuagcc cauugucagg aagugcucag cacguggagg aaugcuccug uuacccccgg    840

uauccugaag ucaggugugu uugcagagac aauuggaagg gcuccaauag gcccguucua    900

uauauaaaua uggcagauua uaguauugag uccaguuaug ugugcucagg acuuguuggc    960

gacacaccaa gagaugauga uagcucuagc agcagcaacu gcagagaccc uaauaacgaa   1020

agaggggccc caggagugaa agggugggcc uuugacgaug ggaaugacau uuggauggga   1080

cgaacaauca aaagugauuc acgcucaggu uaugagacuu uuagggucgu uaaugguugg   1140

accacggcua auuccaaguc acagauaaau aggcaaguca uaguugacaa ugacagcugg   1200

ucaggguauu cugguaucuu cucaguugaa ggcaaaaacu gcaucaacag guguuuuuau   1260

guggaguuga uaagagggag accacaggag accagagugu gguggacuuc aaacagcauc   1320

auuguauucu guggaaccuc agguacauau ggaacaggcu cauggccuga uggagcgaau   1380

aucaacuuca ugccuauaua a                                             1401

 

 

<210>  23

<211>  982

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的M基因

<400>  23

augagccuuc uaaccgaggu cgaaacguac guucucucua ucauuccauc aggcccccuc     60

aaagccgaga ucgcgcagag acuugaggau gucuuugcug ggaagaacac agaucuugag    120

gcucucaugg aauggauaaa gacaagacca auccugucac cucugacuaa ggggauuuua    180

ggguuugugu uuacgcucac cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgguuuguc    240

caaaacgccc uaaaugggaa cggagaccca aacaacaugg acagggcagu uaaauuauac    300

aagaagcuga agagggaaau gacauuucau ggagcaaagg aaguugcacu caguuacuca    360

acuggugcgc uugcuagcug caugggucuc auauacaaca ggaugggaac aguggccgca    420

gaaggggcuc uuggccuagu augugccacu ugugagcaga uugcugacgc ccaacaucgg    480

ucccacaggc aaauggcgac uacuaccaac ccacuaauua ggcaugagaa uagaauggua    540

cuagccagca cuacugcuaa ggcuauggag cagauggcug gaucaaguga acaggcagca    600

gaagccaugg aagucgcaag ucaggcuagg caaauggugc aggcuaugag aacagucggg    660

acucacccua gcuccaguac aggucuaaaa gaugaccuua uugaaaauuu gcaggcuuac    720

cagaaacgga ugggagugca acugcagcga uucaagugau ccucucguug uugcagcgaa    780

cguuauuggg auauugcacu ugauauugug gcuucuugau cgucuuuucu ucaaaugcau    840

uuaucgucgc uuuaaauacg guuugaaaag agggccuucu acggaaggag ugccugaguc    900

uaugagggaa gaauaucggc aggaacagca gaaugcugug gauguugacg auggucauuu    960

ugucaacaua gagcuggagu aa                                             982

 

 

<210>  24

<211>  838

<212>  RNA

<213>  H9N2禽流感病毒Y3中的NS基因

<400>  24

augaacucca acacuguguc aagcuuccag guagacugcu uucuuuggca uguccgcaaa     60

cgauuugcag accaagaacu gggugaugcc ccauuucuag accggcuucg ccgagaucag    120

aagucccuga gagggagaag cagcacucuu ggucuggaca ucagaacugc uacucgugaa    180

ggaaagcaua uaguggaacg gauuuuagag gacgagucag augaagcauu uaaaaugagu    240

auugcuucag ugccagcucc ccgcuaucua acugacauga cucuugaaga aaugucgaga    300

gauugguuaa ugcucauucc caaacagaaa gugacagggu cccuuugcau uagaauggac    360

caagcaauag uggacaaaaa caucacauug aaagcaaauu ucagugugau uuucaaucga    420

cuugaagccc ugauacuacu uagagcuuuu acggaagaag gagcaauugu gggcgaaauc    480

ucaccauuac cuucucuucc aggacauacu gacaaggaug ucaaaaaugc aauugggguc    540

cucaucggag gauuugaaug gaaugauaac acaguucgag ucucugaaac ucuacagaga    600

uucgcuugga gaagcagcga ugaggauggg agaccuccac ucucuacaaa guagaaacgg    660

gaaauggaga gaacagcuaa gccagaaguu cgaagaaaua agaugguuga uugaagaagu    720

acgacauaga uuaaagauua cggagaauag cuuugagcaa auaacuuuua ugcaagccuu    780

acaacuauug cuugaagugg agcaagagau aagaacuuuc ucguuucagc uuauuuaa      838

 

Claims (6)

1.一种分离的禽流感病毒，其基因组由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的RNA片段组成。

2.如权利要求1所述的一种分离的禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO：3118。

3.一种用于预防权利要求1或2所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于：含有灭活的权利要求1或2所述的禽流感病毒。

4.权利要求3所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将权利要求1或2所述的禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在10^9.6-10^9.8ELD50，HA价在1：256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；

b），一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备抗原液；

c)，一个制备油相佐剂的步骤；

d)， 一个制备疫苗水相的步骤；

 e)， 一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后, 再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。

5.如权利要求4所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的油相佐剂由白油 、司本-80 和硬脂酸铝配制混合而成。

6.如权利要求4所述的用于预防禽流感病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗原液中，吐温-80的终浓度在2%－5%之间，经充分溶解混合即为水相。