CN104845941B - 一种鸡传染性支气管炎病毒ibv‑k136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3d5、单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎病毒IBV‑K136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3D5、单克隆抗体及其应用。其中IBV‑K136毒株为地方流行的肾型传染性支气管炎病毒毒株、是通过筛选获得，以该毒株为抗原扩增后进行动物免疫，将免疫血清与骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞，利用该方法筛选出性能优异的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株3D5，再对细胞株3D5进行培养以大量表达单克隆抗体。利用上述流程制备的单抗效价高、抗原抗体反应速度快、特异性强，尤其适用于进一步制备鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断试剂盒，相应的检测方法可以是双抗夹心ELISA法或胶体金法等。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136、利用其制备的单克隆 抗体细胞株3D5、单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一株鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3D5、单克隆抗体及其应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是一种急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病由鸡传染性支气管炎病毒引起。以病鸡咳嗽、气管啰音、打喷嚏为特征，雏鸡最易感。尽管广泛使用传染性支气管炎弱毒疫苗和灭活疫苗，但由于该病血清型较多，型与型之间的交叉保护较弱以及新型毒株的不断出现，导致其防治较困难，严重威胁了我国养鸡业的发展。

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)为冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段单股正链RNA，本身具有感染性。基因组全长27nt左右(不同毒株略有不同)，共编码3种结构蛋白，分别为纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)，其中S基因是IBV抗原变异最主要的基因，在病毒血清学分类中起重要作用。N基因是IBV的最保守的基因，在IBV鉴别诊断中起重要作用。

针对IBV的检测方法目前主要有：病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR检测、环介导等温扩增技术等方法。其中以间接ELISA和PCR检测方法较为快速准确。间接ELISA方法具有检测成本低，灵敏度高，特异性好，适合大量样品等特点。但目前所建立的ELISA方法主要针对IBV抗体，针对IBV抗原的检测方法极少，该技术瓶颈有待突破。而要实现针对IBV抗原的检测方法，则需要性能优异的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体作为基础，相应的，就必须建立生产上述单抗的细胞株作，而能否构建适宜的细胞株又有赖于有效的方法及病毒毒株的特性。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一株适用于感染生物后制备单克隆抗体杂交瘤细胞株的鸡传染性支气管炎病毒，同时提供一种利用上述毒株制备的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、该抗体以及该抗体的应用。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus)IBV-K136，其保藏编号为CCTCC NO.V201320。

上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒抗体。

上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株。

利用上述一种鸡传染性支气管炎病毒IBV-K136制备的一种鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株3D5，其保藏编号为CCTCC C2014155。

一种鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体，上述细胞株3D5制备的。

该单克隆抗体可以用于制备鸡传染性支气管炎病毒检测试剂盒或鸡传染性支气管炎病毒检测试纸。

优选的，所述试剂盒对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法可以是ELISA法。

优选的，所述试纸对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法可以是胶体金法。

在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC NO.V201320和CCTCC C2014155两种生物材料的保藏单位均为“中国典型培养物保藏中心”，其地址为“湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内”，其中CCTCC NO.V201320的保藏日期为2013年6月28日，CCTCC C2014155的保藏日期为2014年9月4日。

在以上技术方案中，IBV-K136毒株为地方流行的肾型传染性支气管炎病毒毒株、是通过筛选获得，以该毒株为抗原扩增后进行动物免疫，将免疫血清与骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞，利用该方法筛选出性能优异的鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株3D5，再对细胞株3D5进行培养以大量表达单克隆抗体。利用上述流程制备的单抗效价高、抗原抗体反应速度快、特异性强，尤其适用于进一步制备鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断试剂盒，相应的检测方法可以是双抗夹心ELISA法或胶体金法等。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用到的实验材料，若无特殊说明，均为自常规渠道(如普通生化试剂商店)购买得到。

以下实施例中的生物材料来源如下：

IBV-K136株：2013年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO.V201320。

SPF鸡胚：购自山东省六一农场有限责任公司。

鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒(M41株)、鸡传染性支气管炎病毒(Gray株)、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性法氏囊病毒、鸡减蛋综合征病毒和禽白血病病毒均购自中国兽医药品监察所。

实施例1(单抗细胞株3D5的筛选以及单抗的制备)

1.1抗原的制备

将鸡传染性支气管炎病毒K136株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚尿囊液。将尿囊液差速离心具体方法如下：取-20℃冻存的病毒液融化后，5000g，4℃离心30min，弃沉淀取上清液，再14000g，4℃离心20min，弃杂蛋白，取上清液。然后进行超速离心：将上一步得到的上清液以66100g(TYPE60Ti，BeckmanL8-M)4℃离心1.5h，弃上清，沉淀加入2mLTEN缓冲液(50mM Tris-HCL、50mM NaCL、5mM Na₂EDTA、PH7.4)，并在无菌条件下降沉淀吹打使其分散、溶解。放入-70℃冰箱备用。

取少量浓缩后的病毒蛋白进行不同程度稀释，用紫外分光光度计测定病毒的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，使OD值在0.3-0.7间，再用公式“蛋白浓度＝1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀”计算出稀释后的浓度，最后乘以稀释倍数，获得纯化病毒含量。

1.2动物免疫

取适量的病毒液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/c小鼠，每只0.2ml；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。

1.3融合

将加强免疫后3天的小鼠，眼眶采血作为阳性血清，颈脱臼将小鼠致死，无菌打开腹腔取出脾脏，用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。选择生长状态良好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和制备好的脾淋巴细胞按1:5混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的无抗不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37℃静止10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃5％CO₂培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。

1.4杂交瘤细胞的筛选

通过间接ELISA检测的方法，对融合细胞上清液中的抗体进行检测。取经纯化并灭活后的抗原与碳酸盐缓冲液(pH9.0)按1:1000稀释。将此稀释液加入酶标反应板中，每孔100ul，置于4℃冰箱过夜或37℃温箱2小时。弃去液体用PBST洗液洗涤3次。拍干后每孔加入200ul封闭液，37℃温箱封闭2小时，弃去液体，用PBST洗液洗涤3次后拍干作为抗原包被板。

将融合细胞上清液加入抗原包被板中，37℃孵育1小时，同上用PBST洗液洗涤3遍；加入终浓度1:10000稀释的羊抗鼠HRP-IgG 50μl/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入TMB显色液50μl/孔，37℃反应10-15min；加入2M H₂SO₄50μl/孔终止反应。测定孔内的OD₄₅₀。用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白对照孔。

1.5杂交瘤细胞的亚克隆

用有限稀释法将间接ELISA方法检测出的阳性杂交瘤细胞吹下，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37℃5％CO₂培养箱培养7-10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3-4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时可以定株。本次试验获得一株3D5株，将其进行扩大培养和冻存。

1.6腹水的制备

取8周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的3D5株细胞，1×10⁶CFU/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16号针头从腹腔采集腹水，2500rpm离心10min，去除脂肪组织，将上清取出，-70℃保存备用。

实施例2(单抗特性鉴定)

2.1单抗腹水效价的测定

采用间接ELISA的方法，将所制得腹水先按1:1000稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同前。结果本株单抗效价为1：6.4*10⁴。

2.2单抗亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行。具体方法如下：酶标板内分别加入四种单抗腹水1:5000稀释100uL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、IgA亚类血清100μL/孔，每株单抗加每种亚类两孔，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入1:1000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100uL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色5-10min；用2M H₂S0₄100uL/孔终止反应；在450nm波长下测定OD值。以OD值明显高于其他孔者所加亚类血清为单抗亚类。结果本单抗为IgG₃。

2.33D5株单抗的特异性鉴定

将鸡传染性支气管炎病毒(K136株)、鸡传染性支气管炎病毒(H120株)、鸡传染性支气管炎病毒(4/91株)、鸡新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H9亚型(AIV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒(ALV)进行初步纯化并将其包被在96孔酶标板中按照实施例一中方法进行间接ELISA检测。结果如表1所示，表明纯化后的腹水只与鸡传染性支气管炎病毒(K136株)、传染性支气管炎病毒(M41株)和鸡传染性支气管炎病毒(Gray株)反应，其他均不反应。

表1 3D5株单抗与不同抗原特异性反应结果

表1中数值为ELISA实验OD值。

以上实施例中间接ELISA试验所需相关溶液配方如下：

洗涤液(PBST)：0.01M PBS(0.2g KH₂PO4、0.2g KCl、2.92g Na₂HPO₄、8.0g NaCl)。加0.5ml Tween-20加超纯水至1000ml。

封闭液：10％小牛血清PBS。

酶标抗体稀释液：4％小牛血清PBS。

显色液：进口TMB显色液。

终止液(2M H₂SO₄)：浓硫酸22.2ml、蒸馏水177.8ml。

实施例3(鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断试剂盒的制备)

以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试剂盒制备技术领域的公知技术制备得到鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断试剂盒，该试剂盒诊断原理为ELISA法。

实施例4(鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断胶体金试纸的制备)

以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试纸制备技术领域的公知技术制备得到鸡传染性支气管炎病毒抗原诊断胶体金试纸，该试纸的诊断原理为胶体金法。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体细胞株3D5，其保藏编号为CCTCC C2014155。

2.一种鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体，其特征是利用权利要求1所述的细胞株3D5制备的。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备鸡传染性支气管炎病毒检测试剂盒或鸡传染性支气管炎病毒检测试纸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述试剂盒对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法为ELISA法。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述试纸对鸡传染性支气管炎病毒的检测方法为胶体金法。