CN107034197B - 犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株f112及应用 - Google Patents

犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株f112及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F112，属于生物技术领域。本发明是运用淋巴细胞杂交瘤技术，用犬流感病毒流行毒株A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)制备免疫抗原，从中筛选出一株强效杂交瘤细胞株F112，对犬流感病毒的血凝抑制效价为212、中和效价为105。用F112单克隆抗体制备的犬流感预防治疗剂，用于预防治疗犬流感，有效率达到100％。强效F112单克隆抗体既可以用于犬流感的检测诊断又可以用于预防治疗，具有良好的生产应用前景。

Description

犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F112及应用
技术领域
本发明涉及一种犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，属于生物技术领域。
背景技术
犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引 起的犬呼吸道传染病。A型流感病毒感染谱较广，可感染人类和猪、马、禽类等 多种动物。犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)主要通过空气传播，但经 消化道或通过接触病毒污染的各种物品也是重要的传播途径。过去一般认为犬不 是A型流感病毒的易感动物，但近十多年来已陆续发现犬可被不同亚型的流感病 毒所感染。患犬常出现喷嚏、咳嗽、发热和流涕等临床症状，死亡率为1％～5％。 2004年有报道称在美国佛罗里达发现了犬被马源流感病毒H3N8亚型感染；2006 年华南农大首次从犬身上分离到H3N2亚型犬流感病毒；2007年韩国流行的H3N2 亚型犬流感病毒，被证明是禽源性的。另外，也有研究证明在犬猫体内分离到流 感病毒。2012年，在山东省的某个发病犬病料中分离到犬流感病毒，最终被鉴定 为1株重配的H5N2亚型流感病毒。目前，H3N2亚型犬流感病毒是中国犬群中流 行的主要亚型。犬流感病毒不仅可对犬的健康和养殖造成严重危害，也对公共卫 生安全造成潜在的严重威胁。
犬流感病毒在宿主体内可潜伏2～5d，大部分病犬表现出咳嗽、喷嚏、流涕 等主要症状，部分严重犬会出现体温升高，呼吸数增加的现象，且咳嗽能持续20 d左右。对处于早期病程的犬用广谱抗病毒药物可获得一定的治疗效果。病情较 轻时，出现柔和性的湿咳，部分病例出现干咳，同时流清鼻涕，当病情加重时， 鼻腔会出现黏稠的黄色脓性鼻涕，此时可能继发细菌感染。发病犬多数能在1～2 周逐渐康复，个别严重症状的病例会出现死亡，对死亡犬进行病理检查可观察到 气管炎、支气管炎等病理现象。少部分犬会出现隐性感染，即不表现临床症状， 但能够携带和传播病毒，因此，加强对犬流感病毒的检测与监控十分必要。
流感病毒已被证实可突破种间屏障，感染异种动物。伴随着我国人口老龄化 时代的到来，宠物犬和猫作为主要的伴侣动物，甚至成为许多家庭的“成员”。 宠物犬对于我国公共卫生管理、生物安全、人类精神生活、生命科学研究和野生 动物保护，都有着特殊的作用和重要影响。虽然目前尚未发现犬流感病毒感染人 类及其他动物，但从理论上说，犬不是没有可能作为中间宿主传播犬流感病毒， 一旦在犬群中广泛流行的H3亚型流感病毒发生变异，获得感染人的能力，有可 能引起流感病毒在人类的流行。因此，研究犬流感病毒的免疫预防与快速检测技 术具有十分重要的应用价值。
中国犬群中，H3N2亚型犬流感病毒是主要的流行亚型，尚无有效预防犬流 感的疫苗。对犬流感疫苗研究已取得一些进展。2009年，美国农业部门(USDA) 批准的H3N8亚型犬流感疫苗上市，可有效减少了病毒的传播。2012年，韩国针 对H3N2犬流感疫苗也已授权。尽管如此，疫苗接种仍有一定的局限性，在幼年、 老年及免疫力低下的犬群中疫苗接种有相当大的风险。
对犬流感治疗尚缺乏特异性的药物，以对症和对因治疗为原则，在发病过程 中犬的免疫力下降，容易引起继发性细菌感染，对发病早期的犬可用抗病毒药和 适量的广谱抗菌药物，较为严重的患犬在此基础上应进行支持疗法，补充能量， 及时使用退烧药物，避免造成机体内环境紊乱。发病过程中良好的护理也较为重 要，护理得当可有效缩短病犬的感染时间，并获得持久的免疫力。犬流感的总体 死亡率为1％～5％。
1975年，Kohler和Milstein两位科学家用绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾 细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，首次创立了杂交瘤细胞株并建立了制备单克隆抗 体的方法，并因此获得了诺贝尔奖。Kohler和Milstein用外源性抗原免疫小鼠，使 小鼠脾细胞能够分泌特异性的抗体，再与具有HGPRT代谢缺陷的SP2/0融合，加 入选择培养基，使只有融合成功的杂交瘤细胞才能继续传代培养。这种杂交瘤细 胞结合了两者的特性，既能分泌特异性抗体，又能无限传代。单抗具有均质性好、 与抗原结合的特异性强和效价高等优点。
在临床上，犬流感病犬采用抗病毒药物结合对症治疗的方法，可以有效减轻 症状促进康复，降低病死率。有人尝试犬流感病毒免疫血清，这种免疫血清源于 犬或异源动物，不仅抗体中和效价低，而且因免疫动物与抗原存在着批次差异， 不同批次的抗体效价不一致，更重要的是由于多种疫病可以通过血液传播，因此 存在着血源性疫病传播的巨大风险，产生严重的生物安全问题。目前，有关犬流 感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株已有报道，部分细胞株分泌的单克隆抗体对犬流 感病毒具有中和活性，对其应用价值没有进行研究。
血凝素(HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，参与病毒受体结合以及病毒入 侵靶细胞，因此针对HA具有中和活性的抗体是评价流感病毒保护性的标准。
本发明是运用淋巴细胞杂交瘤技术，用犬流感流行毒株 A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)制备免疫抗原，免疫BALB/C小鼠制备免疫脾 细胞，与SP2/0细胞融合，建立分泌抗犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库，从 中筛选出一株强效杂交瘤细胞F112株，生物学性能十分优良，注射BALB/C小鼠 腹腔诱生的腹水，对犬流感病毒的血凝抑制效价为212、中和效价为105。用F112 单克隆抗体建立的犬流感病毒夹心ELISA检测方法，对H3N2亚型犬流感病毒具 有良好的特异性，其敏感性与RT-PCR方法相当。用F112单克隆抗体制备的犬流感免疫预防治疗剂，用于临床预防治疗犬流感，有效率达到100％。F112单克隆 抗体既可以用于犬流感的检测诊断又可以用于预防治疗，具有良好的应用前景。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种分泌强效犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 其分泌的单克隆抗体用于H3N2犬流感的快速检测诊断及预防治疗。
技术方案
一种分泌强效犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株F112，该杂交瘤细胞于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保 藏编号为CCTCC NO：C201764，分类命名：杂交瘤细胞株F112。
用所述杂交瘤细胞株F112制备的单克隆抗体可以在制备犬流感病毒检测诊 断试剂中得到应用。
用所述杂交瘤细胞株F112制备的单克隆抗体也可以在制备犬流感预防或治 疗制剂中得到应用。
或者用所述单克隆抗体在制备犬流感病毒预防或治疗的药物或防治制剂组合 物中得到应用。
有益效果
本发明运用淋巴细胞杂交瘤技术，用犬流感流行毒株 A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)制备免疫抗原，建立分泌抗犬流感病毒单克 隆抗体杂交瘤细胞库，从中筛选强效杂交瘤细胞株。
用所述杂交瘤细胞株F112制备强效犬流感病毒单克隆抗体，再用所述的单克 隆抗体制备犬流感病毒的快速检测诊断及预防治疗制剂。
本发明的特点和优点如下：
1、本发明使用的BALB/c小鼠免疫抗原是用犬流感病毒流行毒株 A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)制备的，更针对中国的犬流感病毒流行现状。
2、本发明从建立的分泌犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库中筛选出的一株 强效杂交瘤细胞株F112，抗病毒活性强，对犬流感病毒的血凝抑制效价为212、 中和效价为105。
3、用F112单克隆抗体建立的犬流感病毒夹心ELISA检测方法，对H3N2亚 型犬流感病毒具有良好的特异性，其敏感性与RT-PCR方法相当，F112单克隆 抗体既可用于捕获抗体又可用于酶标抗体，可用于犬流感病毒的快速检测诊断。
4、用F112单克隆抗体制备的犬流感预防治疗剂，用于预防治疗犬流感，有 效率达到100％，具有良好的生产应用前景。
具体实施方式
(一)犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞F112株的建立
1、犬流感病毒免疫抗原的制备 将犬流感病毒流行毒株
A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)(王晓丽，等.一株H3N2亚型犬流感病毒的 分离与进化分析.中国动物传染病学报,2015,23(2):25-31)接种于9-11日龄SPF 鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)，2～3d后收取血凝效价大于26的鸡胚尿 囊液。将尿囊液以5000r/min离心30min后，取上清，再以8000r/min离心30min， 取上清。初步去除杂质后，再以30000r/min超速离心3h，弃上清，用适量PBS将 沉淀悬起，配制不同浓度的庶糖溶液，用移液器从高浓度到低浓度蔗糖溶液呈滴 状沿管壁缓慢加入到10mL离心管中，以减少加入时的冲击力，每个浓度的蔗糖 加入1.5mL，最后加入用PBS重悬的病毒1mL，以30000r/min转速离心2h，离心 结束后对光，肉眼可观察到在不同的浓度分界处有条带，用注射器吸取这些条带， 将吸取的溶液作100倍稀释后进行血凝试验，检测血凝效价，选取血凝效价最高的病毒带，紫外分光光度计测定蛋白浓度，制成犬流感病毒免疫抗原，-20℃保 存备用。
2、动物免疫 用纯化的犬流感病毒免疫抗原经腹腔注射免疫6～8周龄雌性 BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50μg/只。首免用等体积弗氏 完全佐剂(Sigma公司产品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂(Sigma 公司产品)乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，用间接ELISA方法 测定血清抗体效价，选取血清抗体ELISA效价＞106的小鼠，在融合前3d，用加 倍剂量的犬流感病毒免疫抗原，不加佐剂免疫。
3、脾淋巴细胞制备 取加倍剂量犬流感病毒免疫BALB/c小鼠，将小鼠脱颈致 死后全身浸泡于75％酒精中，浸泡5-10min作初步消毒，于超净台中无菌取出脾 脏，置于培养皿中，用移液管吸取无血清1640培养基将取出的脾脏洗涤数次。 将脾脏移入洁净灭菌研磨器中，在研磨器中加入无血清1640培养基，轻轻研磨， 将悬液过实验室自制滤网流入离心管中，室温下1500r/min离心10min，缓慢弃 去上清，加入10mL无血清1640培养基，轻轻吹打混匀。
4、细胞融合 采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小 鼠脾细胞按1:5～1:10的比例，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用手 掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热 至40℃的50％PEG4000(Sigma公司产品)1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内 加入15mL预热至37℃的无胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置10min， 1000rpm离心10min，弃上清，加入含15％胎牛血清(FCS)(Gibco公司产品) 和HAT(Sigma公司产品)的RPMI-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96 孔板上，于5％CO2培养箱培养。3d后补加含HAT(Sigma公司产品)和15％FCS (Gibco公司产品)的RPMI-1640培养基，5d后改用含HT(Sigma公司产品)和15％ FCS(Gibco公司产品)的RPMI-1640培养基，10d后换成含15％FCS(Gibco公司 公司产品)的RPMI-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5 时，取上清进行抗体检测。
5、杂交瘤细胞筛选方法的建立 用棋盘法来确定犬流感病毒抗原包被浓度，以 及选择出阳性、阴性血清最适的稀释比例。具体的实施方法如下：将犬流感病毒 抗原用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)从1：100开始做2倍倍比稀释至1：12800， 同时设置空白对照，4℃孵育过夜，用PBST洗涤3次，每次室温静置5min，在 纱布上拍干；PBST+10％小牛血清作为封闭液，每孔加入200μL/，用一次性PE 手套包起后放入37℃温箱；2h后取出用PBST洗涤3次，每次室温静置5min， 在纱布上拍干；将阴性血清和阳性血清从1：100稀释至3200倍，做2倍倍比稀 释，稀释液为封闭液，纵向各6列每孔100μL加入到拍干的板上，用一次性PE 手套包起后放入37℃温箱；1h后取出用PBST洗涤3次，每次室温静置5min， 在纱布上拍干。将本实验室制备的酶标二抗(羊抗鼠HRP-IgG)按1：2000稀释， 每孔100μL加入到按以上步骤拍干的板上，用一次性PE手套包起后放入37℃温 箱；1h后取出用PBST洗涤3次，每次室温静置5min，在纱布上拍干；在排干 的板上加入TMB显色液，每孔加入100μL，用一次性PE手套包起后放入37℃ 温箱；10min后取出每孔加入50μL 2M H2SO4终止。用酶标仪读取孔内的OD450nm值。结果判定：待检血清/阴性血清值>2.1(即P/N>2.1)时，判定为阳性择阳性读 值接近于1.0，且P/N比最大，对应的阳性孔作为该方法的抗原包被浓度和血清 稀释度。
6、阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 细胞融合后观察细胞集落，当细胞集落能 够用肉眼在板底观察到且培养基变黄时，无菌吸取100μL杂交瘤细胞培养上清， 进行第1次检测。吸取后将剩余液体弃掉，加入新的培养液，应用方阵确定的浓 度进行检测，同时设置阳性血清及空白对照，以P/N>2.1判断为阳性孔，否则判 断为阴性，对检测结果进行详细记录。再经2～3d后进行第2次检测，将2次检测 均为阳性的细胞株进行克隆。待克隆细胞长至肉眼可从板底观察到时，约12d左 右，选取单个细胞集落的上清液进行检测，对阳性细胞孔较强且为单集落的细胞 再次进行克隆，直到细胞培养板上所克隆的细胞检测全为阳性，再选取单个细胞 集落，将其移出到细胞瓶中扩大培养，进行传代，液氮冷冻保存。
7、犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库的建立 重复上述步骤(步骤1-6)，进 行多次的的抗原制备、动物免疫、脾淋巴细胞制备、细胞融合、阳性杂交瘤细胞 筛选和克隆化，建立了216株稳定分泌犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞库。
8、腹水的制备 将灭菌的液体石蜡腹腔注射8～10周龄的BALB/c小鼠(购自扬 州大学比较医学实验中心)，0.5mL/只，7天后，将杂交瘤细胞株注射入小鼠 腹腔，每只0.2mL(含2×106～5×106个杂交瘤细胞)，7～10天后采取腹部明显 鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min，收集上清，即为犬流感病毒单克隆抗 体，分装后于-20℃保存备用。
9、单克隆抗体血凝抑制活性测定
血凝试验(HA)：将96孔微量血凝反应板横置，每孔滴加25μL PBS作为 稀释液，取出纯化后的犬流感病毒，将其稀释100倍后，第一孔加入25μL，吹 打混匀，连续做2倍倍比稀释至第23孔，第24孔作为红细胞对照，各孔加入 25μL的新鲜制备的1％公鸡红细胞悬液，置于37℃30min左右观察结果。
血凝抑制试验(HI)：依据血凝试验观察的结果制备4单位病毒抗原，在反 应板上先加入25μL PBS作为稀释液，每排第一孔加入25μL抗体(细胞上清 与纯化后的腹水)，作2倍倍比稀释至第11孔，最后一孔设为红细胞对照，另 设置病毒对照，轻叩反应板混匀，室温反应30min左右，再加入50μL的红细 胞，温箱静置30min左右观察结果。
取犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库中的216株细胞培养上清液或腹水， 进行血凝抑制试验，其中的102株具有血凝抑制活性，F112株腹水对犬流感病 毒的血凝抑制效价为212。
10、单克隆抗体抗病毒活性测定
采用中和试验方法分析F112单克隆抗体的抗病毒活性。将 A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)种毒稀释106后接种鸡胚，2～3d后收取血凝 效价大于26的鸡胚尿囊液，将鸡胚尿囊液过0.22μm的滤器后感染MDCK细胞， 接种2-3d后，细胞会出现拉丝结网、明显的空泡的病变现象，此时收集细胞毒。 Karber法测定细胞毒TCID50。然后将病毒稀释成200TCID50，将纯化后的腹水作 4倍倍比稀释，用无血清的DMEM作为稀释液，与稀释的200TCID50细胞毒等 量混匀，加入长满单层的MDCK细胞培养板中，每孔100μL，每株单抗腹水作 8个重复，置37℃温箱中感作1h，同时设立正常细胞及100TCID50接毒作为对 照，1h后将孔中液体弃掉，加入维持液，置于37℃、5％CO2温箱中培养，每天 观察细胞，统计病变孔数，计算中和效价。
取犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库中的216株细胞培养上清液或腹水， 进行病毒中和试验，其中的68株具有中和活性。F112株腹水对犬流感病毒的中 和效价为105。
根据血凝抑制试验和中和试验测定结果，犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞 库中的F112株为强效杂交瘤细胞，对犬流感病毒的血凝抑制效价为212、中和效 价为105。
(二)犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F112的生物学特性分析
1、杂交瘤细胞株F112染色体分析 用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞株F112进行 染色体计数。待细胞生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为 0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4～5h。用5mL 37℃预温的0.075mol/L KCI低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30min，向其中加入新配制的固 定液(甲醇：冰醋酸为3:1)lmL，边滴加边混匀，1000rpm离心10min。弃上 清留细胞沉淀，用5mL固定液将细胞吹起，37℃作用30min，1000rpm离心10min， 重复上述操作一次。细胞沉淀用lmL固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液1滴， 滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液 染色10min，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染 色体数量为96条，而骨髓瘤细胞SP2/0的染色体的数量为59条，小鼠脾细胞染 色体数量为42条。结果表明，杂交瘤细胞株F112是骨髓瘤细胞SP2/0和免疫小 鼠脾细胞融合的杂交瘤细胞。
2、F112分泌单克隆抗体的稳定性测定 将杂交瘤细胞株F112在含10％胎牛血 清的RPMI-1640培养基(Gibco公司产品)中连续培养，传代50次、液氮冻存 与复苏试验，能够稳定分泌单克隆抗体。
3、单克隆抗体的亚类测定 用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(购于Thermoscientific公司)测定杂交瘤细胞株F112分泌单克隆抗体的亚类，结果显示，该 单克隆抗体亚类为IgMк。
4、单克隆抗体的特异性 采用间接ELISA试验方法。用低致病性禽流感病毒(H9N2)(孟芳,等.近20年中国部分地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒HA基因 遗传演化及其变异频率.微生物学报,2016,56(1):35-43)、犬瘟热(CDV)(毕振 威,等.非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达. 中国预防兽医学报，2011,33(8):625-629)、犬细小(CPV)(李月华，等.犬细小 病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达.中国兽医科学,2013, 43(10):991-998)、犬腺病毒1型(CAV-1)(王雷,等.犬腺病毒、犬细小病毒联合 PCR方法的建立与应用.病毒学报,2003,19(3):262-266)、犬冠状病毒(CCV)(廖 列如,等.犬冠状病毒的分离及鉴定.安徽农业科学,2007,35(30):9549-9551)和鸡 胚尿囊液包被酶标板，进行间接ELISA试验，F112株单克隆抗体只与犬流感病 毒H3N2亚型发生特异性反应，与其他病毒和鸡胚尿囊液不发生反应。
5、单克隆抗体的间接免疫荧光试验 实验在96孔细胞培养板中进行。提前1 天将MDCK细胞铺上96孔细胞培养板中，第2天观察MDCK细胞生长状态， 生长良好且密度在80％左右时将犬流感病毒A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) 接种到MDCK细胞，培养2～3d后，弃掉细胞培养液，用DMEM无血清培养液 洗2次，将无水乙醇放入-20℃预冷30min以上，再以每孔200μL加入到已接 种病毒或对照组细胞培养孔中，放入4℃冰箱固定细胞，20min后取出用PBS 洗3次，每次室温静置5min，在纱布上拍干；再向接种病毒或对照组细胞培养 孔中每孔加入100μL阳性杂交瘤细胞上清液，放入37℃温箱孵育1h，取出后 用PBS洗涤，洗涤方法同上。将FITC-羊抗鼠IgG抗体工作液按1：200稀释， 向接种病毒或对照组细胞培养孔中加入稀释后荧光二抗，每孔200μL，37℃温 箱孵育1h，同上洗涤。将拍干后的细胞板置于荧光显微镜下观察结果。F112单 克隆抗体与感染犬流感病毒的细胞在荧光显微镜下可看到明显的绿色荧光，而正 常MDCK细胞无绿色荧光，进一步证明单克隆抗体对犬流感病毒的特异性。
(三)F112株单克隆抗体夹心ELISA检测方法
1、F112单克隆抗体的标记 采用过碘酸钠法标记纯化的F112单克隆抗体。称 量5mg辣根过氧化物酶(HRP)充分溶解于0.5mL蒸馏水中，加入0.5mL新配 制的0.06M NaIO4水溶液，混匀后将其放置在4℃冰箱30min；加入0.16M乙二 醇水溶液0.5mL，室温混匀后静置30min；加入1mL浓度为5mg/mL的纯化单抗， 混匀后放入到透析袋中，将透析袋放入0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.5)中，置于 4℃层析柜中缓慢搅拌过夜。第2天吸出袋中液体，与0.2mL的5mg/mL NaBH4 溶液混匀后置于冰箱4℃；2h后取出缓慢加入体积相同的饱和硫酸铵，置于4℃ 冰箱2h，用4℃预冷的离心机12500r/min离心0.5h，弃上清后用2mL的0.02M PBS(pH7.4)将沉淀重悬后装入透析袋，在4℃层析柜中用0.02M PBS(pH7.4)溶液 缓慢搅拌透析过夜；次日，离心后收取上清，获得HRP标记的单克隆抗体 (HRP-F112)，再加入甘油至终浓度达到60％，分装-20℃冻存。
2、捕获抗体和酶标抗体工作浓度的确定 将纯化的F112单克隆抗体用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至8μg/mL，再依次作2倍倍比稀释，稀释至 0.5μg/mL，横向包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜后PBST洗涤3次拍干； 加入10％小牛血清PBST作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育2h，用PBST洗涤 3次；加入犬流感病毒抗原和正常细胞上清对照加入酶标板，同时设PBS空白对 照，100μL/孔，置于37℃温箱1h，用PBST洗涤3次；用封闭液将HRP-F112 稀释至1：800，再依次作2倍倍比稀释至1：12800，纵向每孔100μL加入酶标 板中，37℃1h，用PBST洗涤3次；每孔加入显色液100μL，37℃显色10min 后终止显色，测定OD450nm值。选择阳性值接近1.0，阴性值小于0.1，P/N值(阳 性OD450nm/阴性OD450nm)最大时对应的包被单克隆抗体浓度和酶标单克隆抗体稀 释度判定为两者的优化工作浓度。F112单克隆抗体既可用于捕获抗体又可用于 酶标抗体。
2、捕获抗体和酶标抗体工作浓度的确定 将纯化的F112单克隆抗体用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至8μg/mL，再依次作2倍倍比稀释，稀释至 0.5μg/mL，横向包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜后PBST洗涤3次拍干； 加入10％小牛血清PBST作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育2h，用PBST洗涤 3次；加入犬流感病毒抗原和正常细胞上清对照加入酶标板，同时设PBS空白对 照，100μL/孔，置于37℃温箱1h，用PBST洗涤3次；用封闭液将HRP-F112 稀释至1：800，再依次作2倍倍比稀释至1：12800，纵向每孔100μL加入酶标 板中，37℃1h，用PBST洗涤3次；每孔加入显色液100μL，37℃显色10min 后终止显色，测定OD450nm值。选择阳性值接近1.0，阴性值小于0.1，P/N值(阳 性OD450nm/阴性OD450nm)最大时对应的包被单克隆抗体浓度和酶标单克隆抗体稀 释度判定为两者的优化工作浓度。F112单克隆抗体既可用于捕获抗体又可用于 酶标抗体。
4、RT-PCR检测方法
参照A型流感病毒的通用引物(Hoffmann E,et al.Universal primer set forthe full-length amplification of all influenza A viruses.Archives ofVirology,2001, 146(12):2275-2289)，对M基因保守区1-400bp设计引物，进行RT-PCR检测。 引物序列：
M-F:5′ATGAGCCTTCTAACCGAGGTCG3′
M-R:5′TATTGTATATGAGGCCCATGCAAC3′
cDNA合成：待检样品取500μL，按Trizol Reagent的使用说明书(TaKaRa 公司产品)提取RNA。进行反转录：下游引物1μL、8μL RNA(2μg)、1μL dNTPs， 再加入0.5μL RNA酶抑制剂、0.5μL MLV反转录酶、5μL DEPC水、4μL 5×缓冲 液、42℃反应1h。
PCR扩增：以cDNA为模板，根据设计的引物对M基因进行扩增来鉴定。 PCR反应体系(25μL)：上下游引物各1μL、12.5μL PCR Mix(2×)、2μL cDNA。 8.5μL水。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃ 延伸45s，设置30次循环；72℃延伸10min。
5、临床样品检测 将采集到的34份临床样品处理后，用本试验优化的夹心 ELISA检测方法检测，23份样品为阳性，11份为阴性；用RT-PCR方法检测， 23份阳性，11份阴性，两种方法检测结果一致。表明F112单克隆抗体夹心ELISA 检测方法可用于临床样品的检测，用于犬流感病毒H3N2检测诊断，具有临床推 广应用价值。
(四)F112单克隆抗体预防治疗试验
1、试验动物 4周龄非免疫健康易感比格犬(犬流感病毒抗体阴性)，购自南 京安立默科技有限公司。
2、攻毒用强毒毒株 犬流感病毒流行毒株A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)(王晓丽，等.一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析.中国动物传染病学报, 2015,23(2):25-31)。用第5代鸡胚尿囊液，血凝效价26。
3、F112单克隆抗体预防治疗剂的制备 将液体石蜡注射入8～10周龄BALB/c 小鼠，7天后，将杂交瘤细胞F112株注射小鼠腹腔，每只注射2×106～5×106个杂交瘤细胞，7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000g，离心10min， 收集上清。单克隆抗体腹水经56℃、30分钟处理，离心，收集上清液，灭活补 体，过滤除菌，用PBS稀释至中和抗体效价1000，即为犬流感单克隆抗体预防 治疗剂，分装，置-20℃保存备用。
4、预防治疗试验 将11只4周龄非免疫健康易感比格犬随机分成四个组：预防 试验组3只、治疗试验组3只、单独感染组3只和对照组2只。预防试验组，先 肌肉注射F112单克隆抗体，剂量为0.5mL/kg，6小时后经鼻腔途径感染犬流感 病毒；治疗试验组，先经鼻腔途径感染犬流感病毒，待试验犬发病后，肌肉注射 F112单克隆抗体治疗，剂量为0.5mL/kg；单独感染组，经鼻腔途径感染犬流感 病毒，不治疗；对照组，不注射单克隆抗体，也不感染犬流感病毒，正常饲养。 将四个试验组隔离饲养，每日观察临床症状。试验结果：预防试验组和对照组的 犬均没有出现流感症状；治疗试验组的犬在感染犬流感病毒3日后，出现流感症 状，用F112单克隆抗体治疗5日后全部康复；而单独感染组的犬出现流感症状 持续7日以上。试验结果表明，用F112单克隆抗体制备的犬流感预防治疗剂， 可用于预防治疗犬流感，有效率达到100％，具有良好的推广应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F112及应用
<130> 0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> M-F
<222> (1)..(22)
<223>
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atgagccttc taaccgaggt cg 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> M-R
<222> (1)..(24)
<223>
<400> 2
tattgtatat gaggcccatg caac 24

Claims (5)

1.犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F112，该杂交瘤细胞株F112于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201764，分类命名：杂交瘤细胞株F112，该杂交瘤细胞株F112分泌单克隆抗体具有针对血凝素蛋白HA的血凝抑制活性和病毒中和活性。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株F112制备的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备犬流感病毒检测诊断试剂中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备犬流感预防或治疗制剂中的应用。
5.权利要求2所述单克隆抗体在制备犬流感病毒预防或治疗的药物或防治制剂组合物中的应用。
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