CN111849923B - 分泌抗犬瘟热病毒h蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2d12株 - Google Patents
分泌抗犬瘟热病毒h蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2d12株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分泌抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2D12株，属于生物技术领域。单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒(CDV)疫苗株发生特异性反应并具有病毒中和活性，与CDV野毒株不发生反应。用单克隆抗体2D12建立双抗体夹心ELISA方法鉴别检测CDV疫苗株或野毒株；用CDV疫苗株或野毒株的中和抗原表位建立间接ELISA方法鉴别检测CDV疫苗株或野毒株产生的抗血清；将CDV野毒株中和抗原表位与犬细小病毒VP2蛋白融合表达，免疫小鼠产生的抗血清可中和CDV野毒株和犬细小病毒，可用于疫苗制备。本发明单克隆抗体2D12、中和抗原表位为CDV野毒株与疫苗株的鉴别诊断试剂盒和犬瘟热病毒疫苗研制奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及分泌抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2D12株，属于生物技术领域。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种高度接触性、急性、发热性的传染病。自1760年在犬发生犬瘟热以来，犬瘟热病毒感染犬科(狗、野狗、狐狸、郊狼、豺狼、狼)、原蝇科(浣熊、鼬)、鼬科(黄鼠狼、雪貂、鱼、貂、臭鼬、獾、貂、水獭)、熊科(大熊猫)、猫科(狮子、豹子、猎豹、老虎)等许多动物。犬瘟热病毒还感染其它科目的重要动物，如偶蹄类、灵长类、啮齿动物和长鼻类。犬瘟热病毒感染的宿主非常多，在野生动物中存在跨物种感染、传播，在家养动物中，不同物种之间也存在相互交叉感染。另外，犬瘟热病毒对上皮细胞、淋巴细胞和神经细胞等很多细胞都有趋向性和感染性，因此犬瘟热病毒感染能引起包括呼吸道、消化道、尿道、淋巴系统、皮肤等全身系统性的临床症状。
CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，病毒粒子形态多样，呈现圆形、椭圆形或长丝状，直径为150-300nm。犬瘟热病毒的基因组为不分节段的负链RNA，野毒株全长15690nt，部分疫苗株为15616nt，基因组的3′端到5′端依次为3′端前导序列、核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、附着或血凝蛋白基因(H)、大蛋白基因(L)和5′端引导序列。病毒基因组由N蛋白包裹而被保护，并与P 蛋白和L蛋白发挥病毒基因组复制和转录的功能。同时，通过M蛋白与囊膜的H蛋白和F蛋白相连，组装成完整的病毒粒子。犬瘟热病毒H蛋白与细胞受体结合，促进病毒结合到宿主细胞膜上，然后与F蛋白介导病毒与细胞的融合，启动病毒的感染过程。犬瘟热病毒H蛋白利用不同的细胞受体感染各种类型的细胞。犬瘟热病毒疫苗株或者实验传代致弱的犬瘟热病毒弱毒株利用CD46受体感染细胞，而CDV野毒株H蛋白通过与SLAM 受体结合感染免疫细胞。而在不表达SLAM受体的上皮细胞上，CDV野毒株H蛋白通过与nectin-4受体结合而感染上皮细胞，另外，nectin-4受体在促进病毒从上皮细胞释放和扩散中起重要作用。犬瘟热病毒感染神经系统的星形胶质细胞，但是这类细胞并不表达SLAM和nectin-4受体，表明CDV能够利用其它受体感染神经细胞，这类细胞受体还需要进一步地鉴定。
犬瘟热病毒H蛋白是病毒侵袭宿主所必需的结构蛋白，也是病毒刺激机体产生中和抗体的主要抗原之一。但是，犬瘟热病毒H基因存在非常大的变异性(超过10％)。犬瘟热病毒H基因变异也导致了犬瘟热病毒抗原性变异，甚至是中和抗原表位的变异。这可能是近年来很多犬瘟热病毒疫苗免疫动物仍会发生本病的重要原因之一。在临床上，犬瘟热发病动物采用抗体结合对症治疗的方法进行治疗，犬瘟热病毒抗原变异而逃逸抗体的中和作用，也可能进一步影响抗体的治疗效果。然而，犬瘟热病毒H蛋白具体精确的中和抗原表位所知较少，中和抗原表位发生变异的情况仍然不清楚。目前，临床上使用的犬瘟热病毒疫苗株主要是犬瘟热病毒疫苗弱毒株，除了对病毒株的基因进行测序分析和鉴定外，缺少其他必要的简便、快速的检测方法鉴别、诊断犬瘟热病毒野毒株和疫苗株，影响了对犬瘟热的精准诊断和治疗。在评价犬瘟热病毒疫苗株的免疫效果时，要避免犬瘟热病毒野毒株自然感染产生的抗体，但是目前并没有可以鉴别诊断和区分犬瘟热病毒野毒株感染和疫苗免疫产生抗体的检测方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是针对目前临床缺少其他必要的简便、快速的检测试剂与方法鉴别、诊断犬瘟热病毒野毒株和疫苗株，影响了对犬瘟热的精准诊断和治疗问题，提供一种与疫苗株发生反应，而与野毒株不发生反应的抗犬瘟热病毒H蛋白特异单克隆抗体检测试剂。
技术方案
为达到以上目的，通过以下技术方案来实现的：
一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2D12株，该杂交瘤细胞株分类命名：杂交瘤细胞 2D12株，于2020年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C202062。
所述杂交瘤细胞2D12株制备的抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体2D12可以用来制备鉴别检测犬瘟热病毒疫苗株或野毒株的检测试剂。
用所述的单克隆抗体2D12作为抗体制备鉴别犬瘟热病毒疫苗株或野毒株的检测试剂，建立双抗体夹心 ELISA方法鉴别检测犬瘟热病毒疫苗株或野毒株。所述的单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒疫苗株发生特异性反应，并具有病毒中和活性，与CDV野毒株不发生反应。
所述的单克隆抗体2D12识别的犬瘟热病毒疫苗株H蛋白的中和抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，该中和抗原表位与所述的单克隆抗体2D12发生特异性反应。
所述的犬瘟热病毒疫苗株H蛋白中和抗原表位对应的犬瘟热病毒野毒株H蛋白的中和抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ ID NO.4所示，该中和抗原表位与所述的单克隆抗体2D12不发生反应。
用所述的犬瘟热病毒疫苗株或野毒株H蛋白的中和抗原表位可以制备鉴别犬瘟热病毒疫苗抗血清或野毒株抗血清的检测试剂。用所述的犬瘟热病毒疫苗株或野毒株的中和抗原表位作为抗原，建立间接ELISA方法鉴别检测犬瘟热病毒疫苗株或野毒株产生的抗血清。
用所述的犬瘟热病毒CDV野毒株H蛋白的中和抗原表位可以制备预防犬瘟热的疫苗。将犬瘟热病毒野毒株中和抗原表位与犬细小病毒VP2蛋白融合表达，免疫小鼠产生的抗血清可以中和犬瘟热病毒野毒株和犬细小病毒，可用于疫苗制备。
所述犬瘟热病毒疫苗株为CDV3型或Onderstepoort型犬瘟热病毒株，所述犬瘟热病毒野毒株为Asia-4型、 Asia-3型、Asia-2型、Asia-1型、Europe型、Europe2型、Arctic-like型、Rockborn-like型、America-2型或Africa 型犬瘟热病毒株。
有益效果
本发明以犬瘟热病毒CDV 851毒株为免疫原，运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了分泌抗犬瘟热病毒H蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中杂交瘤细胞2D12株分泌的单克隆抗体2D12与CDV 851毒株发生特异性反应，并具有中和作用，但是与CDVNJ(11)2毒株不发生反应，没有中和作用。进一步鉴定了该单克隆抗体所识别的中和抗原表位，分析了该中和抗原表位在不同犬瘟热病毒株H蛋白上的保守性和变异性。用该中和单克隆抗体、中和抗原表位在鉴别诊断犬瘟热病毒野毒株和疫苗株抗原和抗体以及研制犬瘟热病毒疫苗中进行了应用。本发明对于犬瘟热病毒诊断试剂和疫苗的制备具有十分重要的意义。
本发明提供的一株单克隆抗体与犬瘟热病毒疫苗株反应，而与犬瘟热病毒野毒株不反应。用该单克隆抗体可以鉴别诊断毒株，解决了目前临床缺少其他必要的简便、快速的检测试剂用于鉴别、诊断犬瘟热病毒野毒株和疫苗株，影响了对犬瘟热的精准诊断和治疗问题。
本发明制备了与犬瘟热病毒疫苗株发生反应，而与犬瘟热病毒野毒株不发生反应的抗犬瘟热病毒H蛋白特异单克隆抗体2D12检测试剂。基于上述中和单克隆抗体试剂建立的ELISA检测试剂盒，但不局限于该试剂盒，用该方法可以区分犬瘟热强毒株和弱毒株。
本发明提供了上述单克隆抗体作用的犬瘟热病毒H蛋白中和抗原表位，以及该中和抗原表位在不同犬瘟热病毒株之间的比较，发现中和表位在犬瘟热病毒强毒株上存在变异。犬瘟热病毒疫苗株的中和抗原表位序列是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、犬瘟热病毒强毒株的中和抗原表位序列是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
本发明提供一种基于上述中和抗原表位建立的ELISA检测试剂盒，但不局限于该试剂盒，用该方法可以区分犬瘟热强毒株和弱毒株感染产生的抗血清。
所述的犬瘟热病毒野毒株H蛋白的中和抗原表位可以用来制备预防犬瘟热的疫苗。将犬瘟热病毒野毒株中和抗原表位与犬细小病毒VP2蛋白融合表达，免疫小鼠产生的抗血清可以中和犬瘟热病毒野毒株和犬细小病毒，可用于疫苗制备。
附图说明
图1是用单克隆抗体2D12鉴定的犬瘟热病毒H蛋白的最小中和抗原表位。SEQ IDNO.1是CDV 851毒株H 蛋白中和抗原表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.2是CDV 851毒株H蛋白中和抗原表位的核酸序列；SEQ ID NO.3是CDVNJ(11)2毒株H蛋白中和抗原表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.4是CDV NJ(11)2毒株H蛋白中和抗原表位的核酸序列。
图2是免疫印迹(westernblot)分析单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒H蛋白的反应性。a是单克隆抗体2D12 与犬瘟热病毒CDV 851毒株和NJ(11)2毒株H蛋白的反应性。b是单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒CDV 851毒株H 蛋白不同截断体(174-185aa、186-197aa、237-248aa和274-285aa)的反应性。犬瘟热病毒H蛋白经SDS-PAGE 分离后转移到NC膜上，用单克隆抗体2D12作为一抗和HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗进行westernblot检测。 M：Marker；1：pGEX-4T-1/BL21；2：174-185aa/BL21；3：186-197aa/BL21；4：237-248aa/BL21；5：274-285aa/BL21。
图3是免疫印迹(westernblot)分析单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒H蛋白的反应性。单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒CDV 851毒株H蛋白精细表位(238-248aa、239-248aa、240-248aa、241-248aa、242-248aa、243-248aa、 237-242aa、237-243aa、237-244aa、237-245aa、237-246aa)的反应性。M：Marker；1：pGEX4T-1/BL21；2： 238-248aa/BL21；3：239-248aa/BL21；4：240-248aa/BL21；5：241-248aa/BL21；6：242-248aa/BL21；7： 243-248aa/BL21；8：237-242aa/BL21；9：237-243aa/BL21；10：237-244aa/BL21；11：237-245aa/BL21；12： 237-246aa/BL21。
图4是CDV 851毒株中和抗原表位的核苷酸序列与疫苗株(CDV3型)的比对结果。
图5是CDV 851毒株中和抗原表位的核苷酸序列与疫苗株(Onderstepoort型)的比对结果。
图6是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Asia-4型毒株的比对结果。
图7是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Asia-3型毒株的比对结果。
图8是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Asia-2型毒株的比对结果。
图9是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Asia-1型毒株的比对结果。
图10是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Europe型毒株的比对结果。
图11是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Europe2型毒株的比对结果。
图12是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Arctic-like型毒株的比对结果。
图13是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Rockborn-like型毒株的比对结果。
图14是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与America-2型毒株的比对结果。
图15是CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位的核苷酸序列与Africa型毒株的比对结果。
图16是双抗体夹心ELISA检测犬瘟热病毒抗原。CDV 851毒株和CDV NJ(11)2毒株进行10倍倍比稀释 (1:10-1:100000)。
图17是BSA-中和抗原表位(CDV 851毒株)间接ELISA检测犬血清抗体 1:疫苗免疫犬1；2：疫苗免疫犬2；3：疫苗免疫犬3；4：疫苗免疫犬4；5：阴性犬；6：阴性犬；7：NJ(11)2 攻毒犬；8：CDV野毒株感染犬；9：2D12细胞上清；10：2D12腹水(稀释1000倍)；11：sp2/0细胞培养上清
图18是BSA间接ELISA检测犬血清抗体
1:疫苗免疫犬1；2：疫苗免疫犬2；3：疫苗免疫犬3；4：疫苗免疫犬4；5：阴性犬；6：阴性犬；7：NJ(11)2 攻毒犬；8：CDV野毒株感染犬；9：2D12细胞上清；10：2D12腹水(稀释1000倍)；11：sp2/0细胞培养上清
图19是纯化的CDV抗原间接ELISA检测犬血清抗体
1:疫苗免疫犬1；2：疫苗免疫犬2；3：疫苗免疫犬3；4：疫苗免疫犬4；5：阴性犬；6：阴性犬；7：NJ(11)2 攻毒犬；8：CDV野毒株感染犬；9：2D12细胞上清；10：2D12腹水(稀释1000倍)；11：sp2/0细胞培养上清
生物保藏
杂交瘤细胞2D12株，于2020年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学邮编： 430072，保藏编号为CCTCC NO：C202062；分类命名：杂交瘤细胞2D12株。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施案例1：单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.CDV抗原的制备以CDV 851毒株(毕振威等,Development ofCDV-specificmonoclonal antibodies for differentiation ofvariable epitopes ofnucleocapsidprotein.Veterinary Microbiology,2017,211:84-91.)接种于Vero 细胞大量培养。根据国家发明专利(王永山等，一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株.国家发明专利号ZL201210081170.8)的方法纯化和制备CDV抗原。
2.动物免疫将纯化的CDV 851毒株用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，腹腔注射免疫6-8周龄雌性 BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50μg/只。以后每隔14d用等体积弗氏不完全佐剂(Sigma 公司)进行乳化，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，测定血清抗体效价。
3.细胞融合根据国家发明专利(毕振威等，一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物，国家发明专利号ZL201310036576.9)的方法，采用PEG4000(Sigma公司)进行细胞融合。
4.杂交瘤细胞的筛选用纯化的CDV 851株抗原作为包被抗原，间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株。
5.杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法，对筛选的阳性杂交瘤细胞株进行克隆，至少克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性。通过筛选和克隆，获得分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞 2D12株，进行扩大培养，液氮冻存。
6.腹水的制备将液体石蜡腹腔注射8-10周龄的BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.5mL/ 只，7d后将分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，每只小鼠注射0.2mL(含5×106个杂交瘤细胞)，7-10d后收集小鼠腹水，3000×g离心10min，收集上清，分装后于-20℃保存备用。
7.单克隆抗体的间接免疫荧光试验将Vero细胞铺在24孔细胞培养板中，同步接种犬瘟热病毒CDV 851株，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL/孔，4℃固定30min，用PBS洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞培养上清液，200μL/孔，37℃孵育1h，PBS 洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(购买于武汉博士德生物工程有限公司)，200μL/ 孔，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体2D12与CDV 851毒株感染的vero细胞反应，产生绿色荧光，而与正常vero细胞无荧光。
8.病毒中和试验测定CDV 851株的TCID50，确定其病毒毒价。采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将10倍系列稀释的单克隆抗体2D12小鼠腹水分别与等体积含200TCID50的 CDV 851株悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立 CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5％CO2温箱培养，5-7d后观察结果。结果发现杂交瘤细胞株2D12制备的单克隆抗体腹水对CDV 851毒株的中和效价达到1:106。
9.单克隆抗体的亚类测定按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(购买于Thermoscientific公司)操作说明书，测定杂交瘤细胞2D12株分泌的单克隆抗体亚类为IgG1κ。
10.单克隆抗体的效价测定
用间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞2D12株培养上清ELISA 效价为103，腹水ELISA效价107。
实施案例2：单克隆抗体与不同CDV毒株的反应性
将CDV851毒株、NJ(11)2毒株(毕振威等，Phylogenetic analysis ofcaninedistemper virus in domestic dogs in Nanjing,China.Archives ofVirology,2015,160(2):523-527.)的H基因克隆到真核表达载体pCAGGS载体上(LMAI-BIO公司)，构建pCAGGS-Flag-HA真核表达质粒，并转染293T细胞，24h后收获细胞样品，进行Western blot实验，用单克隆抗体2D12作为一抗，用HRP标记的羊抗鼠抗体(美国KPL公司)作为二抗，检测单克隆抗体2D12与这两个毒株的反应性。结果显示，单克隆抗体2D12与CDV851毒株H蛋白发生特异性反应，而与NJ(11)2毒株不发生特异性反应(如图2a所示)。
实施案例3：中和抗原表位的鉴定
根据CDV 851毒株H蛋白的不同区段设计引物，并在两端加上同源臂，采用同源重组的方法，克隆到 pGEX4T-1原核表达质粒(Amersham公司)，转化Ecoli BL21感受态细胞(擎科生物科技有限公司)，构建了 pGEX-4T-1/BL21、pGEX-(174-185aa)/BL21、pGEX-(186-197aa)/BL21、pGEX-(237-248aa)/BL21和pGEX- (274-285aa)/BL21重组菌。将以上菌株用IPTG诱导后，进行SDS-PAGE和Western blot检测，用单克隆抗体 2D12作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(美国KPL公司)作为二抗。结果显示，单克隆抗体2D12株与pGEX- (237-248aa)/BL21发生特异性反应，而与空载体和其它四个片段没有发生特异性反应(如图2b所示)，表明，单克隆抗体2D12识别CDV 851毒株H蛋白的237-248aa片段。为了进一步鉴定单克隆抗体2D12识别CDV 851毒株H蛋白的精确表位，将237-248aa进一步进行截断，构建了pGEX-4T-1/BL21、238-248aa/BL21、 239-248aa/BL21、240-248aa/BL21、241-248aa/BL21、242-248aa/BL21和243-248aa/BL21重组菌，以及237-242aa/BL21、237-243aa/BL21、237-244aa/BL21、237-245aa/BL21、237-246aa/BL21、237-247aa/BL21重组菌。将以上重组菌株用IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE和westernblot分析，用单克隆抗体2D12株作为一抗， HRP标记的羊抗鼠IgG(美国KPL公司)作为二抗。结果表明，单克隆抗体2D12识别的CDV 851毒株H蛋白的最小中和表位是238-244aa(图3)。
实施案例4：中和抗原表位在不同犬瘟热病毒株上的保守性和变异性分析
根据H基因，犬瘟热病毒分为Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4、Europe1/SouthAmerica1、Europe wild-life、 Arctic、America-2、Africa、America-1(Vaccine)、Rockborn-like等基因型(毕振威等,Phylogenetic analysis ofcanine distemper virusin domestic dogs,Arch Virol,2015:160:523-527)。犬瘟热病毒America-1(Vaccine)基因型毒株分为CDV3型和Onderstepoort型，而CDV 851毒株属于CDV3型(毕振威等,Development ofCDV-specific monoclonal antibodies for differentiation ofvariable epitopes of nucleocapsid protein.Veterinary Microbiology, 2017,211:84-91.)。抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体2D12与CDV 851毒株反应，识别该毒株中和抗原表位的核苷酸序列是712GATATAGAACGGGAGTTCGAC732，氨基酸序列是238DIEREFD244。用DNAstars软件对该中和抗原表位在不同犬瘟热病毒株上的保守性和变异性进行分析，CDV851毒株中和抗原表位氨基酸序列在属于CDV3型中的25个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)中未发生变异，完全一致(图4)。在属于Onderstepoort型的33个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)的核苷酸序列是 712GATATAGAAAGAGAGTTCGAC732，发生C721A和G723A突变，其中4个毒株(BJ16C8、BJ16C9、 BJ16C0和BJ17C7)核苷酸序列是712GATATAGAAAGAGAGTTTGAC732，发生C721A、G723A和C729T 突变，但是这些突变并没有影响氨基酸序列，仍然是238DIEREFD244，仅仅GZ0804毒株的核苷酸序列是712GATATAGAAAGAGAGTACGAC732，发生C721A、G723A和T728A突变，氨基酸序列是238DIEREYD244 (图5)。以上结果表明，单克隆抗体2D12所识别的中和抗原表位在犬瘟热病毒疫苗毒株上高度保守，该中和单克隆抗体能够识别犬瘟热病毒疫苗株。
单克隆抗体2D12不能识别CDVNJ(11)2毒株，因为其识别的中和抗原表位在该毒株上发生变异，核苷酸发生G712T、A717T和C721G突变，核苷酸序列是712TATATTGAAGGGGAGTTCGAC732，氨基酸发生 D238Y和R241G突变，氨基酸序列是238YIEGEFD244。CDVNJ(11)2毒株在基因进化树上属于Asia-4型犬瘟热病毒(毕振威等,Phylogenetic analysis of canine distemper virus in domestic dogs,Arch Virol,2015:160:523-527)，比较了该基因型的17个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)的核苷酸序列，其中有 15个毒株与CDVNJ(11)2毒株的完全一致，而NJ(12)4(KJ437596)和C11(KY774571)的毒株的核苷酸序列是712TACATTGACGGGGAGTTCGAC732，氨基酸序列是238YIDGEFD244(图6)。
在Asia-3型犬瘟热病毒中的2个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)发生G721A和G722A突变，氨基酸序列是238YIEKEFD244，发生了R241K突变(图7)；Asia-2型犬瘟热病毒中的15个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)中有14个毒株核苷酸是712TATATTGAAAGGGAGTTCGAC732，氨基酸序列是 238YIEREFD244，与CDVNJ(11)2毒株的氨基酸是一致的，而R11-JB-017(JQ319393)毒株核苷酸序列是712TATATTGAAAGGGAGTTCTAC732，氨基酸序列是238YIEREFY244(图8)。中国流行的犬瘟热病毒株主要是Asia-1型，比较了CDVNJ(11)2毒株的中和抗原表位在Asia-1型毒株上的变异情况。Asia-1型55个犬瘟热病毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)中有40个犬瘟热病毒株的中和抗原表位(核苷酸序列和氨基酸序列)与CDVNJ(11)2毒株一样，剩下15个毒株中有7个毒株的核苷酸发生变异，但是氨基酸没有改变，只有其余8个毒株的核苷酸和氨基酸都发生了改变(图9)。Europe型犬瘟热病毒的8个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)发生T714C突变，但是氨基酸序列没有发生改变(图10)。在Europe2型犬瘟热病毒的 6个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)中有2个毒株与CDVNJ(11)2毒株是完全一致的，而4个毒株发生G726A突变，但是并不影响氨基酸序列(图11)。在Arctic-like型犬瘟热病毒中的9个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)与CDVNJ(11)2毒株是完全一致的，而CDV2784-2013毒株核苷酸发生G730A突变，导致氨基酸发生D243N突变(图12)。CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位在Rockborn-like型犬瘟热病毒中的4 个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)上未发生变异，核苷酸序列和氨基酸序列完全一致(图13)。 America-2基因型犬瘟热病毒的5个毒株(公知公用，毒株来源及编号见表1)中的4个毒株H蛋白中和抗原表位与CDV NJ(11)2毒株相同，而另外1个毒株A75-17毒株核苷酸发生A725G突变，导致氨基酸为 238YIEGGFD244(图14)。CDVNJ(11)2毒株中和抗原表位在Africa型犬瘟热病毒株上未发生变异，是一致的(图15)。综合以上结果，几乎所有犬瘟热病毒野毒株H蛋白上的中和抗原表位与CDVNJ(11)2毒株上的一致，具有相对保守性，表明单克隆抗体2D12不能识别犬瘟热病毒野毒株。
实施案例5：双抗体夹心ELISA鉴别检测犬瘟热病毒抗原
用HiTrapTM Protein G亲和层析柱纯化单克隆抗体2D12。单克隆抗体2D12小鼠腹水3000rpm离心10min，去除沉淀和石蜡。用bindingbuffer平衡层析柱，加入稀释的小鼠腹水到层析柱中，再用bindingbuffer洗脱杂蛋白。最后用elutionbuffer将单克隆抗体洗脱下来，并加入适量1M pH9.0的Tris-HCl。分光光度计测纯化后单克隆抗体的蛋白浓度，用SDS-PAGE电泳分析纯化效果，-20℃保存备用。釆用过碘酸钠法标记纯化的单克隆抗体。称取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新配制的0.06MNaIO4水溶液0.5mL，混匀置4℃冰箱30min；加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL，室温放置30min，加入5mg已纯化的单克隆抗体1mL，混匀，装入透析袋，在 0.05MpH9.5碳酸盐缓冲液中缓慢搅拌透析6h或过夜使之结合，把液体吸出来，并加入NaBH4溶液(5mg/mL) 0.2mL，4℃冰箱放置2h；加入等体积饱和硫酸铵，4℃冰箱放置2h后，12000rpm离心30min；将沉淀物溶于2mL 0.02MpH7.4 PBS中，透析过夜；次日，如有沉淀，则离心除去，即成酶抗体结合物；加入等量的用PBS配成的60％甘油，分装-20℃保存。
将纯化的单克隆抗体2D12以5μg/mL的浓度包被ELISA板条，100μL/孔，4℃孵育过夜(大于12h)，PBST 洗3遍，每遍5min。用含10％小牛血清的PBST在37℃封闭2h，200μL/孔，PBST洗3遍，每遍5min。将CDV 851 毒株(105TCID50/0.1mL)和CDVNJ(11)2毒株(105TCID50/0.1mL)进行10倍倍比稀释，每个稀释度加到ELISA 板中，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗3遍，每遍5min。加入HRP标记的单克隆抗体2D12(按1:2000稀释) 进行反应，37℃作用1h，PBST洗3遍，每遍5min。每孔加入50μl TMB显色底物，避光孵育5-10分钟，然后每孔加入50μl2M H2SO4终止反应，测定OD450。用单克隆抗体2D12建立的双抗体夹心ELISA方法可以特异性地检测CDV 851毒株，而不能检测犬瘟热病毒CDV NJ(11)2毒株(图16)。当CDV 851毒株稀释100000倍之后，检测结果为阴性，表明单克隆抗体夹心ELISA方法最低检出CDV的病毒量为10TCID50/0.1mL(图16)。用单克隆抗体夹心ELISA方法检测犬细小病毒(CPV)(李月华等.犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达.中国兽医科学,2013,43(10):991-998.)、犬流感病毒(CIV)(王晓丽等.一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析.中国动物传染病学报,2015,23(2):32-40.)、犬腺病毒(CAV)(罗国良等.犬腺病毒间接免疫荧光检测方法的建立.特产研究，2008,10-12)，结果均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。
实施案例6：间接ELISA方法鉴别检测犬瘟热病毒血清抗体
在南京金斯瑞有限公司合成了BSA偶联的CDV 851毒株H蛋白中和抗原表位多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.ID NO.1所示。用合成的BSA-表位多肽建立间接ELISA方法检测单克隆抗体2D12、犬瘟热病毒疫苗免疫犬和野毒株感染犬的血清。将合成的BSA-抗原表位多肽(10μg/ml)、BSA(10μg/ml)和纯化的CDV 851毒株抗原(10μg/ml)用包被液分别包被于96孔ELISA板，100μL/孔，4℃孵育过夜(大于12h)，PBST洗3遍，每遍5min。用含10％小牛血清的PBST在37℃封闭2h，200μL/孔，PBST洗3遍，每遍5min。每孔加入用含10％小牛血清的PBST稀释的犬血清、单克隆抗体2D12腹水以及杂交瘤细胞2D12株培养上清，37℃作用1h，100μL/孔，PBST洗3遍，每遍5min。每孔加入用含10％小牛血清的PBST稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(美国KPL 公司)或羊抗犬IgG抗体(博奥森公司)，37℃作用1h，100μL/孔，PBST洗5遍，每遍5min。最后每孔加入50μl TMB显色底物，避光孵育5-10分钟，然后每孔加入50μl 2MH2SO4终止反应，测定OD450。结果显示，包被的 BSA-中和表位多肽可以与杂交瘤细胞2D12株上清液和单克隆抗体2D12腹水、疫苗免疫犬血清发生特异性反应，而不能与犬瘟热病毒野毒株感染犬血清、CDV NJ(11)2毒株感染犬血清发生特异性反应(图17)，而偶联蛋白BSA与上述样品均不发生特异性反应(图18)。用纯化的CDV 851毒株抗原建立间接ELISA方法可以检测杂交瘤细胞2D12株上清液和单克隆抗体2D12腹水、疫苗免疫犬血清和犬瘟热病毒野毒株感染犬血清、 CDVNJ(11)2毒株感染犬血清(图19)。以上结果表明用CDV 851毒株H蛋白的中和抗原表位建立间接ELISA 方法，可区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株产生的抗体。
实施案例7：中和抗原表位免疫保护试验
将CDVNJ(11)2毒株H蛋白的中和抗原表位基因序列(如SEQ ID NO.4所示)插入犬细小病毒JS12株 (李月华等.犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达.中国兽医科学,2013,43(10): 991-998.)的VP2基因的5′端，构建重组的中和表位-VP2蛋白基因，并将该基因克隆连接到原核表达载体 pET28a(+)质粒中，构建重组质粒pET-中和表位-VP2，然后转化Ecoli BL21(DE3)感受态细胞(诺唯赞生物科技有限公司)，用IPTG进行诱导表达，用His标签镍柱His-Bind Resin(Novagen)对重组蛋白进行纯化。将纯化的中和表位-VP2蛋白接种8-10周龄BALB/C小鼠(扬州大学比较医学实验中心)。腹腔注射 50μg/只，初次免疫使用的是弗氏完全佐剂(Sigma)。每隔两周用弗氏不完全佐剂(Sigma)以同样抗原剂量加强免疫，共三次。采集小鼠血清，进行病毒中和实验。结果显示，表达的重组中和表位-Vp2蛋白能刺激机体产生CDV和CPV抗体，对CDVNJ(11)2毒株的中和效价为1:64，对CPV JS12毒株的中和效价为1:512，而免疫前血清和对照血清则没有中和能力。表明，CDVNJ(11)2毒株H蛋白中和表位用于制备CDV新型疫苗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
表1 GenBank中注册的犬瘟热病毒株序列
SEQ ID NO.1：238DIEREFD244
SEQ ID NO.2：712gatatagaacgggagttcgac732
SEQ ID NO.3：238YIEGEFD244
SEQ ID NO.4:712tatattgaaggggagttcgac732 。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 分泌抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2D12株
<141> 2020-07-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 犬瘟热病毒(canine distemper virus)
<400> 1
Asp Ile Glu Arg Glu Phe Asp
1 5
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 犬瘟热病毒(canine distemper virus)
<400> 2
gatatagaac gggagttcga c 21
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 犬瘟热病毒(canine distemper virus)
<400> 3
Tyr Ile Glu Gly Glu Phe Asp
1 5
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 犬瘟热病毒(canine distemper virus)
<400> 4
tatattgaag gggagttcga c 21
Claims (4)
1.一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2D12株，该杂交瘤细胞株分类命名：杂交瘤细胞2D12株，于2020年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C202062，该杂交瘤细胞2D12株制备的犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体2D12识别的抗原表位多肽是犬瘟热病毒H蛋白第238-244位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.用权利要求1所述杂交瘤细胞2D12株制备的抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体2D12。
3.用权利要求1所述的单克隆抗体2D12制备的鉴别犬瘟热病毒疫苗株检测试剂，其特征在于，所述犬瘟热病毒疫苗株为CDV3型或Onderstepoort型犬瘟热病毒株。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂单克隆抗体2D12与犬瘟热病毒疫苗株发生特异性反应，并具有病毒中和活性，与CDV野毒株不发生反应。
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| GR01 | Patent grant | ||
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