CN107630024B - 编码h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

编码H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用。本发明公开了一种编码禽流感病毒血凝素蛋白的基因，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。所述基因可以用于制备H5亚型禽流感病毒DNA疫苗。所述DNA疫苗不仅对同源HA基因供体毒株的攻击提供100％的免疫保护，还能对异源H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒的致死性攻击提供完全的免疫保护。

Description

编码H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码H5亚型编码禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用、具体涉及一种编码H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的基因及其应用。

背景技术

近年来，H5亚型高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian influenza，HPAI)给一些国家的家禽养殖业、甚至是整个国民经济都造成了巨大的损失。H5亚型HPAI的爆发同样对公共卫生安全构成了严重的威胁，截至2017年4月已经确诊了858个人感染H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)的病例，其中453个死亡病例。

AIV变异频繁，病毒表面糖蛋白血凝素HA基因是病毒基因组中变异率最高的分子，也是决定其抗原性的最主要的分子，并且在自然宿主中不断的发生着抗原漂移和抗原转变的进化和变异。根据AIV病毒HA蛋白基因的遗传演化关系，国际上将H5亚型AIV分为10个不同的基因进化分支(clade 0～9)，并衍生出许多亚分支。我国自1996年分离到第一株H5N1亚型AIV A/Goose/Guangdong/1/1996(GS/GD/1/96)(分属于clade 0分支病毒)以来，陆续监测到的AIV也呈现出了遗传多样性和复杂性，分析发现不同的AIV分属于clade0、clade2.2、clade2.3.1、clade2.3.2、clade2.3.2.1、clade2.3.3、clade2.3.4、clade7.1、clade7.2、clade8、clade9等多个分支，并且在不断的发生着进化和变异。2013年末以来我国分离到了clade 2.3.4.4分支的病毒，目前我国H5亚型毒株主要为clade 2.3.4.4分支的病毒，还有一部分为clade 2.3.2的病毒(参见图1)。

疫苗免疫是禽流感防控的关键措施之一，我国是国际上最早使用疫苗防治HPAI的国家，灭活疫苗的应用为我国养禽业的健康发展做出了重要的贡献。

DNA疫苗(DNA Vaccine)又称基因疫苗(Genetic Vaccine)、核酸疫苗(NucleicAcid Vaccine)，它是将编码目的抗原蛋白基因序列的质粒经肌肉注射导入宿主细胞，通过转录系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗，被称为“第三代疫苗”。DNA疫苗与传统的灭活疫苗相比，具有十分显著的优势。DNA疫苗能够同时诱导细胞免疫和体液免疫；不受母源抗体的影响，不会影响免疫检测和流行病学监测，其应用有利于无疫病区的建立和疫病的清除；DNA疫苗制备简单，不依赖于鸡胚的大量供应，还可以任意组成联合疫苗和多价疫苗等。另外，研究表明，将异源的免疫原基因的密码子优化为免疫接种动物偏嗜使用的密码子可显著提高DNA疫苗抗原表达效率。因此，DNA疫苗被认为是防控流感的理想疫苗之一，并有必要进行必要的技术储备。

由于H5亚型禽流感病毒变异频繁、抗原亚群较多，只有抗原匹配性良好的疫苗才能提供坚实有效的防控。截至目前，还没有针对我国流行的H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒的DNA疫苗，因此开发一种有效的DNA疫苗是当前急需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种编码禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用。

一方面，本发明提供了一种编码禽流感病毒血凝素蛋白的基因，其具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述表达载体的制备方法，包括：

(1)将禽流感病毒的血凝素基因SEQ ID NO：2进行密码子优化；

(2)加入Kozak序列优化，并插入到真核表达载体中。

其中，步骤(1)中的密码子优化包括将禽流感病毒血凝素基因的密码子全部替换为鸡(Gallus domesticus)偏嗜的密码子。

优选地，所述真核表达载体是pCAGGs。

本发明还涉及所述基因在制备禽流感DNA疫苗中的应用，所述基因在制备亚单位疫苗或重组禽痘病毒、重组新城疫病毒等基因工程疫苗中的应用，所述基因在制备单克隆抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)国内禽流感病毒早期的分离株例如A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)现在在家禽中已经不存在，本发明针对我国目前主要流行的H5亚型clade 2.3.4.4分支禽流感病毒进行研究，选取了其代表毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013(H5N1)(CK/GZ/4/13(H5N1))；

(2)本发明对禽流感病毒的血凝素基因进行密码子优化，然后在此基础上加入Kozak序列进一步优化，显著提高了抗原表达效率，同时所选用的真核表达载体为pCAGGs，含有有利于高效表达的CMV增强子、鸡β-actin启动子及SV40 polyA信号调控元件，其表达效率优于常用的其它载体(例如载体pCI)；

(3)本发明利用优化后的血凝素基因制备了包含表达所述禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的基因的DNA疫苗质粒，其不仅对同源HA基因供体毒株的攻击提供100％的免疫保护，还能对2013年以来不同年代的2.3.4.4分支的其他分离株的致死性攻击提供完全的免疫保护。所述DNA疫苗质粒将为我国禽流感的防控提供必要的技术储备。

附图说明

图1为我国H5亚型clade 2.3.4.4分支禽流感病毒HA基因进化分析图；

图2为质粒pCA-GZ4HA的PCR鉴定(M：DNAMarker DL2000；1：pCA-GZ4HA的PCR扩增产物；2：空载体pCAGGs对照；3：ddH2O对照)；

图3为质粒pCA-GZ4HA的酶切鉴定图片(M：DNAMarker DL2000；1：pCA-GZ4HA质粒对照；2：pCA-GZ4HA的EcoR I酶切产物；3：pCA-GZ4HA的EcoR I和Xho I双酶切产物)；

图4为IFA检测optiGZ4HA蛋白与CK/GZ/4/13(H5N1)的反应情况(A.转染pCA-GZ4HA的293T细胞；B.转染pCAGGs空载体的293T细胞)；

图5为HA蛋白与内参的Western Blot分析图；

图6为质粒pCA-GZ4HA超螺旋含量测定结果(1：DNA Marker DL2000；2：pCA-GZ4HA超螺旋含量：84.5％；2：pCA-GZ4HA超螺旋含量：85.3％)；

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明针对当前主要流行的clade 2.3.4.4分支的病毒，通过系统的抗原性分析，筛选了A/Chicken/Guizhou/4/2013(H5N1)(CK/GZ/4/13(H5N1))病毒作为clade 2.3.4.4分支的代表株，将其血凝素基因(HA)(SEQ ID NO：2)进行密码子优化、加入Kozak序列优化后插入到真核表达载体pCAGGs中，构建了DNA疫苗质粒pCA-GZ4HA，并对其免疫效力进行了系统评价。

本发明实施例中所用的原料、试剂及其仪器的来源：

1菌株、细胞与质粒

大肠杆菌JM109感受态细胞购自北京全式金生物公司；293T细胞(人胚胎肾细胞(CRL-11268)，来自ATCC)，真核表达质粒pCAGGs(由美国威斯康辛大学的YoshihiroKawaoka教授馈赠)，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存。

2酶及主要试剂

DNA分子量Marker；EcoR I，Xho I限制性内切酶，Phusion高保真DNA聚合酶以及T4DNA连接酶购自New England Biolabs(NEB)公司；DNA胶回收试剂盒及小量质粒DNA提取试剂盒购自于Axygen公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒，质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司；Lipofectamine^TM2000，青链霉素双抗购自Invitrogen有限公司；DMEN，Opti-MEM细胞培养液均购自GIBCO公司；氨苄霉素购自Biosharp公司；引物合成由上海英潍捷基有限公司完成；基因测序试剂盒购自ABI公司；本实验中所使用的其他试剂均为国产分析纯或者进口分装。

3抗体

FITC标记的兔抗鸡IgG(IgG-FITC)荧光二抗，羊抗鸡IgG DyLight^TM 680标记二抗(Anti-Chicken IgG(H&L)(GOAT)Antibody DyLight^TM 680Conjugated)，购自ThermoFisher公司；β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(sc47778)购自Santa Cruz Biotechnology公司；

800CW Goat anti-mouse IgG(H&L)购自LI-COR公司。

4病毒、抗原

攻毒用H5亚型高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian InfluenzaVirus，HPAIV)A/ckicken/Guizhou/4/2013(H5N1)(CK/GZ/4/13(H5N1))，A/duck/Guizhou/S3644/2013(H5N1)(DK/GZ/S3644/2013(H5N1))，A/chicken/Yunnan/3/2014(H5N1)(CK/YN/3/2014(H5N1))，A/duck/Jiangxi/S1003/2016(H5N1)(DK/JX/S1003/2016(H5N6))和A/chicken/Hunan/SD001/2016(H5N6)(CK/HuN/SD001/2016(H5N6))以及其标准抗原均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存。

5 SPF鸡胚和SPF鸡

实验所有的9-11日龄SPF鸡胚和1日龄SPF鸡均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，试验期间所有SPF鸡均饲养于负压隔离器中。

6主要仪器

小型离心机，梯度PCR仪为德国Eppendorf公司产品；凝胶电泳成像仪，倒置荧光显微镜为德国蔡司公司产品；其余仪器均为国产。

实施例1 H5亚型2.3.4.4分支禽流感病毒HA基因的密码子优化与合成

将鸡使用的密码子和流感病毒使用的密码子做了比较分析，确定了鸡最偏嗜的密码子和流感病毒最偏嗜的密码子(参见表1)，利用DNAStar软件将流感病毒CK/GZ/4/13(H5N1)的HA基因(SEQ ID NO：2)的密码子全部替换为鸡体最偏嗜的密码子，并在起始密码子ATG前加入Kozak序列gccaccacc，从而书写出密码子优化的基因optiGZ4HA的序列(SEQID NO：1)，在优化后的基因optiGZ4HA两端分别添加EcoR I和Xho I限制酶酶切位点后，送由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表1鸡和流感病毒最偏嗜的密码子

氨基酸	鸡	流感病毒
			精氨酸Arg(R)	CGC	AGA
亮氨酸Leu(L)	CUG	CUG
			丝氨酸Ser(S)	AGC	UCA
苏氨酸Thr(T)	ACC	ACA
			脯氨酸Pro(P)	CCC	CCA
丙氨酸Ala(A)	GCC	GCA
			甘氨酸Gly(G)	GGC	GGA
缬氨酸Val(V)	GUG	GUG
			赖氨酸Lys(K)	AAG	AAA
谷氨酰胺Gln(Q)	CAG	CAA
			天冬酰胺Asn(N)	AAC	AAU
组氨酸His(H)	CAC	CAU
			谷氨酸Glu(E)	GAG	GAA
天冬氨酸Asp(D)	GAC	GAU
			酪氨酸Tyr(Y)	UAC	UAU
半胱氨酸Cys(C)	UGC	UGC
			苯丙氨酸Phe(F)	UUC	UUC
异亮氨酸Ile(I)	AUC	AUA
			甲硫氨酸Met(M)	AUG	AUG
色氨酸Trp(W)	UGG	UGG

实施例2.表达优化HA基因重组质粒pCA-GZ4HA的构建与鉴定

使用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别处理pCAGGs载体与合成的在pMD18T载体上的optiGZ4HA基因，16℃连接，连接产物转化JM109大肠杆菌感受态，使用限制性内切酶EcoRI、EcoR I和Xho I对重组质粒进行酶切鉴定，同时在载体的多克隆位点上下游设计一对引物进行插入片段的PCR鉴定，所用的引物如下：

pCAGGs-F：5’-TTCGGCTTCTGGCGTGTGACC-3’，(SEQ ID NO：3)

pCAGGs-R：5’-TGTTTCATATACTGATGACCT-3’(SEQ ID NO：4)。

对重组质粒pCA-GZ4HA进行PCR鉴定(参见图2)，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，没有外源基因插入的空载体pCAGGs可扩增到约470bp的片段，而插入了外源optiGZ4HA基因的pCA-GZ4HA经特异性引物扩增之后可出现大小约为2190bp的片段。

重组质粒pCA-GZ4HA使用EcoR I、EcoR I和Xho I做了酶切，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用EcoRI酶切得到了约6.5kb的片段，用EcoR I和Xho I酶切得到了约4.8kb和1.7kb的片段，结果与预期相符(参见图3)，表明重组质粒构建成功。

下面是重组质粒体外表达的间接免疫荧光鉴定过程。

1转染质粒的提取

将上述鉴定为阳性的质粒转化JM109感受态，涂于含氨苄抗性的固体LB平板，挑取阳性克隆，加入到100mL含100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基中，37℃200rpm培养16h并收获菌体，按照QIAGEN质粒中量提取试剂盒提取pCA-GZ4HA。

2重组质粒的瞬时转染

使用含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗的DMEM培养基于CO₂(5％)培养箱中培养293T细胞，待细胞密度达到80％时将细胞转接至多聚赖氨酸包被的六孔板中用于转染，转染按照Lipofectamine LTX and Plus^TM说明书进行，并设置转染pCAGGs空载体的293T细胞作为阴性对照。

3间接免疫荧光鉴定

转染之后12h换液；36小时收获细胞，弃掉培养液，PBST清洗3次细胞，每次5分钟；使用3％的对聚甲醛对细胞室温固定30min；PBST清洗细胞3次，每次5min；1％BSA室温封闭细胞30min；弃掉封闭液，5％BSA稀释的H5亚型禽流感阳性血清(500倍稀释)作为一抗，37℃作用1h；PBST清洗3次细胞，每次5min；1％BSA稀释的兔抗鸡IgG-FITC(300倍稀释)作为二抗，37℃避光作用1h；PBST清洗细胞3次，每次5分钟；弃掉清洗液，用PBS清洗一次之后加入碱性甘油(pH＝9.8)，置于荧光显微镜下观察。

结果显示，optiGZ4HA蛋白(SEQ ID NO：5)可以在293T细胞中高效表达(参见图4)。

实施例3重组质粒体外表达的Western-blot鉴定

1重组质粒的瞬时转染

按照实施例1中所述的瞬时转染方法转染pCA-GZ4HA。

2细胞的裂解

转染后48h收获细胞，弃掉培养基，PBS洗两次，之后用PBS重悬两个孔的细胞并转移至2mL离心管内，1500g离心10min，加入70μL细胞裂解液，1μL核酸酶，在冰上裂解40min，每隔10min震荡混匀一次以加速裂解，待裂解液澄清时即可完成裂解。

3重组蛋白的Western Blot鉴定

取20μL细胞裂解液，加入5μL 4×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，之后使用12％SDS-PAGE蛋白凝胶进行电泳；电泳结束后使用湿转的方法进行转膜，转膜条件为电流350mA转膜80min；用5％脱脂乳封闭NC膜，4℃过夜；PBST洗3次；5％脱脂乳稀释的H5亚型禽流感病毒阳性血清(1∶300)作为一抗，37℃震荡孵育1h；羊抗鸡IgG-DyLight^TM 68(1∶10000)作为二抗，37℃避光震荡孵育1h；PBST清洗3次，每次5min；取出NC膜，使用Odyssey红外激光成像系统进行扫描。

4内参的Western Blot鉴定

按照上述方法处理样品，并进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳；电泳结束后使用湿转的方法进行转膜，转膜条件为电流350mA转膜80min；用5％脱脂乳封闭NC膜，4℃过夜；PBST洗3次；5％脱脂乳稀释的β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(1∶2500)作为一抗，37℃震荡孵育1h；

800CW Goat anti-mouse IgG(H&L)(1∶5000)作为二抗，37℃避光震荡孵育1h；PBST清洗3次，每次5min；取出NC膜，使用Odyssey红外激光成像系统进行扫描。

结果显示，表达的HA单体蛋白的大小约为72ku，HA1蛋白大小约为55ku，HA2蛋白大小约为27ku。同时设置的内参对照均可以得到约为42ku的β-actin蛋白(参见图5)。

实施例4病毒鸡胚半数致死量EID₅₀的测定

将病毒CK/GZ/4/13(H5N1)、DK/GZ/S3644/2013(H5N1)、CK/YN/3/2014(H5N1)、DK/JX/S1003/2016(H5N6)或CK/HuN/SD001/2016(H5N6)。的尿囊液用无菌PBS进行10倍连续倍比稀释至10^-10，将其中10^-5到10^-10六个稀释度接种9日龄鸡胚，每个稀释度做4个重复，37℃孵化48h；之后收取50μL尿囊液进行血凝试验，根据Reed-Meunch法计算病毒的EID₅₀。结果如表2所示。

表2各病毒的EID₅₀

Virus	Log<sub>10</sub>EID<sub>50</sub>/mL
		CK/GZ/4/13(H5N1)	8.38
DK/GZ/S3644/2013(H5N1)	8.67
		CK/YN/3/2014(H5N1)	8.5
DK/JX/S1003/2016(H5N6)	8.33
		CK/HuN/SD001/2016(H5N6)	8.33

实施例5 DNA疫苗的制备

将质粒pCA-GZ4HA转化JM109感受态细胞，均匀涂布于含氨苄抗性的固体LB平板上，37℃培养过夜；将单个阳性菌落接种于5mL含氨苄的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h；之后接种于500mL含氨苄的液体LB培养基中，37℃震荡培养16h；按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒(Maxi Endofree)说明书进行质粒的大量提取；对所提取质粒进行浓度测定；取10μL(0.01μg/μL)质粒进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测并分析超螺旋含量；免疫前使用无菌PBS对DNA疫苗进行稀释。

免疫前对质粒的超螺旋含量进行检测，质粒取10μL(0.01μg/μL)进行琼脂糖凝胶电泳(0.7％)，使用Bio-Rad Image Lab凝胶成像系统进行检测并分析超螺旋含量，结果显示，pCA-GZ4HA的超螺旋含量平均为84.9％，完全符合免疫要求(参见图6)。

实施例6 SPF鸡免疫方法与免疫程序

试验分组情况

按照下表对表达质粒pCA-GZ4HA进行同源以及异源攻毒保护实验(攻毒毒株与剂量如表3)，以评价该疫苗对clade 2.3.4.4的不同代表毒株攻击的保护情况。

表3实验分组情况

组别	免疫质粒	免疫剂量	攻毒毒株(10<sup>5</sup>EID<sub>50</sub>)	数量
					1	pCA-GZ4HA	15μg	CK/GZ/4/13(H5N1)	10
2	pCA-GZ4HA	15μg	DK/GZ/S3644/2013(H5N1)	10
					3	pCA-GZ4HA	15μg	CK/YN/3/2014(H5N1)	10
4	pCA-GZ4HA	15μg	DK/JX/S1003/2016(H5N6)	10
					5	pCA-GZ4HA	15μg	CK/HuN/SD001/2016(H5N6)	10
6	Controll(PBS)	0.2mL	CK/GZ/4/13(H5N1)	6
					7	Control2(PBS)	0.2mL	DK/GZ/S3644/2013(H5N1)	6
8	Control3(PBS)	0.2mL	CK/YN/3/2014(H5N1)	6
					9	Control4(PBS)	0.2mL	DK/JX/S1003/2016(H5N6)	6
10	Control5(PBS)	0.2mL	CK/HuN/SD001/2016(H5N6)	6

本实验采用两点法肌肉注射，每个位点注射0.1mL疫苗，免疫总体积为0.2mL，免疫剂量为15μg。

免疫程序：所有实验组SPF鸡在3周龄时进行首次免疫，首免3周之后按照相同的剂量进行一次加强免疫。

实施例7 HI抗体的测定

自首次免疫开始每周采集一次血清；将25μL血清加入到96孔V型血凝板中，用无菌PBS做连续2倍倍比稀释至2^-12，其中阳性对照孔加入阳性血清，阴性对照孔加入PBS；之后加入25μL 4单位抗原(每组血清采用与攻毒毒株对应的抗原进行检测)，室温作用20min；加入25μL 1％红细胞悬液，室温静置20min，观察并记录最终结果。

结果表明，15μg的pCA-GZ4HA免疫3周龄的SPF鸡，免疫后第四周(即加免后第一周)针对CK/GZ/4/13(H5N1)抗原的HI抗体转阳率均达到100％。(参见表4)。

HI抗体水平方面，pCA-GZ4HA免疫组的HI抗体平均水平达到了4.2log₂(参见表5)。

表4 pCA-GZ4HA免疫后针对CK/GZ/4/13(H5N1)的HI抗体的转阳率(阳性数/总数)

*加强免疫

表5 pCA-GZ4HA免疫后针对抗原CK/GZ/4/13(H5N1)的HI抗体的平均滴度(log2)

*加强免疫；#攻毒；§鸡死亡。

实施例8攻毒保护实验

每组实验鸡和对照鸡均在加免后第二周攻毒，攻毒剂量为10⁵EID₅₀，攻毒毒株如表1所示；攻毒之后的观察期为14天，观察期内每天观察和记录免疫组和对照组鸡的发病和死亡情况。

结果显示，不同HPAIV攻击之后，所有免疫组的鸡均无发病、无死亡，攻毒保护率均为100％；而CK/GZ/4/13(H5N1)和CK/YN/3/2014(H5N1)对照组的SPF鸡在3天内全部死亡，DK/GZ/S3644/2013(H5N1)和DK/JX/S1003/2016(H5N6)对照组的SPF鸡在3天内死亡3只，其余均在第4天死亡，CK/HuN/SD001/2016(H5N6)对照组的SPF鸡在3天内死亡2只，其余也在第4天死亡(参见表6)。

表6不同HPAIV攻击之后的发病率和死亡率

实施例9病毒分离与滴定

攻毒后第3天，第5天和第7天采集喉头拭子和泄殖腔拭子，每个拭子使用含有双抗(包含浓度为2000U/mL的青霉素和浓度为2000μg/mL的链霉素)的无菌PBS做10倍倍比稀释(2个稀释度)，每个稀释度接3个9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵化48h；之后每个鸡胚收取50μL尿囊液，加入等体积1％红细胞，进行血凝试验，根据Reed-Meunch法计算所分离病毒的滴度。

结果显示，不同HPAIV攻击之后，所有免疫组的鸡均无排毒；而不同病毒攻击的对照组的鸡均可分离到较高滴度的病毒(参见表7)。

表7不同HPAIV攻击后的病毒分离结果

＊3天内死亡的鸡，均在第3天采集拭子；$3天内全部死亡；#3天内死亡3只；￡3天内死亡2只；§全部死亡

本研究表明，pCA-GZ4HA疫苗可以对clade2.3.4.4分支病毒的攻击提供100％的免疫保护，并且可以产生较高水平的HI抗体，DNA疫苗pCA-GZ4HA可以作为预防我国流行的clade2.3.4.4分支病毒的有效疫苗，用于我国H5亚型禽流感的防控实践。

本发明所述基因还可以用来制备亚单位疫苗、重组禽痘病毒或重组新城疫病毒等基因工程疫苗以及单克隆抗体。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 编码H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用

<130> IB178870

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 1

gccgccacca tggagaagat cgtgctgctg ctggccgtgg tgagcctggt gaagagcgac 60

cagatctgca tcggctacca cgccaacaac agcaccgagc aggtggacac catcatggag 120

aagaacgtga ccgtgaccca cgcccaggac atcctggaga agacccacaa cggccgcctg 180

tgcgacctga acggcgtgaa gcccctgatc ctgaaggact gcagcgtggc cggctggctg 240

ctgggcaacc ccatgtgcga cgagttcatc cgcgtgcccg agtggagcta catcgtggag 300

cgcgccaacc ccagcaacga cctgtgctac cccggcaacc tgaacgacta cgaggagctg 360

aagcacctgc tgagccgcat caaccacttc gagaagaccc tgatcatccc caagagcagc 420

tggcccgacc acgacaccag cctgggcgtg agcgccgcct gcccctacca gggcatgccc 480

agcttcttcc gcaacgtggt gtggctgatc aagaagaacg acacctaccc caccatcaag 540

atgagctaca acaacaccaa ccgcgaggac ctgctgatcc tgtggggcat ccaccacagc 600

aacaacgccg ccgagcagac caacctgtac aagaacccca ccacctacgt gagcgtgggc 660

accagcaccc tgaaccagcg cctggtgccc aagatcgcca cccgcagcca ggtgaacggc 720

cagcgcggcc gcatggactt cttctggacc atcctgaagc ccaacgacgc catccacttc 780

gagagcaacg gcaacttcat cgcccccgag tacgcctaca agatcgtgaa gaagggcgac 840

agcaccatca tgaagagcga gatggagtac ggccactgca acaccaagtg ccagaccccc 900

atcggcgcca tcaacagcag catgcccttc cacaacatcc accccctgac catcggcgag 960

tgccccaagt acgtgaagag caacaagctg gtgctggcca ccggcctgcg caacaacccc 1020

ctgcgcgagc gccgccgcaa gcgcggcctg ttcggcgcca tcgccggctt catcgagggc 1080

ggctggcagg gcatggtgga cggctggtac ggctaccacc acagcaacga gcagggcagc 1140

ggctacgccg ccgacaagga gagcacccag aaggccatcg acggcgtgac caacaaggtg 1200

aacagcatca tcgacaagat gaacacccag ttcgaggccg tgggccgcga gttcaacaac 1260

ctggagcgcc gcatcgagaa cctgaacaag aagatggagg acggcttcct ggacgtgtgg 1320

acctacaacg ccgagctgct ggtgctgatg gagaacgagc gcaccctgga cttccacgac 1380

agcaacgtga agaacctgta cgacaaggtg cgcctgcagc tgcgcgacaa cgccaaggag 1440

ctgggcaacg gctgcttcga gttctaccac aagtgcgaca acgagtgcat ggagagcgtg 1500

cgcaacggca cctacgacta cccccagtac agcgaggagg cccgcctgaa gcgcgaggag 1560

atcagcggcg tgaagctgga gagcatcggc acctaccaga tcctgagcat ctacagcacc 1620

gtggccagca gcctggccct ggccatcatc gtggccggcc tgagcctgtg gatgtgcagc 1680

aacggcagcc tgcagtgccg catctgcatc taa 1713

<210> 2

<211> 1704

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 2

atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60

attggttacc atgcaaataa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 180

aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct ccttggaaac 240

ccaatgtgcg acgagttcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gagggctaac 300

ccatccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacactta 360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccgat 420

catgatacat cattaggggt gagcgcagca tgtccatacc agggaatgcc ctcctttttc 480

agaaatgtgg tatggcttat caagaagaac gatacatacc caacaataaa gatgagctac 540

aataatacca atagggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaacgca 600

gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 660

ttaaaccaga gattggtgcc caaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacgtgga 720

agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780

ggaaatttta ttgctccaga gtatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatc 840

atgaaaagtg aaatggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 900

ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960

tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaataatcc tctaagagag 1020

aggagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt ttatagaggg aggatggcaa 1080

ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1140

gcagacaaag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgatc 1200

attgacaaga tgaacactca atttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaacgg 1260

agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320

gctgaacttc tagttctcat ggaaaatgag agaactctag atttccatga ctcaaatgtc 1380

aagaaccttt acgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaat 1440

ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1500

acgtatgact accctcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagaaga aataagcgga 1560

gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1620

tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1680

ttacaatgca gaatttgcat ttaa 1704

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Avian influenza virus)

<400> 3

ttcggcttct ggcgtgtgac c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Avian influenza virus)

<400> 4

tgtttcatat actgatgacc t 21

<210> 5

<211> 567

<212> PRT

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 5

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Arg Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Arg Ala Asn Pro Ser Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Thr Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asp His Asp Thr Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Met Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Met Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Arg Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly

275 280 285

His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Asn

325 330 335

Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

370 375 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

385 390 395 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

405 410 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

420 425 430

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

435 440 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

450 455 460

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

485 490 495

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

500 505 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr

515 520 525

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

530 535 540

Ala Ile Ile Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545 550 555 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

Claims (9)

1.一种编码禽流感病毒血凝素蛋白的基因，其特征在于其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种表达载体，其特征在于该表达载体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种制备权利要求2所述表达载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将禽流感病毒的血凝素基因SEQ ID NO：2进行密码子优化；

(2)加入Kozak序列优化，并插入到真核表达载体中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中的密码子优化包括将禽流感病毒血凝素基因的密码子全部替换为鸡(Gallus domesticus)偏嗜的密码子。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中的真核表达载体是pCAGGs。

6.一种权利要求1所述基因在制备禽流感DNA疫苗中的应用。

7.一种权利要求1所述基因在制备亚单位疫苗或基因工程疫苗中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，所述基因工程疫苗包括重组禽痘病毒或重组新城疫病毒。

9.一种权利要求1所述基因在制备单克隆抗体中的应用。

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