CN109136198A

CN109136198A - 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗

Info

Publication number: CN109136198A
Application number: CN201810951471.9A
Authority: CN
Inventors: 谢青梅; 周庆丰; 雷小亚; 李鸿鑫; 蔺文成; 陈伟国
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: Guangzhou Jinmiao Dongbao Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109136198B

Abstract

本发明公开了一种表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗。本发明在鸡痘病毒转移载体pSY681的基础上，构建重组感染性克隆pSY681‑VP1‑LacZ‑VP2，在CEF细胞内pSY681‑VP1‑LacZ‑VP2与FVP毒株基因通过同源臂发生同源重组获得rFPV‑VP1‑VP2。所述rFPV‑VP1‑VP2病毒株可以诱导机体产生抗CAV的有效抗体，起到免疫保护作用；子代鸡获得高水平的抗CAV的有效抗体可以很好的抵抗CAV强毒的侵袭，起到免疫保护作用。

Description

一种表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗

技术领域

本发明属于动物疫苗领域，具体涉及一种表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗。

背景技术

鸡传染性贫血(chicken infectious anemia,CIA)是一种免疫抑制性疾病，是由圆环病毒科环病毒属鸡传染性贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)引起的。鸡是CAV的主要宿主，各品种、各个年龄段的鸡均易感，且以两周龄以内的鸡最易感，随着鸡龄增长及免疫机能的完善，易感性随之降低，血清学数据表明，所有的养禽大国都普遍存在鸡传染性贫血病毒。CIA主要特征性临床症状是贫血，病鸡精神不振，皮肤惨白，食欲下降，增重减慢，发育缓慢，在感染12-28天后病鸡出现死亡。该病尚无特效的治疗药物，疫苗防控早期感染是控制CAV的关键。

目前，国内外均成功研制CAV灭活疫苗，并且对免疫种鸡的子代鸡具有一定的保护能力，但由于病毒在鸡胚和细胞中的滴度都较低(疫苗中的抗原含量一般低于10⁵CID₅₀/ml)，要得到足够的病毒滴度势必要付出较高的成本，所以生产中灭活疫苗使用不多见。而活疫苗毒株国内尚无适合的商品化产品，基因工程苗是一个有前景的疫苗方向。Noteborn、肖庆利等均在昆虫中共表达CAV的VP1和VP2并成功诱导抗体的产生，但该成果仍处于实验室研究阶段。

CAV基因组编码区含三个部分或完全重叠的开放阅读框(ORF)，大小分别为1350bp、651bp和366bp，分别编码蛋白VP1、VP2、VP3。VP1是唯一在病毒粒子上检测到的病毒衣壳蛋白，是构成中和抗原位点的组成部分。VP2是一个多功能非结构蛋白，在病毒装配过程中使VP1形成正确的构象，诱导机体产生免疫保护作用，也有丝氨酸和络氨酸蛋白磷酸化酶活性影响病毒粒子的复制。VP3蛋白与病毒的毒力有关，能够诱导鸡胸腺细胞和类淋巴细胞系快速凋亡，导致贫血、出血症状，因此又叫凋亡蛋白。研究表明，用单独表达VP1蛋白的昆虫细胞接种鸡，不能刺激机体产生有保护作用的中和抗体，接种共表达VP1、VP2蛋白的昆虫细胞能刺激机体产生较强的中和抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的微生物保藏编号为CCTCC NO:V201842，分类命名为：重组鸡痘病毒rFPV-VP1-VP2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2018年7月11日；保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

优选地，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗中，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的VP1、VP2核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

优选地，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗中，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的VP1、VP2核苷酸序列分别为在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或添加一个或多个核苷酸且编码SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示的蛋白序列或与编码与其具有同等功能的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：将分离到的鸡传染性贫血病毒流行毒株的VP1和VP2基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681的启动子下游，获得pSY681-VP1-VP2转移载体；将所述pSY681-VP1-VP2转移载体转染已感染亲本鸡痘病毒FPV株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡传染性贫血病毒流行毒株VP1和VP2的重组鸡痘病毒即得鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗。

优选地，本发明所述的鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的制备方法中，所述鸡痘病毒转移载体pSY681的早晚期启动子PE/L启动CIA的VP1基因的转录，所述鸡痘病毒转移载体pSY681的P11启动子启动大肠杆菌LacZ基因、CIA的VP2基因的转录。

本发明的另一目的在于提供上述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗在制备治疗鸡传染性贫血或鸡痘的药物中的应用。

优选地，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗在制备治疗鸡传染性贫血或鸡痘的药物中的应用中，所述药物为疫苗。

更优选地，本发明所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗在制备治疗鸡传染性贫血或鸡痘的药物中的应用中，所述疫苗还包括药学上可以接受的冻干保护剂。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明在鸡痘病毒转移载体pSY681的基础上，构建重组感染性克隆rFPV-VP1-VP2。为了使插入禽痘病毒的外源基因能够有效表达，本发明采用早晚期启动子PE/L启动VP1基因的转录，采用P11启动子启动大肠杆菌LacZ基因、VP2基因的转录。构建表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的重组鸡痘病毒可以在免疫鸡体内复制表达，并且在VP2蛋白作用下可以使VP1蛋白产生正确的构象，从而可以诱导机体产生抗CAV的有效抗体，起到免疫保护作用。本发明将构建的含鸡痘病毒同源臂、LacZ标记基因、VP1和VP2目的基因的pSY681-VP1-LacZ-VP2质粒转染进入已经用鸡痘病毒功毒的CEF细胞，两者通过同源重组技术使得鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因插入到鸡痘病毒基因组中，首次成功构建了能够表达鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白的重组鸡痘病毒。本研究为开发重组鸡痘病毒疫苗以及取代现在鸡场用的鸡传染性贫血病毒商品化弱毒疫苗奠定了基础，可以避免弱毒疫苗引起的水平传播，减少养殖场的经济损失。鸡痘病毒载体疫苗可以嵌合多个抗原表位基因，翅中一次可以抵抗多个病原侵袭，可减少因为免疫引起的应激反应及养殖成本，省时省力，对于养禽业的发展有着重要的意义。

2)通过同源重组获得的第一代病毒中仅仅有大约1％是重组成功的，而本发明建立了一种筛选重组病毒的方法使得筛选成为可能。一般在外源基因的附近插入标记基因，根据标记蛋白的特点来筛选重组病毒。大肠杆菌LacZ基因的表达产物在酶组化底物X-gal的水解作用下会产生蓝色，因此可以用来区分重组毒和未重组毒。本发明通过间接免疫荧光试验检测目的基因的表达，结果表明接种重组病毒的CEF病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未重组鸡痘病毒的CEF没有检测到绿色荧光，说明目的基因在重组鸡痘病毒中可以正确表达。做Western Blot试验检测VP1、VP2目的基因是否都有表达，结果表明收取的接种重组病毒CEF的总蛋白经检测出现两条特异性条带，说明VP1、VP2目的基因均可以在重组鸡痘病毒中正确表达。将效价都大于10⁶

PFU/mL的rFPV和纯化后的rFPV-VP1-VP2分别倍比稀释接种处理好的CEF，记下出现的蚀斑数量，计算病毒液中的PFU，绘制病毒生长曲线。结果表明，重组鸡痘病毒rFPV-VP1-VP2和FPV没有明显的差异，说明VP1和VP2基因的插入不会影响鸡痘病毒自身的复制，遗传稳定性较好。

3)通过本发明的后续实施例证明，本发明的鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-VP1-VP2，对各种鸡只均安全，且无明显副反应，将所述活载体疫苗株制成疫苗安全有效，可保护同源强毒的攻毒；可取代现在鸡场用的鸡传染性贫血病毒商品化弱毒疫苗奠定了基础，可以避免弱毒疫苗引起的水平传播，减少养殖场的经济损失。鸡痘病毒载体疫苗可以嵌合多个抗原表位基因，翅种一次可以抵抗多个病原侵袭，可减少因为免疫引起的应激反应及养殖成本，省时省力。

附图说明

图1为广东地区CAV全基因组遗传进化树示意图；

图2为本发明一个实施例中的转移载体pSY681-VP1-LacZ-VP2构建流程图；

图3为本发明一个实施例中的重组质粒PUC51-VP1-LacZ-VP2酶切鉴定图；

图4为本发明一个实施例中的重组质粒PUC52-GFP-LacZ-RFP酶切鉴定图；

图5为本发明一个实施例中的重组质粒pSY681-VP1-LacZ-VP2酶切鉴定图；

图6为本发明一个实施例中的重组质粒pSY681-GFP-LacZ-RFP酶切鉴定图；

图7为本发明一个实施例中WB检测rFPV-VP1-VP2的VP1、VP2基因的表达图；

图8为本发明一个实施例中的rFPV-VP1-VP2病毒生长曲线图；

图9为本发明一个实施例中的rFPV-VP1-VP2疫苗免疫SPF种鸡后血清CAV抗体水平检测图；

图10为本发明一个实施例中的rFPV-VP1-VP2疫苗免疫SPF种鸡后子代鸡血清母源CAV抗体水平检测图；

图11为本发明一个实施例中的rFPV-VP1-VP2疫苗免疫SPF鸡后外周血的T淋巴细胞的流式细胞分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-VP1-VP2构建

a.CAV流行毒株的分离鉴定

从NCBI数据库中下载世界各地分离的36株鸡传染性贫血病毒参考毒株的核苷酸序列，与本实验室近期于广东分离的12株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列进行分析对比。用MegAlign软件对12株分离株与36株参考毒的全基因序列、VP1基因核苷酸序列以及推导的VP1氨基酸序列进行同源性比较分析。全基因序列进化分析结果显示进化树由三个分支组成：Ⅱ分支包括中国分离株DQ141673和AY999018；Ⅲ分支包括中国分离株DQ124936和KU221054、美国分离株AF311900、马来西亚分离株AF285882、阿根廷分离株KJB72514、日本分离株AB119448、澳大利亚分离株U65414；其余27个参考毒株属于Ⅰ分支。12株广东地区CAV分离株都处于Ⅰ分支且与中国广东株KU050679、KU050678进化关系较近(图1)。VP1基因序列分析结果显示进化树由A、B、C三大分支组成，A分支又可以分为A1、A2、A3和A4四个亚分支。12株广东地区CAV分离株都属于Ⅰ分支且与近几年流行的中国广东株KU050679、KU050678、KU050680、KU050677的进化关系较近，这也说明了A1亚分支是广东地区CAV主要的流行分支。CAV的VP1氨基酸序列中第394位氨基酸是决定毒株毒力的关键位点，谷氨酰胺代表高致病性，组氨酸代表低致病性，12株广东地区CAV的VP1氨基酸序列在第394位都是谷氨酰胺，暗示分离的12株CAV都属于高致病性毒株。将12株CAV的VP2、VP3氨基酸序列与36株参考毒株的VP2、VP3氨基酸序列进行比对，结果显示VP2和VP3序列相对保守且氨基酸同源性分别在98.4～99.7％、98.8～99.8％之间。

b.鸡痘病毒转移载体的构建

将含LacZ基因的pSC11质粒(广东温氏食品集团股份有限公司赠送)用XbaⅠ和PstⅠ内切酶双酶切后回收，分别连接到中间载体PUC51-VP1-VP2(金斯瑞生物科技合成，VP1、VP2为流行毒株序列，即a.中分离株序列，核苷酸序列见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)、PUC52-GFP-RFP(广东温氏食品集团股份有限公司赠送)质粒上，分别得到PUC51-VP1-LacZ-VP2、PUC52-GFP-LacZ-RFP重组质粒。然后用NotⅠ内切酶分别酶切质粒pSY681、PUC51-VP1-LacZ-VP2和PUC52-GFP-LacZ-RFP，将酶切回收后获得的VP1-LacZ-VP2基因和GFP-LacZ-RFP基因分别连接到pSY681线性载体上，获得pSY681-VP1-LacZ-VP2和pSY681-GFP-LacZ-RFP两个重组质粒(以pSY681-VP1-LacZ-VP2为例的具体构建流程，见图2)。

c.重组质粒PUC51-VP1-LacZ-VP2、PUC52-GFP-LacZ-RFP的酶切鉴定

将构建好的PU51-VP1-LacZ-VP2重组质粒用NotⅠ内切酶进行酶切鉴定，凝胶电泳鉴定结果显示泳道出现与pUC51线性载体和VP1-LacZ-VP2线性载体大小相同的两条带(见图3)。将构建好的PUC52-GFP-LacZ-RFP重组质粒用XbaⅠ和PstⅠ内切酶进行双酶切鉴定，凝胶电泳鉴定结果显示泳道出现与LacZ基因片段和PU52-GFP-RFP线性载体大小相同的两条带(见图4)。与预期结果相符，说明重组质粒构建成功。

d.重组质粒pSY681-VP1-LacZ-VP2和pSY681-GFP-LacZ-RFP的酶切鉴定

将构建好的pSY681-VP1-LacZ-VP2和pSY681-GFP-LacZ-RFP两个重组质粒，分别用NotⅠ内切酶进行酶切鉴定。凝胶电泳鉴定结果显示两条泳道都出现两条带：一条泳道出现与VP1-LacZ-VP2基因片段、pSY681线性载体大小相同的两条带(见图5)，一条泳道出现与GFP-LacZ-RFP基因片段、pSY681线性载体大小相同的两条带(见图6)。与预期结果相符，说明重组质粒构建成功。

e.鸡痘病毒转移载体表达盒功能验证

将CEF细胞(原代鸡胚成纤维细胞)按照5×10⁶个/mL的密度接种6孔板。接种后观察细胞密度，当细胞密度达到85～90％时，用5μL的脂质体Lipofectamine TM 2000包裹质粒pSY681-GFP-LacZ-RFP、pSY681分别转染CEF细胞，并设置未转染对照组，质粒转染量均为3μg。转染24h后用倒置荧光显微镜观察到绿色荧光和红色荧光，结果表明pSY681-VP1-LacZ-VP2质粒已在CEF细胞中表达。

f.重组鸡痘病毒rFPV-VP1-VP2的获得、纯化和鉴定

用Lipofectamine TM 2000转染试剂盒将转移载体pSY681-VP1-LacZ-VP2转染已感染鸡痘病毒(FVP)4h的CEF，转移载体pSY681-VP1-LacZ-VP2与FVP基因组DNA之间通过同源臂发生同源重组，使VP1-LacZ-VP2目的基因插入到鸡痘病毒的基因组中从而获得重组病毒。该重组鸡痘病毒含有LacZ基因，在含有X-Gal的营养琼脂上可形成蓝色蚀斑。挑取蓝色蚀斑，经过多次筛选和纯化获得较纯的重组病毒，直到纯化的重组病毒产生的蚀斑在含有X-Gal的营养琼脂上全部呈蓝色。

将蚀斑纯化的重组鸡痘病毒病以0.5MOI感染接种CEF，待细胞出现明显病变时收集病毒并抽提DNA，以病毒DNA为模板用引物PP1F、LSPR、LSPF、PP2R进行PCR扩增，同时设置未重组的鸡痘病毒作为对照。重组鸡痘病毒通过PCR扩增，可扩增出大小为980bp的部分VP1基因和570bp的VP2基因。表明pSY681-VP1-LacZ-VP2质粒和鸡痘病毒重组成功。

g.重组鸡痘病毒中目的基因的表达鉴定

g.1间接免疫荧光检测目的基因的表达

将鸡痘病毒和纯化的重组鸡痘病毒以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF细胞出现明显病变时，用鸡传染性贫血病毒的阳性血清作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。接种重组病毒的CEF细胞病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未重组鸡痘病毒的CEF细胞没有检测到绿色荧光，说明目的基因在重组鸡痘病毒中很好的表达。

g.2Western Blot检测VP1、VP2目的基因的表达

将鸡痘病毒和纯化的重组鸡痘病毒以0.5MOI感染CEF，待细胞出现明显病变时，用预冷的真核细胞裂解液(确保加入蛋白酶抑制剂)收取细胞总蛋白。通过SDS-PAGE电泳，用鸡传染性贫血病毒的阳性血清作一抗，羊抗鸡IgG-HRP作二抗，Western Blot检测VP1、VP2目的基因的表达。结果显示接种重组病毒的CEF的总蛋白经检测出现两条特异性条带(见图7)，说明VP1、VP2目的基因在重组鸡痘病毒中很好的表达。

实施例2：重组鸡痘病毒的效价和生长曲线测定

a.重组鸡痘病毒的效价

取100μL稀释度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的实施例1所获得的重组鸡痘病毒的病毒液接种处理好的CEF细胞且每一个稀释度做4个重复，放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养。CEF细胞出现明显病变时，记下出现的蚀斑数量，计算每个稀释度的四个重复的蚀斑平均值，根据蚀斑数量换算病毒液中的病毒蚀斑形成单位(PFU)。结果显示rFPV-VP1-VP2和FPV的效价都大于10⁶PFU/mL(见表1)。

表1病毒扩增效价

b.重组鸡痘病毒生长曲线的测定

将重组鸡痘病毒和鸡痘病毒分别以0.02MOI感染细胞，放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养，分别于24h、48h、72h、96h收取细胞病毒液，-80℃反复冻融三次，收集病毒。分别取不同时间段的病毒进行10的倍比稀释，取100μL稀释的病毒液接种处理好的CEF且每一个稀释度做4个重复，计算四个重复的蚀斑平均值，从而计算病毒液中的PFU，绘制病毒生长曲线(如图8)。结果表明，重组鸡痘病毒rFPV-VP1-VP2和FPV没有明显的差异，说明VP1和VP2基因的插入不会影响鸡痘病毒自身的复制。

c.无菌和支原体检测

将rFPV-VP1-VP2接种CEF细胞扩繁，收集病毒液按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和支原体检验，检测结果为阴性。

d.外源病毒检测

将rFPV-VP1-VP2接种CEF细胞扩繁，收集病毒液按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行外源病毒检测，检测结果均阴性。

e.对易感雏鸡的安全性试验

e1.不同代次rFPV-VP1-VP2对易感雏鸡的安全性试验

将rFPV-VP1-VP2接种CEF细胞传代扩繁，收集各代次病毒液，分别进行F1、F5、F10、F15、F20、F25代病毒的安全性试验，1日龄SPF雏鸡70只随机分为7组，试验组翅膀接种免疫途径接种各代次病毒，每只接种10⁵PFU/羽，另一组作为对照不做处理，负压隔离器中饲养，自由饮水采食，接种后每日观察，记录鸡群的发病、死亡情况，及时剖检死亡鸡，观察21d后剖检存活鸡，记录发病情况，结果见表2：

表2 rFPV-VP1-VP2不同代次毒病毒对1日龄SPF鸡的致病力评估

e2.不同剂量rFPV-VP1-VP2对易感雏鸡的安全性试验

将rFPV-VP1-VP2接种CEF细胞扩繁，收集病毒液，进行不同浓度稀释，1日龄SPF雏鸡60只随机分为6组，试验组翅膀接种免疫途径接种不同浓度病毒液，分别为10²PFU/羽、10³PFU/羽、10⁴PFU/羽、10⁵PFU/羽、10⁶PFU/羽，另一组作为对照不做处理，负压隔离器中饲养，自由饮水采食，接种后每日观察，记录鸡群的发病、死亡情况，及时剖检死亡鸡，观察21d后剖检存活鸡，记录发病情况，结果见表3：

表3 rFPV-VP1-VP2不同剂量病毒对1日龄SPF鸡的致病力评估

实施例3：共表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的重组鸡痘病毒免疫效力检测

a.ELISA检测种鸡血清CAV抗体效价的变化

用FPV、rFPV-VP1-VP2翅膀接种免疫90日龄SPF种鸡50只，接种剂量为10⁵PFU/羽，阴性对照组用相同体积生理盐水相同方法接种。于免疫后的第0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d对所有试验鸡进行翅下采血并及时分离血清，然后用CAV抗体检测试剂盒(购自IDEXX公司，抗体滴度低于999为阴性，其检测CAV抗体最高滴度值为8861)检测试验鸡的抗体效价变化，结果如图9。结果表明在免疫后第7天开始，rFPV-VP1-VP2重组疫苗组产生的抗CAV的抗体高于鸡痘疫苗组和空白对照组。在免疫后第21天，抗体水平达到最高。

b.ELISA检测子代鸡母源CAV抗体效价的变化

用FPV、rFPV-VP1-VP2翅膀接种免疫90日龄SPF种鸡50只，接种剂量为10⁵PFU/羽，阴性对照组用相同体积生理盐水相同方法接种。产蛋后收集种蛋孵化(去除初生蛋和残破蛋)，孵化出的雏鸡分别在1d、7d、14d、21d、28d、35d进行翅下采血并及时分离血清，然后用CAV抗体检测试剂盒(购自IDEXX公司，抗体滴度低于999为阴性，其检测CAV抗体最高滴度值为8861)检测试验鸡的抗体效价变化，结果如图10。结果表明从第14天开始，rFPV-VP1-VP2重组疫苗组产生的母源抗体开始下降。

c.流式检测外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞亚群动态变化

用FPV、rFPV-VP1-VP2翅膀接种免疫90日龄SPF种鸡50只，接种剂量为10⁵PFU/羽，阴性对照组用相同体积生理盐水相同方法接种，产蛋后收集种蛋孵化(去除初生蛋和残破蛋)，孵化出的雏鸡，采集第七天血清，随机采取5只试验鸡的外周血2mL放入肝素抗凝管中，制备淋巴细胞悬液。用荧光标记的的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺单克隆抗体检测T淋巴细胞亚群动态变化并进行差异显著性分析(如图11)。结果显示：rFPV-VP1-VP2疫苗组外周血的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞含量显著高于空白组；rFPV-VP1-VP2疫苗组外周血的CD3⁺、CD4⁺T淋巴细胞含量显著高于rFPV组且两组之间CD8⁺T淋巴细胞含量差异不显著。以上结果表明：SPF鸡经过rFPV-VP1-VP2、rFPV疫苗免疫后，引起了CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的增加且rFPV-VP1-VP2疫苗免疫组更易引起CD4⁺T淋巴细胞的活化。

实施例4：共表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的重组鸡痘病毒免疫后攻毒保护率的测定

用rFPV-VP1-VP2翅膀接种免疫90日龄SPF种鸡，接种剂量为10³PFU/羽、10⁴PFU/羽、10⁵PFU/羽、10⁶PFU/羽，每组50只，对照组用相同体积生理盐水相同方法接种。产蛋后收集种蛋孵化(去除初生蛋和残破蛋)，收集一周内受精卵，孵化，每组设30只雏鸡，1日龄大腿肌肉注射接种2×10⁶TCID₅₀CAV(GD-1-12，流行强毒株，保存于华南农业大学家禽研究室)病毒液，另外对照组雏鸡加设一组无感染GD-1-12鸡，用于对照和统计发病情况。攻毒后观察21d解剖所有鸡，根据鸡的死亡、发病(解剖后胸腺萎缩出血、脾脏萎缩和肝脏肿大情况)计算发病率(见表4)，结果:rFPV-VP1-VP2的免疫剂量≥10⁵PFU/羽时可达到满意的保护效果，保护率100％。

表4 rFPV-VP1-VP2不同免疫剂量免疫保护率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> Fowlpox Virus

<400> 1

atggcaagac gagctcgcag accgagaggc cgattttacg ccttcagaag aggacggtgg 60

caccacctca agcgacttcg acgaagatat aaatttcgac atcggaggag acagcggtat 120

cgtagacgag cttttaggaa ggcctttcac aacccccgcc ccggtacgta tagtgtgagg 180

ctgccgaacc cccaatctac tatgactatc cgctttcaag gagtcatctt tctcacggaa 240

ggactcattc tacctaaaaa cagcacagcg gggggctatg cagaccacat gtacggggcg 300

agagtcgcca agatctctgt aaacctgaag gagttcctgc tagcgtcaat gaacctaaca 360

tacgtgagca aactcggagg ccccatcgcc ggtgagttga ttgcggacgg gtctaaatca 420

caagccgcgg agaactggcc taattgctgg ctgccgctag ataataacat gccctccgcg 480

acaccatcgg catggtggag atgggcctta atgatgatgc agcccacgga ctcttgccgg 540

ttctttaatc accctaagca aatgaccctg caagacatgg gtcgcatgtt tgggggctgg 600

cacctgttcc gacacattga aacccgcttt cagctccttg ccactaagaa tgagggatcc 660

ttcagccccg tggcgagtct tctctcccag ggagagtacc tcacgcgtcg ggacgatgtt 720

aagtacagca gcgatcacca gaaccggtgg cgaaaaggcg ggcaaccgat gacggggggt 780

attgcttatg cgaccgggaa aatgagaccc gacgagcaac agtaccctgc tatgccccca 840

gaccccccga taatcaccag tactacagcg caaggcacgc aagtccgctg catgaatagc 900

acgcaagctt ggtggtcatg ggacacatat atgagctttg caacactcac agcactcggt 960

gcacaatggt cttttcctcc agggcaacgt tcagtttcta gacggtcctt caaccaccat 1020

aaggcgagag gagccgggga tcccaaaggc cagaggtggc acacgctggt gccgctcggc 1080

acggagacca tcaccgacag ctacatggga gcgcccgcat cagagataga cactaatttc 1140

tttacgcttt acgtagcgca aggcacaaat aagtcgcagc agtacaagtt cggcacagct 1200

acatacgcgc taaaagagcc ggtaatgaag agcgattcat gggcagtggt acgcgtccag 1260

tcggtctggc aactgggtaa caggcagagg ccatacccat gggacgtcaa ctgggccaac 1320

agcaccatgt actgggggtc gcagccctga 1350

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> Fowlpox Virus

<400> 2

atgcacggga acggcggaca accggccgct gggggcagtg aatcggcgct tagccgagag 60

gggcaacctg ggcccagcgg agccgcgcag gggcaagtaa tttcaaatga acgctctcca 120

agaagatact caacccggac catcaacggt gttcaggcca ccaacaagtt cacggccgtt 180

ggaaacccct cactgcagag agatccggat tggtatcgct ggaattacaa tcactctatc 240

gctgtgtggc tgcgcgaatg ctcgcgctcc cacgctaaga tctgcaactg cggacaattc 300

agaaagcact ggtttcaaga atgtgccgga cttgaggacc gatcaaccca agcctccctc 360

gaagaagcga tcctgcgacc cctccgagta cagggtaagc gagctaaaag aaagcttgat 420

taccactact cccagccgac cccgaaccgc aagaaggtgt ataagactgt aagatggcaa 480

gacgagctcg cagaccgaga ggccgatttt acgccttcag aagaggacgg tggcaccacc 540

tcaagcgact tcgacgaaga tataaatttc gacatcggag gagacagcgg tatcgtagac 600

gagcttttag gaaggccttt cacaaccccc gccccggtac gtatagtgtg a 651

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> Fowlpox Virus

<400> 3

Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg

1 5 10 15

Arg Gly Arg Trp His His Leu Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe

20 25 30

Arg His Arg Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys Ala

35 40 45

Phe His Asn Pro Arg Pro Gly Thr Tyr Ser Val Arg Leu Pro Asn Pro

50 55 60

Gln Ser Thr Met Thr Ile Arg Phe Gln Gly Val Ile Phe Leu Thr Glu

65 70 75 80

Gly Leu Ile Leu Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Gly Tyr Ala Asp His

85 90 95

Met Tyr Gly Ala Arg Val Ala Lys Ile Ser Val Asn Leu Lys Glu Phe

100 105 110

Leu Leu Ala Ser Met Asn Leu Thr Tyr Val Ser Lys Leu Gly Gly Pro

115 120 125

Ile Ala Gly Glu Leu Ile Ala Asp Gly Ser Lys Ser Gln Ala Ala Glu

130 135 140

Asn Trp Pro Asn Cys Trp Leu Pro Leu Asp Asn Asn Met Pro Ser Ala

145 150 155 160

Thr Pro Ser Ala Trp Trp Arg Trp Ala Leu Met Met Met Gln Pro Thr

165 170 175

Asp Ser Cys Arg Phe Phe Asn His Pro Lys Gln Met Thr Leu Gln Asp

180 185 190

Met Gly Arg Met Phe Gly Gly Trp His Leu Phe Arg His Ile Glu Thr

195 200 205

Arg Phe Gln Leu Leu Ala Thr Lys Asn Glu Gly Ser Phe Ser Pro Val

210 215 220

Ala Ser Leu Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Leu Thr Arg Arg Asp Asp Val

225 230 235 240

Lys Tyr Ser Ser Asp His Gln Asn Arg Trp Arg Lys Gly Gly Gln Pro

245 250 255

Met Thr Gly Gly Ile Ala Tyr Ala Thr Gly Lys Met Arg Pro Asp Glu

260 265 270

Gln Gln Tyr Pro Ala Met Pro Pro Asp Pro Pro Ile Ile Thr Ser Thr

275 280 285

Thr Ala Gln Gly Thr Gln Val Arg Cys Met Asn Ser Thr Gln Ala Trp

290 295 300

Trp Ser Trp Asp Thr Tyr Met Ser Phe Ala Thr Leu Thr Ala Leu Gly

305 310 315 320

Ala Gln Trp Ser Phe Pro Pro Gly Gln Arg Ser Val Ser Arg Arg Ser

325 330 335

Phe Asn His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro Lys Gly Gln Arg

340 345 350

Trp His Thr Leu Val Pro Leu Gly Thr Glu Thr Ile Thr Asp Ser Tyr

355 360 365

Met Gly Ala Pro Ala Ser Glu Ile Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr

370 375 380

Val Ala Gln Gly Thr Asn Lys Ser Gln Gln Tyr Lys Phe Gly Thr Ala

385 390 395 400

Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Pro Val Met Lys Ser Asp Ser Trp Ala Val

405 410 415

Val Arg Val Gln Ser Val Trp Gln Leu Gly Asn Arg Gln Arg Pro Tyr

420 425 430

Pro Trp Asp Val Asn Trp Ala Asn Ser Thr Met Tyr Trp Gly Ser Gln

435 440 445

Pro

<210> 4

<211> 216

<212> PRT

<213> Fowlpox Virus

<400> 4

Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala

1 5 10 15

Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln

20 25 30

Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile

35 40 45

Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Asn His Ser Ile

65 70 75 80

Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn

85 90 95

Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu

100 105 110

Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu

115 120 125

Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser

130 135 140

Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln

145 150 155 160

Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp

165 170 175

Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile

180 185 190

Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr

195 200 205

Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val

210 215

Claims

1.一种鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征在于，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的保藏编号为：CCTCC NO:V201842。

2.根据权利要求1所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征在于，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的VP1、VP2核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征在于，所述疫苗所用的重组鸡痘病毒的VP1、VP2核苷酸序列分别为在SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或添加一个或多个核苷酸且编码SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的蛋白序列或与编码与其具有同等功能的核苷酸序列。

4.根据权利要求1～3所述的鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗在制备治疗鸡传染性贫血或鸡痘的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。

6.根据权利要求1～3所述的鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上可以接受的冻干保护剂。

7.一种鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：将分离到的鸡传染性贫血病毒流行毒株的VP1和VP2基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681的启动子下游，获得pSY681-VP1-VP2转移载体；将所述pSY681-VP1-VP2转移载体转染已感染亲本鸡痘病毒FPV株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡传染性贫血病毒流行毒株VP1和VP2的重组鸡痘病毒即得鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗。

8.根据权利要求7所述的鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸡痘病毒转移载体pSY681的早晚期启动子PE/L启动CIA的VP1基因的转录，所述鸡痘病毒转移载体pSY681的P11启动子启动大肠杆菌LacZ基因、CIA的VP2基因的转录。