CN112410307A - 新型编码鸡传染性法氏囊病毒vp2y的新城疫病毒及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用 - Google Patents

新型编码鸡传染性法氏囊病毒vp2y的新城疫病毒及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的鸡新城疫病毒株及其在制备新型生物佐剂二联疫苗中的应用。本发明提供的新城疫重组病毒rClone30‑VP2Y‑chGM‑CSF；新城疫重组病毒rClone30‑VP2Y‑chGM‑CSF中VP2Y如序列1第1‑195位氨基酸残基组成的蛋白质；其中chGM‑CSF如序列3自N末端第1‑144位氨基酸残基组成的蛋白质；本发明提供的不同位点的新城疫重组病毒rClone30‑VP2Y‑chGM‑CSF，具有诱导机体在免疫后7天产生抗体、增强机体的免疫应答等优点，将在鸡新城疫和鸡传染性法氏囊病的预防史上开辟一个新的局面。

Description

新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的新城疫病毒及其在制备 生物佐剂二联疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的鸡新城疫病毒株及其在制备新型生物佐剂二联疫苗中的应用。
背景技术
新城疫病(Newcastle Disease，ND)，又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)引起的一种禽类高度接触性和急性败血性的传染病，是严重危害世界养禽业的重大烈性传染病之一。NDV几乎可以感染所有禽类，病鸡是该病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24h，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4-5d内波及全群。
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，损伤鸡的中枢免疫器官——法氏囊，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前在全球范围内均有分布，是养禽业最重要疾病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。
目前，预防新城疫和传染性法氏囊病的主要方法是接种疫苗。新城疫的弱毒疫苗使用方便且能够诱导体液免疫和局部黏膜免疫，在国内外被普遍应用。传染性法氏囊病主要是用中等毒力疫苗，但会对接种鸡的法氏囊造成不同程度的损伤，导致免疫抑制，从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。然而，这些疫苗常常需要在首次接种后的14天左右才能产生相应保护抗体，即存在免疫空白期。如果新城疫或者传染性法氏囊病一旦爆发在疫苗接种的免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。因此，在新城疫和传染性法氏囊病的预防工作中，迫切需要可以刺激机体快速产生抗体从而缩短免疫空白期的高效且安全的新型弱毒疫苗。
本发明通过在新城疫疫苗基因组中引入佐剂基因(chGM-CSF)和在不同位点中引入鸡传染性法氏囊病毒的VP2Y基因，可以有效提高疫苗的免疫效果，极大缩短免疫空白期，提高免疫保护率，同时选择的插入位点并不影响重组病毒的工业生产性能。我们也可以将插入佐剂chGM-CSF基因的新城疫疫苗基因组中，按照插入鸡传染性法氏囊病毒的VP2Y基因的方式，制备可以预防鸡的其他病毒传染性疾病，比如鸡禽流感、鸡传染性支气管炎等。
发明内容
本发明的目的之一：提供新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)(将鸡传染性法氏囊病毒的VP2Y基因和鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(chGM-CSF)这种新型分子佐剂插入到新城疫经典疫苗株Lasota的P和M基因之间)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)(将鸡传染性法氏囊病毒的VP2Y基因和chGM-CSF这种新型分子佐剂以VP2Y-IRES-chGM-CSF的方式插入到新城疫经典疫苗株Lasota的P和M基因之间)和rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)(将鸡传染性法氏囊病毒的VP2Y基因插入到新城疫经典疫苗株Lasota的NP基因和chGM-CSF这种新型分子佐剂插入到新城疫经典疫苗株Lasota的P和M基因之间)。
本发明的目的之二：提供了不同位点的重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF在预防鸡新城疫和鸡传染性法氏囊病方面的应用。疫苗免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，将免疫空白期从14天缩短为7天，弥补了现有新城疫和鸡传染性法氏囊病疫苗产生抗体时间过长的缺点。同时亦可增强疫苗的免疫效果。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF及其基因组核苷酸序列、蛋白质序列和VP2Y基因插入新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF的方式，以及其产品在预防新城疫和/或鸡传染性法氏囊病均为本发明的保护范围。
本发明构建的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间分别插入VP2Y基因和chGM-CSF基因(如图7A)；构建的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间插入VP2Y-IRES-chGM-CSF基因(如图7B)；构建的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其NP基因插入VP2Y基因和其P基因和M基因之间插入chGM-CSF基因(如图7C)。所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF中VP2Y为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-195位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF中chGM-CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；
编码所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF的VP2Y和chGM-CSF基因也属于本发明的保护范围。
所述基因中，编码所述VP2Y的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-585位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
编码所述chGM-CSF的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列4自5’末端第1-432位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒均属于本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF的相关制剂为本发明保护的范围。
本发明构建的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，其相应制剂，如：冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等，均属本专利保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF及其基因组核苷酸序列和蛋白质序列为本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF在预防新城疫和传染性法氏囊病方面的应用为本发明保护范围。
所述的新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF在预防鸡其他病毒传染性疾病方面的应用为本发明保护范围。
本发明提供了新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF，免疫7天后，rClone30-VP2Y-chGM-CSF和rClone30-GM-CSF组产生抗NDV抗体水平高出对照组rClone30组和对照组。并且，rClone30-VP2Y-chGM-CSF疫苗能保护鸡免受NDV强毒和IBDV强毒的攻击。表明rClone30-VP2Y-chGM-CSF疫苗免疫可在早期先于rClone30和rClone30-VP2Y疫苗株刺激鸡体内产生抗体并同时增强了体液免疫水平，提高攻毒保护效率。
附图说明
图1为构建的不同位点的pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF质粒的PCR鉴定图谱。图A-1为pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图A-2为pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段；图B-1为pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图B-2为pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段；图C-1为pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图C-2为pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段。
图2为反向遗传操作系统拯救出的不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF病毒血凝(HA)。图A为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)病毒血凝(HA)；图B为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)病毒血凝(HA)；图C为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)病毒血凝(HA)。
图3为利用RT-PCR方法鉴定不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF。图A-1为pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图A-2为pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段；图B-1为pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图B-2为pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段；图C-1为pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)质粒的VP2Y基因片段；图C-2为pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)质粒的chGM-CSF基因片段。
图4为利用ELISA检测不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF感染DF-1细胞后的细胞上清中的外源蛋白的表达量。图A-1为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)病毒的VP2Y蛋白表达量；图A-2为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)病毒的chGM-CSF蛋白表达量；图B-1为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)病毒的VP2Y蛋白表达量；图B-2为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)病毒的chGM-CSF蛋白表达量；图C-1为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)病毒的VP2Y蛋白表达量；图C-2为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)病毒的chGM-CSF蛋白表达量。rClone30为rClone30感染细胞对照组。
图5为不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF在感染细胞中动力生长曲线。图A为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)病毒的动力生长曲线；图B为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)病毒的动力生长曲线；图C为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)病毒的动力生长曲线。
图6为实验SPF鸡只免疫rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y、rClone30-GM-CSF和rClone30后不同时间点HI抗体效价和IBDV抗体效价。图A为rClone30-VP2Y-chGM-CSF病毒的HI抗体效价；图B为rClone30-VP2Y-chGM-CSF病毒的IBDV抗体效价。
图7为构建的不同位点的重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF结构示意图。图A为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)的结构示意图；图B为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)结构示意图；图C为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)结构示意图。
具体实施方案：
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：不同位点的pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF的构建和鉴定
1.1pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用Sac II和Pem I对pUC18-chGM-CSF和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将chGM-CSF片段与rClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-chGM-CSF。
利用Sac II对pUC18-VP2Y和pBrClone30-chGM-CSF进行酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将VP2Y片段与pBrClone30-chGM-CSF载体相连，构建重组质粒pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF。
结果如图1A所示，VP2Y大小约580bp、chGM-CSF大小约450bp，表明成功构建pBrClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)。
1.2pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用overlap PCR将VP2Y、IRES与chGM-CSF基因连接在一起，采用凝胶回收试剂盒回收片段，与T载体连接，构建重组质粒VP2Y-IRES-chGM-CSF-T。利用Sac II和Pem I对VP2Y-IRES-chGM-CSF-T和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将VP2Y-IRES-chGM-CSF片段与rClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)。
结果如图1B所示，VP2Y大小约580bp、chGM-CSF大小约450bp，表明成功构建pBrClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)。
1.3pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用Sac II和Pem I对pUC18-chGM-CSF和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将chGM-CSF片段与rClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-chGM-CSF。
PCR IRES-VP2Y基因和利用Aat II和Apa I对pBrClone30-chGM-CSF进行酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将IRES-VP2Y片段与pBrClone30-chGM-CSF载体利用同源重组试剂盒相连，构建重组质粒pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)。
结果如图1C所示，VP2Y大小约580bp、chGM-CSF大小约450bp，表明成功构建pBrClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)。
实施例2：不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF的拯救、HA检测以及RT-PCR鉴定
2.1rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图2A：HA效价为512。将成功拯救重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增VP2Y和chGM-CSF。结果如图3A所示，扩增片段大小分别约为580bp和450bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)。
2.2rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图2B：HA效价为512。将成功拯救重组病毒rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增VP2Y和chGM-CSF。结果如图3B所示，扩增片段大小分别约为580bp和450bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)。
2.3rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图2C：HA效价为512。将成功拯救重组病毒rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增VP2Y和chGM-CSF。结果如图3C所示，扩增片段大小分别约为580bp和450bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)。
实施例3：ELISA检测外源基因VP2Y和chGM-CSF表达量
将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，鸡胚接种尿囊液病毒以DMEM适当倍数稀释，以0.1MOI的重组rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)和rClone30分别感染细胞，37℃，孵育1h后用DMEM洗涤三遍，然后加入完全DMEM继续培养。48h后反复冻融3次，取细胞上清检测外源基因VP2Y和chGM-CSF表达量。具体步骤按照试剂盒的说明书操作。加入50μL终止液(2mol/L的H2SO4)后，用酶标仪于波长450nm下检测其OD值。设置rClone30为对照组。
结果如图4所示，ELISA结果表明rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)和rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)能够稳定表达VP2Y和chGM-CSF外源蛋白。
实施例4：不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF细胞稳定增殖分析
培养DF-1细胞至对数期时，将其接入细胞六孔板，并按照0.1MOI的剂量分别将病毒接于细胞单层上，用含有5％CS和1μg/mL胰蛋白酶的DMEM完全培养基作为细胞培养液。置于5％CO2，37℃连续培养数天，每隔24h收获细胞上清液，并分别测定其TCID50。如图5所示，携带外源基因的重组NDV rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)与NDV rClone30亲本株保持着一致的繁殖滴度。
实施例5：不同位点的rClone30-VP2Y-chGM-CSF免疫鸡后HI抗体效价的测定
将14日龄SPF鸡随机分为7组，每组10只。rClone30、rClone30-GM-CSF、rClone30-VP2Y、rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)、rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)和rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)分别以105TCID50/0.1ml通过肌肉注射方式免疫，剂量为200μL/只，空白组以相同剂量的0.9％生理盐水代替。各组鸡免疫后7d、14d、21d翅静脉采血分离血清，按常规方法检测NDV HI抗体效价和用IDEXX IBDV ELISA试剂盒检测抗IBDV抗体效价。结果如图6。
实施例6：攻毒试验
将30日龄SPF鸡随机分为7组，每组20只。免疫后7d，分别对试验鸡进行攻毒保护性试验，每组10只鸡用NDV强毒BJ株，以104ELD50/0.1ml剂量经肌肉注射途径进行攻毒，当对照组试验鸡全部死亡时，统计各组发病与死亡情况；每组剩下10只鸡用IBDV BC6/85强毒，以100BID50/0.1ml剂量经口服途径进行攻毒，96h后剖检每组鸡的法氏囊病变情况。NDV强毒攻毒结果如下：
Figure BDA0002793814430000091
IBDV强毒攻毒结果如下：
Figure BDA0002793814430000092
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 新型编码鸡传染性法氏囊病毒VP2Y的新城疫病毒及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 195
<212> PRT
<213> 鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus)
<400> 1
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asn Asp Tyr Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser
85 90 95
Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr
100 105 110
Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly
115 120 125
Gly Gln Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala
130 135 140
Val Thr Ile His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Leu Ile Thr
145 150 155 160
Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu Ile
165 170 175
Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Tyr Thr
195
<210> 2
<211> 585
<212> DNA
<213> 鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus)
<400> 2
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
ggtggtggtg gttctgatag gcccagagtc tacaccataa ctgcagccaa tgactaccaa 240
ttctcatcac agtaccaagc aggtggagtg acaatcacac tgttctcagc aaacatcgat 300
gccatcacaa gcctcggtgg tggtggttct ataacccagc caatcacatc catcaaactg 360
gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt 420
gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc ggtggtggtg gttctaagaa cctgatcaca 480
gaatacggcc gatttgaccc aggggccatg aactacacaa aactgatact gagtgagagg 540
gaccgtcttg gcatcaagac cgtgtggcca acaagggagt acacc 585
<210> 3
<211> 144
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 3
Met Leu Ala Gln Leu Thr Ile Leu Leu Ala Leu Gly Val Leu Cys Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Thr Thr Thr Tyr Ser Cys Cys Tyr Lys Val Tyr Thr Ile
20 25 30
Leu Glu Glu Ile Thr Ser His Leu Glu Ser Thr Ala Ala Thr Ala Gly
35 40 45
Leu Ser Ser Val Pro Met Asp Ile Arg Asp Lys Thr Cys Leu Arg Asn
50 55 60
Asn Leu Lys Thr Phe Ile Glu Ser Leu Lys Thr Asn Gly Thr Glu Glu
65 70 75 80
Glu Ser Gly Ile Val Phe Gln Leu Asn Arg Val His Glu Cys Glu Arg
85 90 95
Leu Phe Ser Asn Ile Thr Pro Thr Pro Gln Val Pro Asp Lys Glu Cys
100 105 110
Arg Thr Ala Gln Val Ser Arg Glu Lys Phe Lys Glu Ala Leu Lys Thr
115 120 125
Phe Phe Ile Tyr Leu Ser Asp Val Leu Pro Glu Glu Lys Asp Cys Ile
130 135 140
<210> 4
<211> 432
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 4
atgctggcac agctgactat tctgcttgca ctgggggtgc tgtgcagccc tgcaccaact 60
actacttact cctgctgcta caaagtgtac actatcctgg aagaaataac tagtcacttg 120
gagagcactg cagcaactgc aggtctgtcc tctgtaccaa tggacatcag ggataaaact 180
tgtctgcgta acaacctgaa aactttcata gagtccttga aaactaatgg gactgaggaa 240
gaaagcggaa tcgtctttca gctgaacaga gttcacgagt gtgaacgcct gttctctaac 300
ataactccaa ccccacaggt tcctgataag gaatgtagaa ctgcacaagt atctagggaa 360
aaattcaaag aggcattaaa aactttcttt atttacctgt ctgatgtgct gccagaggag 420
aaagactgca tc 432

Claims (9)

1.新型新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF。新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间分别插入VP2Y基因和chGM-CSF基因；新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-IRES-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间插入VP2Y-IRES-chGM-CSF基因；新城疫重组病毒rClone30-VP2Y(NP)-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其NP基因插入VP2Y基因和其P基因和M基因之间插入chGM-CSF基因。
所述新型新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF中VP2Y为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-195位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；所述新型新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF中chGM-CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF VP2Y的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-585位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF chGM-CSF的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列4自5’末端第1-432位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
4.含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒均属于本发明的保护范围。
5.权利要求1所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF和权利要求2所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF基因在制备相关产品中的应用。
6.权利要求1所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF和权利要求2所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF基因在在预防新城疫和/或鸡传染性法氏囊病的应用。
7.权利要求1所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF和权利要求2所述新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF基因在制备新型生物佐剂二联疫苗中的应用。
8.所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-VP2Y-chGM-CSF及其基因组核苷酸序列和蛋白质序列为本发明的保护范围。
9.所述的新城疫重组病毒及其构建方式在预防鸡其他病毒传染性疾病方面的应用为本发明保护范围。
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