CN110484515B

CN110484515B - 一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用

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Publication number: CN110484515B
Application number: CN201910824667.6A
Authority: CN
Inventors: 何雷; 杨梓; 赵战勤; 王臣; 张春杰; 郁川; 李新新; 王海蓉
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110484515A

Abstract

本发明涉及一种预防FAdV‑4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用，属于FAdV‑4和NDV预防技术领域。本发明针对FAdV‑4病毒的结构特征，选取了FAdV‑4的保护性抗原Fiber 1蛋白作为研发对象，通过构建表达Fiber 1的重组新城疫病毒，进而研发出能预防FAdV‑4和NDV的新型基因工程疫苗，该疫苗的研发不仅可以为FAdV‑4的防控提供重要工具，而且疫苗载体本身选取新城疫病毒的LaSota毒株，该毒株为生产中常用的疫苗毒株，可以起到“一苗防两病”的效果，从而简化疫苗免疫程序。

Description

一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用，属于FAdV-4和NDV预防技术领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，是一种无囊膜的双链DNA病毒。禽腺病毒可分为3个亚群，包括I、II和III群，其中禽腺病毒Ι群又包括十二种血清型，不同的血清型均可感染鸡群。禽腺病毒血清型4(FAdV-4)是心包积水综合征(HPS)，肝炎-心包积水综合征(HHS)和包涵体肝炎(IBH)的病原体，对家禽业造成重大经济损失。由FAdV-4引起的疾病在3-6周龄时影响肉鸡，主要以肝炎、肾炎和感染动物心包内透明或淡黄色液体积聚为特征，其死亡率从10％到100％不等。

FAdV-4病毒颗粒是二十四面体对称的球状衣壳蛋白，衣壳蛋白各面呈三角形，面由直径为8-10nm六邻体(Hexon蛋白)壳粒组成，顶点是五邻体基底(penton)，在腺病毒的各个顶点，五邻体基底连接有蛋白纤维(Fiber)，包括长纤维(Fiber 1)和短纤维(Fiber 2)。它们被确定为潜在的亚单位疫苗免疫原体。在病毒表面暴露的衣壳结构中，FAdV-4的长纤维(Fiber 1)和短纤维(Fiber 2)在其N-末端侧与戊聚糖基蛋白非共价结合，负责病毒的毒力，并在通过与细胞受体相互作用，在病毒衣壳的附着上发挥重要作用。

就抗原性而言，Fiber 1和Fiber 2被确定为潜在的亚单位疫苗的抗原，因为它能够有效的保护动物免于腺病毒感染，且已有许多研究证明使用Fiber 1和Fiber 2蛋白免疫鸡能够使鸡产生中和抗体，对强毒株的功能起到免疫保护作用，是基因工程疫苗开发的靶点之一。Fiber1和Fiber 2纤维蛋白上含有的抗原决定簇，能够决定病毒的型或亚型，并且蛋白纤维的长度也与病毒的抗原性息息相关。Fiber 2基因编码的蛋白在病毒与细胞受体的相互作用时可以发挥毒力，并在病毒衣壳的附着上发挥重要作用，对病毒的侵袭和增殖等过程密切相关。Fiber 1基因编码的蛋白诱导中和抗体的产生，且当缺失Fiber 1基因时，病毒离子的增殖、组装和扩散的某个阶段会受到严重影响，进而导致病毒无法复制。Wang等报道通过大肠杆菌系统原核表达的重组Fiber 1蛋白和Fiber 2蛋白免疫SPF鸡后，在FAdV强毒株的攻毒情况下，可以为鸡只提供100％的保护率(Wang,X.,Tang,Q.,Chu,Z.,Wang,P.,Luo,C.,Zhang,Y.,Fang,X.,Qiu,L.,Dang,R.,Yang,Z.,2018.Immune protectionefficacy of FAdV-4surface proteins fiber-1,fiber-2,hexon and pentonbase.Virus Res 245,1-6.)。

近年来，依托于反向遗传系统这一强大技术平台，人们对新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)的认识不断加深，尤其在致病机制、病毒基因结构与功能，以及构建新型病毒载体等方面都取得了长足的进步。NDV作为疫苗载体具有诸多优势，首先，NDV在细胞浆中复制，整个生命周期没有DNA生成，消除了与宿主细胞DNA整合的可能性，安全性高，遗传稳定性好。其次，NDV能够在多种禽类病原感染的呼吸道和消化道中增殖，并诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫应答，应用范围广。此外，NDV可在多种细胞系及鸡胚中增殖并能达到很高的滴度，成本低廉、便于大规模推广应用。

目前，已有多种以NDV为载体的禽类二价疫苗被广泛研究甚至应用于生产实践当中。Ge等以NDV弱毒株LaSota为载体成功构建并拯救了表达禽流感病毒HA基因的重组病毒rLa-H5w与r La-H5m。用这两种重组病毒分别免疫1周龄SPF雏鸡后，免疫组雏鸡不仅能够完全抵御NDV标准强毒株F48E9的攻击，而且对BHG/QH/05毒株以及异源高致病性禽流感病毒GS/GD/96毒株产生100％的保护率(Ge,J.,Deng,G.,Wen,Z.,Tian,G.,Wang,Y.,Shi,J.,Wang,X.,Li,Y.,Hu,S.,Jiang,Y.,Yang,C.,Yu,K.,Bu,Z.,Chen,H.,2007.Newcastledisease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens andmice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1avian influenzaviruses.J Virol 81,150-158.)。Zhao等也以NDV弱毒株LaSota为载体，构建了表达传染性喉气管炎病毒的(ILTV)gB和gD的重组病毒rLS/ILTV-gB和rLS/ILTV-gD，免疫鸡群同样获得了对NDV强毒与ILTV强毒超过90％的保护率，达到了与商用疫苗相同的保护水平(Zhao,W.,Spatz,S.,Zhang,Z.,Wen,G.,Garcia,M.,Zsak,L.,Yu,Q.,2014.Newcastle disease virus(NDV)recombinants expressing infectious laryngotracheitis virus(ILTV)glycoproteins gB and gD protect chickens against ILTV and NDV challenges.JVirol 88,8397-8406.)。但是，目前关于新城疫病毒和FAdV-4联合预防的疫苗的报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体，该疫苗载体包含FAdV-4和NDV的关键基因。

本发明还提供了上述预防FAdV-4和NDV的疫苗载体，能够简单方便的获得该疫苗载体。

本发明还提供了上述预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的应用，为FAdV-4和NDV的预防提供一个新的途径。

本发明还提供了一种预防FAdV-4和NDV的疫苗，该疫苗能够较好的预防FAdV-4和NDV。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体，该疫苗载体为NDV LaSota疫苗株，所述NDVLaSota疫苗株的P基因和M基因之间插入有FAdV-4的Fbier 1基因；所述Fbier 1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明将为新城疫和禽腺病毒病的预防提供有效手段，并且可以简化疫苗免疫程序，起到“一苗防两病”的效果。本发明构建的表达FAdV-4的Fiber 1蛋白的NDV疫苗载体具有良好的疫苗免疫保护效果，良好的鸡胚安全性和高滴度的增殖特性，可为FAdV-4的防控提供行之有效的新型疫苗。

在本发明的研究中，选用了FAdV-4的Fiber 1基因和Fiber 2基因分别插入至NDVLaSota疫苗株中，结果发现表达Fiber 2蛋白的NDV病毒的病毒增殖能力显著低于亲本毒株，并且其免疫保护效果也低于本发明所构建的表达禽腺病毒4型Fiber-1蛋白的重组新城疫病毒，因此本发明中最终选用FAdV-4的Fiber 1基因插入至NDV LaSota疫苗株中，以制备FAdV-4的二价疫苗。

上述预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的制备方法，包括：将FAdV-4的Fbier 1基因插入至NDV LaSota疫苗株的P基因和M基因之间，即得。

本发明中将FAdV-4的Fbier 1基因通过基因工程的方式插入到市售的NDV LaSota疫苗株的P基因和M基因之间，即得到预防FAdV-4和NDV的疫苗载体。

所述NDV LaSota疫苗株的由新城疫Lasota株(GenBank accessionno.JF950510.1)全长cDNA扩增后构建入转录载体TVT7R(0.0)，得到。为了方便Fiber 1的准确插入，所述NDV LaSota疫苗株P基因和M基因之间设置有人工序列，该人工序列如SEQ IDNO.2所示。

优选的，在制备疫苗载体时，使用如下引物以FAdV-4病毒DNA为模板扩增Fbier 1基因：

Fiber 1for LS F：5’-ATAGTTGTAGCCACCATGTCGGCCCTAATCGCCTCC-3’，

Fiber 1for LS R：5’-ACGGTAGTTACACACTTAGGGGCCCGGAGCATTG-3’；

使用如下引物以NDV LaSota疫苗株为模板扩增LS-vector-P/M载体骨架片段：

LS vector P/M F：5’-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-3’，

LS vector P/M R：5’-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-3’；

使用In-Fusion酶将扩增的Fbier 1基因和NDV LaSota疫苗株骨架片段连接，即得。

上述引物为根据如SEQ ID NO.2所示的人工序列所设计，这些引物使得扩增的片段能够通过同源序列融合的方式获得本发明中的疫苗载体，制备过程简单方便，成功率高。

预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的应用，具体的所述疫苗载体在制备预防由FAdV-4和/或NDV所致疾病的疫苗中的应用。

本发明中的疫苗载体可以同时预防FAdV-4和NDV所致疾病，对于其中任一病毒都具有较好的预防效果。

一种预防FAdV-4和NDV的疫苗，将上述的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体接种至鸡胚尿囊腔中进行扩增，收集鸡胚尿囊液即得。

具体的，上述的预防FAdV-4和NDV的疫苗，还包括生物制剂中可接受的固相载体或液相载体；仍然具有较好的预防效果。

截止目前，尚国内外还没有针对FAdV-4毒株的有效的商品化疫苗，本发明针对FAdV-4病毒的结构特征，选取了FAdV-4的Fiber 1蛋白作为研发对象，通过构建表达Fiber1的重组新城疫病毒，进而研发出能预防FAdV-4和NDV的新型基因工程疫苗，该疫苗的研发不仅可以为FAdV-4的防控提供重要工具，而且疫苗载体本身选取新城疫病毒的LaSota毒株，该毒株为生产中常用的疫苗毒株，可以起到“一苗防两病”的效果，从而简化疫苗免疫程序。通过NDV的反向遗传平台构建表达FAdV-4的基因工程疫苗在国内外尚属于首次，具有重要的研究价值和应用前景。此外，重组NDV疫苗株使用SPF鸡胚进行生产，生产成品低廉，具有重要的产业优势。综上所述，建立该检测方法并构建的疫苗株具有很好的市场前景，可带来良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明中FAdV-4的Fiber 1基因的PCR扩增结果图；

图2为本发明中LS-vector-P/M载体骨架片段的PCR扩增结果图；

图3为本发明中构建的重组质粒pLS-fiber 1的结构示意图；

图4为本发明中所制备的rLS-Fiber 1的免疫荧光检测结果图；

图5为本发明中的疫苗免疫后各个组的FAdV-4抗体水平结果对比图；

图6为本发明中的疫苗免疫后各个组的NDV的抗体水平结果对比图；

图7为本发明中的疫苗初次免疫后各组攻毒临床评分结果对比图；

图8为本发明中的疫苗二次免疫后各组攻毒临床评分结果对比图；

图9为本发明中攻毒FAdV-4后各组的病理剖检结果对比图；

图10为本发明中攻毒FAdV-4后各组的病理切片结果对比图；

图11为本发明中的疫苗单次免疫后各组死亡率统计结果对比图；

图12为本发明中的疫苗二次免疫后各组死亡率统计结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例及试验例中使用到的FAdV-4病毒是由本实验室分离保存提供。NDV LaSota疫苗株的由新城疫Lasota株(GenBank accession no.JF950510.1)全长cDNA扩增后构建入转录载体TVT7R(0.0)得到，命名为pLS-Vector。TVT7R(0.0)由美国Alabama大学L.Andrew Ball教授惠赠。辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L质粒通过将表达新城疫病毒N、P和L基因(基因序列见GenBankaccession no.JF950510.1)连接入Promega公司pCI-neo质粒构建完成。感受态细胞stble-2购自上海唯地生物技术有限公司。GXL高保真polymerase购自宝生物(大连)有限公司。PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase AD购自安捷伦有限公司。In-Fusion试剂盒购自Clontech公司。微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒和高纯度质粒小提中量提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯。

预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法的实施例1

本实施例中预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的制备方法，包括如下步骤：

为了研究FAdV-4中的基因与NDV LaSota疫苗株的匹配效果，本发明中同时构建了Fiber1和Fiber 2的疫苗载体。

1、引物设计

为了构建重组FAdV-4的Fiber 1和Fiber 2的真核表达载体，本实验通过genbank查询获得FAdV-4的基因组序列，选取距离目的基因Fiber 1和Fiber 2约100bp的保守序列设计引物ade-Fiber 1F、ade-Fiber 1R，ade-Fiber 2F和ade-Fiber 2R，从而保证目的基因序列不受人为引物设计而出现碱基突变，并将此片段分别命名为ade-Fiber 1和ade-Fiber2。在成功扩增出ade-Fiber 1和ade-Fiber 2后，根据测序结果进行Fiber 1的新的引物设计Fiber 1for LS F，Fiber1for LS R，Fiber 2for LS F和Fiber 2for LS R(如表1所示)。

表1 PCR扩增引物序列

2、Fiber 1和Fiber 2基因的PCR扩增

(1)取FAdV-4病毒液为模板，按照表2和表3的反应体系和反应条件分别对ade-Fiber1，2进行PCR扩增。

表2 ade-Fiber 1，2的PCR反应体系(50μL)

表3 ade-Fiber 1，2的PCR扩增反应条件

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物ade-Fiber 1和ade-Fiber2(参照微柱浓缩DNA凝胶回收试剂盒说明书)，回收后送检测序，并放于-20℃备用。在上步实验成功的基础上，以胶回收的ade-Fiber 1和ade-Fiber 2作为模板，以Fiber 1for LSF，Fiber 1for LS R，Fiber 2for LS F和Fiber 2for LS R为引物，进行Fiber 1和Fiber 2基因的PCR扩增，PCR扩增的反应体系和条件见表4、表5。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物Fiber 1和Fiber 2，测量核酸浓度，-20℃保存备用。

表4 Fiber 1和Fiber 2PCR反应体系(50μL)

表5 Fiber 1和Fiber 2的PCR扩增反应条件

通过两次PCR，本发明成功扩增到了FAdV-4的Fiber 1和Fiber 2基因，经基因测序表明Fiber 1的片段大小为1296bp(如SEQ ID NO.1所示)，Fiber 2为1440bp，没有碱基的缺失，突变和插入。本发明所选用的Fiber 1基因的扩增结果如图1所示，M：DNA Marker；1、2：FAdV-Fiber1的PCR扩增产物。

3、质粒LS-Vector的克隆及载体PCR扩增

(1)首先，为了获得LS-vector-P/M载体骨架片段，在LaSota基因组的3191至3192位之间插入一段长度为198bp的人工序列(如SEQ ID NO.2所示)，该序列保证了目的基因准确的插入至LaSota的P和M基因之间。随后，以质粒LS-Vector质粒为模板，采用50μL的PCR反应体系进行LS-vector-P/M载体扩增，所用引物为LS vector P/M F和LS vector P/M R，其序列如下所示：

LS vector P/M F：3’-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-5’(如SEQ ID NO.11所示)；

LS vector P/M R：3’-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-5’(如SEQ ID NO.12所示)。

反应体系与反应条件表6、表7所示。

表6 LS-vector-P/M载体骨架片段的PCR反应体系(50μL)

表7 LS-vector-P/M载体骨架片段扩增的反应条件

(2)由于实验所用模板质粒是从细菌中提取而来，细菌甲基化酶在细菌进行繁殖时，会甲基化细胞自身的DNA，而其甲基化修饰部分于真核表达载体的构建无益。因此在上一步反应结束后需使用DpnΙ酶处理，清除模板干扰的反应体系和反应条件如下表8、表9所示。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，使用蓝光切胶仪切胶，按上述胶回收方法回收载体骨架片段，定量分析其浓度，-20℃保存备用。

表8 DpnΙ酶清除模板体系(50μL)

表9 DpnΙ酶清除模板反应条件

结果如图2所示，M：DNA Marker；1、2：LS-vector-P/M的PCR扩增产物。本发明中成功扩增到了LS-vector-P/M载体骨架片段。

4、In-Fusion方法构建重组真核表达载体

(1)将上述步骤中的得到的已经测量过浓度的目的基因片段Fiber 1和Fiber 2分别与LS-vector-P/M载体骨架片段混合，使用In-Fusion酶进行融合。融合反应体系参照表10，反应条件参照表11，分别进行连接构建，并命名为pLS-Fiber 1和pLS-Fiber 2。

表10重组表达载体构建反应体系(10μL)

表11重组表达载体构建反应条件

注：连接产物长久保存时需放在-20℃。

(2)转化

①将上述In-Fusion方法所连接的重组真核表达载体冰浴5min，同时取感受态细胞Stble2于冰上，冰浴融化后将感受态细胞分装在无菌的EP管中，每管50μL。

②将5μL连接产物在低温下，旋转缓慢加入到感受态细胞Stble2中，冰浴30min。

③将EP管放在42℃水中，水浴热激25s后，再放在冰上冰浴2min。

④向EP管中加入900μL的SOC培养基，在30℃，180rmp的恒温摇床中培养90min。

⑤12000rmp离心菌液，弃去上清液，再加入100μL的SOC培养基，悬浮混匀后进行涂板(LB+C)，培养34-36h。

⑥挑取单菌落，做好标记，分别转接到含有羧苄西林的LB液体培养基中，30℃，180rmp的恒温摇床中培养12-14h。然后提取质粒进行测序，获得连接正确的pLS-Fiber 1(其结构如图3所示)和pLS-Fiber 2质粒。

其中pLS-Fiber 1质粒为本发明中构建得到的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体。

预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的应用的实施例1

表达禽腺病毒Fiber 1和Fiber 2蛋白的新城疫病毒的拯救及生物学特性检测。

本发明已经成功将FAdV-4的Fiber 1和Fiber 2基因插入至NDV LaSota疫苗株的P基因和M基因之间，构建了表达Fbier1和Fiber 2的pLS-Fiber 1和pLS-Fiber 2重组质粒，pLS-Fiber1结构如图3所示。

1、表达禽腺病毒Fiber 1和Fiber 2蛋白的质粒的细胞转染

(1)实验前将BHK-21细胞传代至六孔板，待细胞状态良好时，弃去6孔板内培养基，向每个孔加入1.5mL Opti-MEM无血清培养基，每孔加入表达T7RNA酶的痘病毒(MVA-T7病毒)，静置于37℃培养箱备用。

(2)DNA和脂质体预混合准备：离心管A：加入750μL Opti-MEM无血清培养基和45μLLipofectamine 3000，涡旋振荡2～3s混合均匀，平均分装6管；离心管B：加入750μL Opti-MEM无血清培养基和30μL Lipofectamine 3000，平均分装6管，每管加入1μg的质粒pLS-Fiber 1或者质粒pLS-Fiber 2(每种质粒三管)，同时加入辅助质粒1μg pCI-N、0.5μg pCI-P和0.1μg pCI-L。

(3)将离心管B中的混合试剂加入到离心管A中，室温静置15min。

(4)将复合物滴加到对应六孔板中，轻微晃动六孔板使复合物混合均匀。置于37℃、5％CO₂培养箱静置培养36-48h。

2、转染产物的鸡胚尿囊腔接种

转染48小时后，用封口膜密封将6孔细胞板，转移到-80℃低温冰箱中，反复冻融3次，液体移至离心管中，12000r离心2min，吸出上清，收获拯救的重组病毒。在鸡胚尿囊腔处寻找血管较少处进行标记，在超净工作台中用打孔器在标记处打一小孔，用注射器从打孔处进入向鸡胚注射0.1mL病毒，用石蜡严密封口，在37℃保温箱中培养。每天观察鸡胚状态并在24h内弃去死胚。培养96h后，将所有鸡胚置于4℃过夜，致死鸡胚，然后收集尿囊液。首先使用小镊子将壳膜撕开，露出气室，用移液管吸收透明的尿囊液(尿囊液中表达Fiber-1的NDV病毒即为实验所用疫苗)。置于4℃保存备用。

3、拯救病毒的鉴定及传代

(1)重组病毒的HA鉴定

调节移液器至50μL，吸取PBS缓冲液加入96孔板中。在第一纵排孔中加入50μL尿囊液，吹打15至20次混合，并吸取50μL液体注入第二纵排孔。再次吹打15至20次，混合并取50μL液体将其添加到第三纵排孔中。依此类推，直到添加到第11纵排孔中，吹打混合，然后吸取50μL并与枪头一起丢弃。第12纵排孔为对照。每孔中加50μL1％鸡红细胞悬液，混匀，置于25℃培养箱中20～30分钟，观察结果。

观察结果：鸡红细胞出现明显的凝集现象，说明本发明成功拯救出了表达禽腺病毒Fiber1和Fiber 2蛋白的新城疫病毒。

(2)重组病毒的传代培养

稀释病毒后，接种9至11日龄的SPF鸡胚。使用照蛋器标记出鸡胚尿囊腔的位置，转入超净工作台中，使用打孔器在标记上打孔，将0.1～0.2mL的病毒注入鸡胚。用石蜡严密封口，转入37℃培养箱中培养。于48～96小时左右收获病毒，然后再将收获的病毒液按同样方法再次进行鸡胚注射，收获病毒。对第三代病毒进行HA测定。

4、重组病毒生物学特性检测

(1)EID₅₀的测定

用PBS缓冲液连续稀释病毒，取稀释度为2³、2⁴、2⁵、2⁶、2⁷的病毒分别接种于9～11日龄SPF鸡胚各5枚，每枚鸡胚尿囊接种量为0.1mL，置于37℃恒温培养箱中培养，每天照蛋，弃掉24h内死亡的鸡胚，至第五天，将所有鸡胚置于4℃过夜后，收获每枚鸡胚的尿囊液，进行血凝实验，HA实验呈阳性时判断为感染，计算EID₅₀结果。

(2)TCID₅₀的测定

在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，取稀释度为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶的病毒接种在96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔100μL，并向每孔加入100μL细胞悬液，将最后两个纵行设置为对照，向每个孔中加入100μL培养基和100μL细胞悬浮液，并且每天观察细胞病变状况并记录结果。计算TCID₅₀的值。

(3)MDT的测定

将三代病毒用PBS缓冲液作连续倍比稀释，取稀释度为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹的病毒分别接种9～11日龄SPF鸡胚5只，每枚鸡胚接种量为0.1mL，置于37℃恒温培养箱中培养，每天早晚观察2次，连续7天，记录鸡胚死亡的时间，计算MDT的结果。

表12重组病毒生物学特性鉴定

结果如表12所示，经过EID₅₀、TCID₅₀和HA的检测结果可以看出rLS-Fiber 1的病毒滴度明显高于rLS-Fiber 2。其中EID₅₀的测定结果表明rLS-Fiber 1比rLS-Fiber 2高出一个数量级，达到10倍之多。rLS-Fiber 1的增殖情况优于亲本毒株和rLS-Fiber 2，病毒滴度的增高更能降低疫苗的成本。从疫苗成本的角度可以看出rLS-Fiber 1更适合开发为疫苗。而同时MDT的检测结果可以看，rLS-Fiber 1保持了亲代病毒的弱毒特征，甚至毒力稍弱于亲代病毒Lasota。

(4)重组病毒LS-Fiber 1的蛋白表达的检测

试验前一天，将DF-1细胞接种于12孔细胞培养板内，2mL/孔，用含有10％胎牛血清、1％抗生素的DMEM培养基培养，于37℃培养箱过夜培养。待细胞状态良好时接种病毒。37℃培养24h，细胞病变后，弃去培养液，用温热的PBS洗涤两次。然后用10％福尔马林溶液500μL室温固定15min，弃液，用PBS洗涤两次。加入100％无水乙醇500μL，置于-20℃，5min以穿透细胞，用PBS洗涤三次。加入5％羊血清封闭，加入以稀释度为1：100的抗FAdV高免血清和鼠抗NDV HN单抗(购自圣克鲁斯生物技术公司，货号sc-53562)为一抗，37℃放置30min。以PBS洗涤三次，每次静置5min。再加入稀释度为1：200的FITC标记的羊抗鸡血清和AlexaFluor标记的羊抗鼠血清(北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-0296G-AF555)为二抗，37℃放置30min，以PBS洗涤三次，每次静置5min。加入Fluoromount-G荧光保护剂，然后在倒置荧光显微镜下观察。

结果如图4所示，将重组病毒LS-Fiber 1感染DF-1细胞后，24h后通过免疫荧光的方法可以看出，DF-1细胞和抗FAdV的抗体出现明显的结合反应而被染上绿色的荧光。同时结合NDV染色的红色荧光可以看出，红色荧光和绿色荧光表达的细胞高度重合，说明该蛋白的表达是由NDV病毒作为载体感染细胞产生的。

在针对FAdV-4的基因工程研发中，Fiber-1、Fiber-2和Hexon以及penton都是研究的靶标。尽管亚单位疫苗的研发中，有研究表明Fiber 2蛋白的免疫效果最好。然而已有研究表明FAdV-4的Fiber 2蛋白是决定FAdV-4不同毒株毒力的一个决定性蛋白。本发明中的研究也发现表达Fiber 2蛋白的NDV病毒的病毒增殖能力显著低于亲本毒株，毒力高于亲本毒株，并且其免疫保护效果也低于本发明所构建的表达表达禽腺病毒4型Fiber-1蛋白的重组新城疫病毒。疫苗的免疫保护效果是决定疫苗是是否具有市场应用价值的决定因素，而病毒滴度的高低是决定一个疫苗成本的重要指标，因此本发明中选用表达禽腺病毒4型Fiber-1基因构建重组新城疫病毒。

预防FAdV-4和NDV的疫苗的实施例1

本实施例中将前述的从鸡胚尿囊腔中获得的尿囊液中表达的Fiber-1的NDV病毒作为疫苗，在检测鸡胚尿囊液的EID₅₀的基础上，将尿囊液用PBS稀释至1×10⁷对雏鸡进行免疫。免疫过程及效果如下所示：

1、免疫方案

表达禽腺病毒Fiber 1、Fiber 2的新城疫病毒的活载体疫苗、NDV的LaSota弱毒株(LaSota组)、PBS缓冲溶液，分别按照表13进行免疫，将80只雏鸡随机的分为6组(如表13所示)，其中实验组Fiber 1、Fiber 2每组10只鸡，共四组；对照组LaSota和PBS组每组20只鸡；本实验采用滴鼻免疫的方法对鸡只进行免疫接种，将1×10⁷的重组疫苗通过滴鼻免疫的方式接种至鸡只，每只鸡100μL，滴入时稍作等待防止雏鸡甩头而降低疫苗免疫剂量。于14天后，对2、4、5、6组各十只鸡进行第二次免疫，免疫步骤同上。

2、攻毒程序

在第一次免疫后的第14天，将1、3实验组的各10只鸡和5、6对照组各随机挑出的10只鸡共40只鸡准备进行第一次攻毒。保定鸡只，使其翅下静脉暴露出来，医用酒精消毒，针尖保持斜面朝上，针头对准心脏方向，扎进血管，缓慢推进注射滴度为1×10⁶EID₅₀的FAdV-4，攻毒过程中一定要注意消毒和隔离，防止交叉感染。将2、4实验组的各10只鸡和5、6对照组剩余的各10只鸡共40只鸡进行第二次攻毒，攻读过程同上。

表13免疫疫苗的配置

3、抗体水平检测

(1)FAdV抗体水平检测方法

于一次免疫后的第14天，对6组鸡各随机选择5只鸡静脉抽血1mL，制备血清备用，送往中科基因生物技术有限公司通过ELISA法检测鸡只的FAdV的抗体水平。

结果如图5所示，免疫后鸡只体内的FAdV抗体水平需要通过ELISA(酶联免疫吸附试验)来进行检测。通过ELISA检测结果可以得出：Fiber 1试验组和Fiber 2组的鸡只产生了抗FAdV-4的抗体，其中Fiber 1组的抗体水平明显高于Fiber 2组，而Lasota组和PBS组的鸡只则没有抗FAdV抗体产生。证明构建的表达禽腺病毒Fiber 1的新城疫病毒能够引起鸡只体内抗FAdV-4的免疫保护反应，具有防治FAdV-4的潜力。

(2)NDV抗体水平测定

各组中随机的抽取5只免疫后鸡只的翅下静脉血1mL，制备血清进行HI实验，HI实验的结果就是各组的疫苗在鸡只体内诱发的抗NDV的特异性免疫反应的程度。

通过鸡只体内的新城疫抗体水平结果来探讨稳定表达了Fiber 1的新城疫病毒在鸡只体内所引起的针对新城疫病毒的特异性免疫保护反应的程度。结果如图6所示，结果显示，第一次免疫后，鸡只体内的抗体效价大约在2⁴～2⁵，二次免疫后，抗体效价大约为2⁵～2⁶。Fiber 1试验组鸡只体内的NDV抗体水平与Fiber 2组和LaSota对照组相比，鸡只体内抗体水平相差不大，PBS组的鸡只体内新城疫抗体效价几乎为0。证明Fiber 1重组蛋白不影响LaSota弱毒株诱发鸡只体内的免疫保护反应，并且可以产生与单纯的NDV-LaSota弱毒株相似程度的免疫保护效果。

4、临床症状观察

于一次免疫后的第14天攻了第一次FAdV-4，于二次免疫后的第14天进行第二次FAdV-4攻毒，分别对两次攻毒后每组鸡只每天进行临床症状的观察和记录。为了更客观的呈现攻毒后的临床症状，根据FAdV感染的临床症状制作了临床评分表。其中包括(1)精神状态依据其严重程度分为正常0分(—)，轻微1分(+)，中等2分(++)，严重3分(+++)；(2)粪便情况，饮水吃料情况以群体作为指标，分为正常0分(—)，轻微3分(+)，中等6分(++)，严重9分(+++)；(3)死亡情况，如果鸡只发生死亡，则计9分。

试验结束后，将各组每天所有的得分相加，以便于系统的观察整个病变过程的临床症状变化。临床变化能够最直观的反映病鸡的每天的生理状况变化情况，通过症状打分表的结果，清晰的反映了每组鸡的总体病变的程度。观察经一次免疫的鸡只进行攻毒后所得的临床症状打分表，结果如图7和图8所示，病变程度最轻的为Fiber 1组，LaSota和PBS组病变最为严重；攻毒后的第2天各组鸡只基本上都没有表现出临床症状，临床症状主要出现在第3～6天，然后病情逐渐恢复，鸡只临床表现恢复正常。

5、病理解剖和组织切片检测

(1)病理解剖

对攻毒后的各组鸡只进行临床解剖检查，仔细观察并记录其器官的病理变化情况。HPS的典型病变部位主要在心脏、肝脏、脾脏和肾脏，因此本研究在剖检过程中，主要锁定观察上述四个器官的临床病变情况，并拍照统计。分别在各个免疫组，于攻毒后挑选各组具有典型代表的临床症状的鸡只，对肝脏，心脏，脾脏，肾脏等主要的病变器官各取一厘米见方的组织样本，置于高压灭菌过的离心管中，冰上保存，送去公司做组织切片，检测各组鸡只在微观水平上的病变情况。

于攻毒后的第4天或第5天随机选取不同组的鸡只进行解剖观察，统计其病理变化情况。结果如图9所示，攻毒后各组鸡只体内的器官都表现出了不同水平的HPS病变，由上图可以看出Fiber 1的鸡只器官与正常鸡只的器官相同，基本上没有发生病变，而LaSota和PBS组出现了典型的HPS的病理变化例如出现心包出现淡黄色的积液；肝脏肿胀、变色且表面存在大范围的点状出血；脾脏变大呈暗红色；肾小管大幅度扩张等。说明Fiber 1具有诱发鸡只体内抗FAdV-4的特异性免疫反应的能力。

(2)NDV抗体水平测定

通过组织切片从微观水平上观察4组病鸡的病理变化差异。结果如图10所示，Fiber 1和正常鸡只的心肌组织显示较为正常，心肌纤维表现为正常的梭型，细胞排列紧密有序，细胞核较为清晰圆润，而LaSota和PBS组心肌纤维肿胀变型，细胞核皱缩，纤维之间出现较多的空隙；Fiber 1与正常的鸡只的肝脏组织结构图较为相近，细胞核较为清晰，而LaSota和PBS组中肝索结构变形，肝组织的结构变得模糊，其中出现大量的空泡样的结构-脂肪变性；Fiber 1和正常鸡只的脾脏组织图显示比较正常，脾脏细胞数量众多结构致密，细胞核清晰，而LaSota和PBS组中细胞核皱缩，结构疏松组织空隙多，细胞间出现许多的红细胞；肾脏组织LaSota和PBS组中肾小管出现严重肿胀，细胞核皱缩。

6、死亡率统计

统计结果如图11和图12所示，在第一次免疫攻毒试验中，Fiber 1组的死亡率为40％，Fiber 2组的死亡率为50％，LaSota组和PBS组的死亡率分别在90％、90％；在第二次免疫攻毒试验中，Fiber 1组的死亡率降至10％，Fiber 2组的死亡率为20％，LaSota组和PBS组的死亡率分别在80％、90％。通过上述结果可以看出，表达了禽腺病毒Fiber 1、Fiber2的新城疫病毒针对FAdV-4有较好的免疫保护效果，但是需要两次免疫才可以起到良好的保护效果。

<110> 河南科技大学

<120> 一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体及其制备方法及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1296

<212> DNA

<213> FAdV-4病毒

<221> Fiber 1基因

<400> 1

atgtcggccc taatcgcctc cgcagccgat accgtctccg ccagcggaaa aaaacgaccc 60

cgcagggccc tatccgaacc tagccggtac ctttcggagg gcgacgagcg tcgaaaaccc 120

aaacgcgcgc gaccggccac ccgcgcgaat ggtcccctcc tcgatctggt gtatccattt 180

gacttcaatg cggggggagg aggtggcagc ggtggcggcg gtgggggagg tggaggtcag 240

cagatcgcgg tcgaccccga tgggccgctc gaactcactg gtgacctact gaccctcaac 300

accaaaacgc ccatttacgt cagcgatcga gcggtcagtc tgctcatcga tgacaatact 360

ttggccacta agcaagccaa cggggcgctc atggtcaaaa ccgcggcccc tctgaactcg 420

ggcactggtg gaggcgtcac gctaggcttc gaccctcgca ccatggcgct agattccgtc 480

accggggtgc tcaaagtgct cgtcgactca cagggacctc tacaagccga cacgggaggc 540

atcactctcc agttcgacac tcaagacttc gttgtcaaca atggcgtctt agcgctagcc 600

tcctcggtcg gtccgaccta tctgagcccc tttgcgacct acgaagtcac gcccgtcttg 660

ggaatatcgc agaggaacgg caacgtaaaa agcaagggct tgcaaaactg gtccataggc 720

tattacatct acatggtgag ctcagccggg ctagtcaacg gactcatcac tctggagcta 780

gcccatgacc tcacaggcgc gagcggagaa aacagcctga ctagcggtct caactttacc 840

tttgtgctca gccccatgta cccgatagaa acagaggtga atttgtccct catcgtgccg 900

cccacggtct cgccgaccaa tcaaaaccac gtgtttgtgc ccaatagcaa ccagagcgac 960

gtgggctatc tcgggctgcc gcctcatacc agggacaatt ggtacgtgcc catcgactcg 1020

cccggcctgc ggctcgtctc tttcatgccc accgccaccg gaaacgagaa attcggacag 1080

ggcacgttgg gatactgcgc cgccaccatc cagaacacgt ccagcggaac cacgccgtcg 1140

gatgcgatag ccttcactgt ctcgctgccg cagacctccg gctccaactg gtttgaccag 1200

aacgcgcccg acactgtggt gacgaccggt cctatccctt tttcctatca gggttacgtc 1260

tactccccca acgggaacaa tgctccgggc ccctaa 1296

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> LaSota的P和M基因之间人工序列

<400> 2

ttcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt aattaatcta gctacattaa ggattaagaa 60

aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat tgtgagttta gttgatagtt gtagccaccg 120

tgtgtaacta ccgtgtacta agccccactc acccagatca tcatgacaca aaaaactaat 180

cgttacctct ctcgcttc 198

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> ade-Fiber 1 F

<400> 3

cgtcgaaccg taacatagcc tg 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> ade-Fiber 1 R

<400> 4

gaaaggataa accaggtcaa gctg 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> ade-Fiber 2 F

<400> 5

ggtcctatcc ctttttccta tcag 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> ade-Fiber 2 R

<400> 6

cgttcatgac tctttatttg acacg 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Fiber 1 for LS F

<400> 7

atagttgtag ccaccatgtc ggccctaatc gcctcc 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Fiber 1 for LS R

<400> 8

acggtagtta cacacttagg ggcccggagc attg 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Fiber 2 for LS F

<400> 9

atagttgtag ccaccatgct ccgggcccct aaaag 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Fiber 2 for LS R

<400> 10

acggtagtta cacacttacg ggagggaggc cgc 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> LS vector P/M F

<400> 11

ggtggctaca actatcaact aaact 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> LS vector P/M R

<400> 12

gtgtgtaact accgtgtact aagc 24

Claims

1.一种预防FAdV-4和NDV的疫苗载体，其特征在于，该疫苗载体为NDV LaSota疫苗株，所述NDV LaSota疫苗株的P基因和M基因之间设置有如SEQ ID NO.2所示的人工序列，所述人工序列的119至120位之间插入有FAdV-4的Fiber 1基因；所述Fiber 1基因的序列如SEQID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的制备方法，其特征在于，包括：将FAdV-4的Fiber 1基因插入至NDV LaSota疫苗株的P基因和M基因之间，即得。

3.根据权利要求2所述的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的制备方法，其特征在于，在制备疫苗载体时，使用如下引物以FAdV-4病毒DNA为模板扩增Fiber 1基因：

Fiber 1 for LS F：5’-ATAGTTGTAGCCACCATGTCGGCCCTAATCGCCTCC-3’，

Fiber 1 for LS R：5’-ACGGTAGTTACACACTTAGGGGCCCGGAGCATTG-3’；

LS vector P/M F：5’-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-3’，

LS vector P/M R：5’-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-3’；

使用In-Fusion酶将扩增的Fiber 1基因和NDV LaSota疫苗株骨架片段连接，即得。

4.如权利要求1所述的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体的应用，其特征在于，所述疫苗载体在制备预防由FAdV-4和/或NDV所致疾病的疫苗中的应用。

5.一种预防FAdV-4和NDV的疫苗，其特征在于，将权利要求1所述的预防FAdV-4和NDV的疫苗载体经拯救收获重组病毒后接种至鸡胚尿囊腔中进行扩增，收集鸡胚尿囊液，即得。

6.根据权利要求5所述的预防FAdV-4和NDV的疫苗，其特征在于，还包括生物制剂中可接受的固相载体或液相载体。