CN110499296A - 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 - Google Patents

一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法。所述候选株是表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的热稳定新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)rAHR09‑8bF，保藏编号为CCTCC NO:V201933。该候选株是以耐热的新城疫病毒弱毒株rAHR09为载体，在其P和M基因的间隔区插入血清8b型禽腺病毒(FAdV‑8b)纤突蛋白(fiber)基因而获得。该重组病毒具有良好的热稳定性和免疫原性，对FAdV‑8b感染可提供良好的免疫保护，可作为血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选毒株。

Description

一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建 方法
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，涉及以耐热新城疫病毒(Newcastle DiseaseVirus， NDV)为载体，利用反向遗传学技术构建表达血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)纤突蛋白的重组病毒(rAHR09-8bF)。该重组病毒可作为预防血清8b型禽腺病毒感染的疫苗候选毒株，用于预防该类病毒引起的禽类疾病。
背景技术
禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)的血清型众多。根据国际病毒分类委员会第十次分类报告，腺病毒科(Adenoviridae)共5个属，其中与家禽疫病相关的有禽腺病毒属(Aviadenovirus)、腺胸腺病毒属(Atadenovirus)和唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)，通常用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群分别指代这3个属中的禽腺病毒。Ⅰ亚群禽腺病毒依据其限制性内切酶片段图谱可分为A～E 5个基因型，根据血清交叉中和试验又可以进一步区分为12个血清型(FAdV-1～FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9～FAdV-11)，临床上主要引起鸡的包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包积水综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜烂症(adenoviral gizzard erosion,AGH)，其它禽类也能发生自然感染；Ⅱ亚群包括火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagic enteritis virus,HEV)、雉大理石脾病病毒(Marble spleen disease virus,MSDV)和鸡大脾病病毒(Avian adenovirus groupⅡsplenomegaly,AASV)；Ⅲ亚群主要是从产蛋下降综合征病鸡分离的病毒(Egg droppingsyndrome virus,EDSV)。
近年来，对我国鸡群危害较为严重的主要是Ⅰ亚群和Ⅲ亚群的病毒。Ⅰ亚群主要流行的血清型包括血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)，分别引起HPS和包涵体肝炎IBH，给养禽业造成严重的经济损失。研究也有发现存在其它血清型如血清8a型(FAdV-8a)和血清11型(FAdV-11)的流行。Ⅲ亚群的病毒只包括EDSV，引起产蛋鸡的产蛋下降综合征(EDS)。
疫苗接种是预防控制该类疾病的主要手段。较早研发和投入使用的禽腺病毒疫苗是灭活苗。1990年，在巴基斯坦首次暴发HPS后，开始用感染禽类的肝匀浆灭活疫苗预防此病。减毒活疫苗也被研制用于防控该病毒，Mansoor等研发了一种预防HPS的弱毒活疫苗。近年来，国内外有研究报道，灭活疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等可用于该病的免疫预防。在亚洲、非洲、拉丁美洲、大洋洲等50多个国家和地区已有商品化的灭活疫苗，其中大部分是血清4型病毒单价灭活苗、血清4型+8b型多价灭活苗以及与其它禽源病毒抗原制成的多联灭活苗，只有一种在澳大利亚用于产蛋前种鸡免疫的未致弱8a型毒株(Esurient)活疫苗。近年来开始出现利用基因工程重组蛋白制备亚单位疫苗的报道，但基因工程活载体疫苗的研究还较少。
随着反向遗传学技术的发展，以NDV作为疫苗活载体的研究发展迅速。NDV能够快速引起机体产生全面的免疫反应，并能在体内长期增殖和稳定高效地表达外源基因，持久地为机体提供免疫保护；NDV载体的安全性高，可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉；NDV弱毒疫苗免疫在我国养禽业几乎是所有新生雏鸡必不可少的免疫程序，所以NDV弱毒作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。
一般而言，NDV对热的耐受性不高，50～55℃、30min即可使其失去活性(失去感染宿主的能力)。早期的研究结果显示，在NDV不同毒力类型的毒株中，存在着对温度耐受性较高的毒株，主要表现为经56℃、30min处理后依然具有感染宿主的能力，或虽然丧失感染性，但仍具有血凝活性。由于大多数的活疫苗都对热敏感，为保证疫苗的质量，在运输和贮藏过程中需要冷链维持。耐热NDV疫苗株耐热性能良好，能在50～55℃耐热70min，作为疫苗候选株，以耐热NDV为载体的基因工程苗具有更加广泛的应用前景。曹永忠等(曹永忠等.一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株.专利申请号：CN201811244135.7，公开号：CN109321535A)首次公开了一株热稳定的新城疫病毒新型(基因Ⅷ型)弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09及其构建方法，所述的热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株的保藏号为CCTCCNO:V201739，NDV/rAHR09株具有良好的热稳定性，56℃、60min仍保持血凝活性和感染能力，免疫试验证明对新城疫强毒株有良好的免疫保护效果。在此基础上，曹永忠等(曹永忠等.一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体.专利申请号：CN201811244137.6，公开号：CN109295095A)进一步以NDV/rAHR09株为基础构建了一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体，该发明以耐热的NDV/rAHR09株为基础，利用反向遗传操作系统对病毒F基因突变，并在P基因和M基因之间构建合适的插入位点，建立了一个表达外源基因的载体系统，经插入GFP基因，获得了耐热的稳定表达GFP的重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1，它的保藏号为CCTCC NO:V201844，NDV/rAHR09-GFP-1在自然条件下具有良好的热稳定性，56℃、90min仍保持血凝活性和感染能力，能稳定表达GFP 基因。
发明内容
在我国鸡群中流行的Ⅰ群禽腺病毒血清8b(FAdV-8b)型可引起鸡心包积液综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)和鸡包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)等疾病，给养禽业造成严重的经济损失。纤突蛋白(fiber)是禽腺病毒的重要结构蛋白，含有病毒的中和抗原表位，也与病毒的感染性有关。本发明以耐热NDV弱毒株作为疫苗活载体，利用反向遗传学技术，将FAdV-8b型的纤突蛋白基因插入NDV载体，构建针对当前国内主要流行的FAdV-8b型的基因工程活疫苗，并对重组病毒的生物学特性及免疫保护效力进行评价。本发明毒株填补了热稳定的FAdV-8b型基因工程活疫苗的空白。
本发明所述一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株，是表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的热稳定新城疫病毒rAHR09-8bF，保藏编号为CCTCC NO:V201933。
本发明还公开了所述耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株的构建方法，是在耐热新城疫病毒NDV/rAHR09的P与M基因间隔区插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。
本发明进一步公开了所述耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株在制备预防禽腺病毒感染药物中的应用。
具体地，表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的热稳定新城疫病毒rAHR09-8bF的构建步骤如下：
1)质粒p-VHR09的酶切：以Pme Ⅰ酶切含耐热新城疫病毒NDV/rAHR09致弱株全基因组的质粒p-VHR09，回收线性化的目的片段。
2)整合FAdV-8b fiber基因的感染性克隆构建：取FAdV-8b型禽腺病毒，通过PCR方法分别扩增得到其fiber基因，回收PCR产物，连接至线性化的p-VHR09，转化感受态细胞，筛选阳性克隆，经过测序验证得到阳性重组质粒p-VHR09-FAdV-8b fiber。
3)重组病毒拯救：将p-VHR09-FAdV-8b fiber与pCI-NP、pCI-P、pCI-L三个真核表达质粒共转染至单层BSR-T7/5细胞，转染后60h，将细胞冻融三次后接种9～11日龄SPF鸡胚，96h 后，将经HA鉴定效价＞24的尿囊液连续传代2代。
4)重组病毒的RT-PCR鉴定：将HA阳性尿囊液提取病毒RNA，通过RT-PCR方法鉴定NDV/rAHR09中插入的目的片段，将鉴定结果为阳性的重组病毒命名为rAHR09-8bF。
本发明对得到的rAHR09-8bF进行评价，结果如下：
1)重组病毒的Western-blot鉴定：将rAHR09-8bF、NDV/rAHR09尿囊液接种CEF细胞，收取细胞并裂解制成蛋白样品，进行Western-blot试验，测定重组病毒的纤突蛋白表达水平。
2)重组病毒的耐热性测定：取rAHR09-8bF的3代尿囊液7份，放于56℃金属浴中热处理20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min，进行HA试验。
3)重组病毒的EID50测定：将rAHR09-8bF病毒尿囊液做10倍倍比稀释，取10-6-10-9稀释度接种9～11日龄SPF鸡胚，120h后测定重组病毒HA效价，计算EID50；
4)重组病毒的MDT测定：将rAHR09-8bF病毒尿囊液做10倍倍比稀释，取10-6-10-9稀释度接种9～11日龄SPF鸡胚，观察120h；
5)重组病毒的ICPI测定：将rAHR09-8bF病毒尿囊液做10倍稀释，经脑内接种1日龄SPF雏鸡，计算ICPI；
6)重组病毒rAHR09-8bF免疫效力试验：SPF鸡7日龄时进行免疫，设重组病毒组、灭活疫苗组和攻毒对照组。免疫后分别于7、14、21、28d采血分离血清，通过血清中和试验测定中和抗体效价。免疫21d进行攻毒。分别于攻毒后3d、7d采集各组试验鸡咽喉拭子、泄殖腔拭子，通过荧光定量PCR检测拭子含毒量。
本发明以耐热的新城疫病毒弱毒株rAHR09为载体，在其P和M基因的间隔区插入血清 8b型禽腺病毒(FAdV-8b)纤突蛋白(fiber)基因，构建了重组病毒rAHR09-8bF株。该重组病毒具有良好的热稳定性和免疫原性，对FAdV-8b感染可提供良好的免疫保护，可作为血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选毒株。
附图说明
图1：质粒p-VHR09图谱。
图2：质粒p-VHR09的酶切电泳图(M：DL15000DNA Ladder；泳道1：经Pme Ⅰ酶切的p-VHR09)。
图3：重组质粒p-VHR09-FAdV-8b fiber构建方案示意图。
图4：FAdV-8b fiber基因扩增电泳图(M：200bp DNA Ladder；泳道1：FAdV-8bfiber基因 PCR扩增产物)。
图5：重组质粒PCR鉴定电泳图(M：200bp DNA Ladder；泳道1：p-VHR09-FAdV-8bfiber 鉴定PCR产物)。
图6：重组质粒p-VHR09-FAdV-8b fiber图谱。
图7：重组病毒rAHR09-8bF鉴定电泳图(M：200bp DNA Ladder；泳道1：rAHR09-8bF鉴定PCR产物)。
图8：重组病毒rAHR09-8bF的Western-blot鉴定图(泳道1：rAHR09-8bF感染的CEF制备的蛋白样品；泳道2：FAdV-8b感染LMH制备的蛋白样品；泳道3：NDV/rAHR09感染CEF 制备的蛋白样品)。
图9：rAHR09-8bF免疫效力评价试验鸡FAdV-8b中和抗体水平检测结果图。
图10：rAHR09-8bF免疫效力评价试验FAdV-8b攻毒后咽喉拭子排毒监测结果图。
图11：rAHR09-8bF免疫效力评价试验FAdV-8b攻毒后泄殖腔拭子排毒监测结果。
本发明重组病毒rAHR09-8bF于2019年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉大学；保藏编号为CCTCC NO:V201933；分类命名：表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的热稳定新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)rAHR09-8bF。
具体实施方式
本发明中所涉及的生物材料如下：
NDV/rAHR09:曹永忠等.一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体.专利申请号：CN201811244137.6，公开号：CN109295095A。
质粒p-rVHR09：曹永忠等.一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体.专利申请号：CN201811244137.6，公开号：CN109295095A。
pCI-NP、pCI-P、pCI-L：刘倩，新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建，硕士论文，扬州大学,2017。
FAdV-8b QD2016株：胡亚歌.血清4型和8b型禽Ⅰ群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制，硕士论文，扬州大学,2018。
BSR-T7/5细胞:刘倩，新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建，硕士论文，2017。
实施例1：血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗毒株构建
1.质粒p-VHR09的酶切
含有NDV/rAHR09致弱突变株全长基因组(GenBank：MF285077.1)的转录载体p-VHR09 由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存(曹永忠等.一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体.专利申请号：CN201811244137.6，公开号：CN109295095A)，质粒图谱见图1。用Pme Ⅰ限制性内切酶在P和M基因间隔区进行酶切线性化，酶切产物经 1％琼脂糖凝胶电泳后，回收线性化的18000bp左右的目的片段，结果如图2所示。
2.整合FAdV-8b fiber基因的感染性克隆构建
整合FAdV-8b fiber基因的感染性克隆构建原理如图3所示，具体操作步骤如下：
参照FAdV-8b QD2016株fiber(SEQ ID NO.1)基因开放阅读框序列，设计1对引物，同时在引物基础上添加新城疫病毒特有的基因起始序列和基因终止序列，再根据非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司，产品编号：C112)说明书要求，通过在引物5’端引入同源序列(15bp-20bp)，最终设计好的引物序列如下：
pW FAdV-8b-F-F：
ATGATTGCACAACCACGTTTTTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGCGACCTCGACGCCT
(SEQ ID NO.2)
pW FAdV-8b-F-R：ATTTTTGAAGCTGCTAGTTTGGTTACGGAGCGTTGGCTGTGC
(SEQ ID NO.3)
提取FAdV-8b QD2016株的病毒DNA作为模板，使用上述引物经PCR反应扩增目的片段。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，结果分别见图4和图5。分别回收大小约1500bp与1600bp的目的条带。按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司，产品编号：C112)说明书方法将回收产物克隆入线性化的p-VHR09。将连接产物转化DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃温箱培养过夜；第二天挑选单个菌落接种含氨苄青霉素的LB液体培养基。使用ND-3-F(SEQ ID NO.4)+ND-3-R(SEQ IDNO.5)引物对，通过PCR进行鉴定。结果如图6所示，目的条带大小分别约为3300bp。经鉴定为阳性的克隆进一步经测序确认，测序正确的阳性重组质粒命名为p-VHR09-FAdV-8b fiber，重组质粒图谱如图6所示。
ND-3-F：AGGGCAGAGCCAARACARTAC(SEQ ID NO.4)
ND-3-R：CGCRGTTTGRCTCCAGAGTAT(SEQ ID NO.5)
3.重组病毒的拯救
BSR-T7/5细胞和辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L均由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。
细胞和转染用质粒的准备：转染用的BSR-T7/5细胞用1mg/mL的G418进行预筛选培养，于转染前一天将5×105的细胞接种于35mm培养皿中，约60％～80％汇合度时用于转染。转染时用到的所有质粒均用EndoFree Plasmid Midi Kit按说明书方法进行提取。
共转染：将含NDV基因组全长cDNA的转录载体p-VHR09-FAdV-8b fiber与三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染BSR-T7/5细胞，转染60h后将转染样品-70℃反复冻融3次，然后接种9～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.4mL/胚，37℃继续孵化，定时观察鸡胚状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，收集鸡胚尿囊液，经测定血凝试验为阳性的尿囊液继续在鸡胚传代2次，收获尿囊液保存备用。
4.RT-PCR鉴定重组病毒
从收获的尿囊液中提取病毒基因组RNA，用JDCZ-F(SEQ ID NO.6)+JDCZ-R(SEQ IDNO.7)引物对，通过RT-PCR鉴定重组病毒P和M基因间隔区是否已经成功插入目的基因， PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察片段大小，结果如图8所示，目的条带分别约为1800bp 和1900bp大小，回收目的片段，并连接pEASY-T3载体，转化Tans1-T1，次日挑取单个菌落培养，经PCR鉴定为阳性的克隆进一步进行测序验证。将成功拯救的病毒命名为rAHR09-8bF。
JDCZ-F：CCGGGTCGATTGACGATCAGAAA(SEQ ID NO.6)
JDCZ-R：GCACAGTCGGGGCACTTCGATTCTA(SEQ ID NO.7)
5.Western-blot鉴定重组病毒
将NDV/rAHR09和重组病毒rAHR09-8bF分别接种CEF细胞，细胞培养液中添加2μg/mL 的TPCK-胰酶(Merck公司，产品编号：4370285-1KT)，待细胞开始出现细胞病变后加入裂解液制备蛋白样品，以Western-blot鉴定重组病毒纤突蛋白的表达情况。使用抗FAdV-8b鸡血清(由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室用FAdV-8b QD2016株fiber蛋白免疫 SPF鸡制备)经稀释后作为一抗，4℃过夜孵育。用辣根过氧化物酶标记的抗鸡的二抗于37℃孵育1h，用增强型化学发光法(ECL)显色，观察蛋白条带。同时设置FAdV-8b感染的LMH细胞制备的蛋白样品作为阳性对照。结果如图9所示，拯救的重组病毒可表达目的蛋白。
实施例2：重组病毒rAHR09-8bF生物学特性鉴定
1.重组病毒的耐热性测定
取rAHR09-8bF的3代含重组病毒的尿囊液，每代取7份(500μL/份)放于56℃金属浴中进行热处理，热处理时间分别设定为20min、30min、40min、50min、60min、70min、 80min。并以NDV/rAHR09(曹永忠等.一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株.专利申请号：CN201811244135.7，公开号：CN109321535A)耐热性结果作为参照。处理结束后进行 HA试验，结果如表1所示，重组病毒rAHR09-8bF在56℃处理70min后仍具备血凝活性。
表1 rAHR09-8bF株耐热性测定结果
2.重组病毒的EID50测定
将rAHR09-8bF尿囊液作连续10倍比稀释，取106～109倍稀释的病毒，经尿囊腔接种9～11 日龄鸡胚，每个稀释度尿囊液接种5枚，接种剂量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，连续观察至 120h，其间死亡鸡胚及时取出冷藏，第5d时取出所有鸡胚，放4℃冰箱冷却过夜，次日收获鸡胚尿囊液进行血凝试验。结果如表2所示，rAHR09-8bF EID50为107EID50/mL，说明重组病毒复制性能良好，能在鸡胚上稳定增殖。
表2 rAHR09-8bF部分生物学特性
3.重组病毒的MDT测定
将rAHR09-8bF尿囊液作连续10倍稀释，取10-6～10-9稀释度的病毒经尿囊腔接种9～10 日龄的SPF鸡胚，每个稀释度尿囊液接种5枚，0.1mL/枚胚，37℃培养7d。每隔12h观察一次，连续观察7d，记录鸡胚的死亡时间。计算MDT的值，并与亲本病毒比较。结果如表2所示，两株重组病毒MDT值均大于120h。
4.重组病毒的ICPI测定
取HA价大于24的新鲜rAHR09-8bF尿囊液，使用不含抗生素的灭菌PBS做10倍梯度稀释后，对10只1日龄SPF雏鸡进行脑内接种，50μL/只，同时用不含抗生素的灭菌PBS 进行脑内接种作为阴性对照组。每天观察鸡群发病和死亡情况，连续观察8d。计算ICPI的值，并与亲本病毒比较。结果如表2所示，rAHR09-8bF的ICPI值为0.050。
根据刘倩(刘倩.新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建.扬州大学硕士学位论文，2017.)的研究结果，致弱的亲本病毒NDV/rAHR09的MDT值＞120h， ICPI值为0.057。综合重组病毒MDT与ICPI值的测定结果，rAHR09-8bF符合弱毒株毒力标准，与亲本毒株毒力无显著差异。
实施例3：重组病毒rAHR09-8bF免疫效力试验
1.试验分组与免疫接种
SPF鸡试验分组见表3。在SPF鸡7日龄时进行免疫。活疫苗组试验鸡通过滴鼻点眼接种rAHR09-8bF(106EID50)，灭活苗组经颈部皮下接种FAdV-4+FAdV-8b二价灭活疫苗(0.25mL/只)，攻毒对照组通过滴鼻点眼接种PBS(0.1mL/只)。FAdV-4+FAdV-8b二价灭活苗参照胡亚歌的方法制备(胡亚歌.血清4型和8b型禽I群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制.扬州大学硕士学位论文，2018.)。
表3 试验2免疫试验分组
2.免疫后抗体水平监测
在SPF鸡免疫第7、14、21、28d，对各组试验鸡采血分离血清，通过中和试验测定各组试验鸡体内的抗体水平。使用的病毒为FAdV-8b QD2016株，具体方法如下：
将各组试验鸡的待检血清样品56℃灭活30min，用生长液倍比稀释(1:4，1:8， 1:16……1:1024)，然后将FAdV-8b QD2016株病毒液(200TCID50/50μL)与等体积稀释好的血清混合，置37℃培养箱作用1h，每个血清稀释度作4个重复，并设立阴、阳性对照，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，观察5～7d，当阳性对照孔完全出现细胞病变时，统计结果并按照公式算出血清中抗体的效价，判定最终结果。
距离比例＝(高于50％保护率的百分数-50％)/(高于50％保护率的百分数-低于50％保护率的百分数)
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％保护率的稀释度的对数
血清中和试验结果如图9所示，rAHR09-8bF组和灭活苗免疫组试验鸡免疫7d后均可检测到血清中和抗体，在免疫后第21d，均到达峰值，rAHR09-8bF组和灭活苗组产生针对FAdV-8b中和抗体水平分别为103.11和103.15。
3.攻毒试验
SPF鸡免疫21d后，对各组试验鸡用FAdV-8b QD2016株(106.5TCID50/mL)经肌肉注射途径进行攻毒，攻毒剂量为0.2mL/只。每日观察各组试验的发病情况，结果发现攻毒对照组在攻毒后出现采食量下降、拉稀现象。rAHR09-8bF组与灭活苗组在攻毒后一过性精神沉郁，很快恢复正常。攻毒后7天进行剖检，结果发现，攻毒对照组试验鸡肝脏呈浅黄至深黄色，并伴有坏死灶，rAHR09-8bF组和灭活苗组试验鸡无明显病变。攻毒后第3d、7d，采集各组试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子，应用SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法(Günes A, MarekA,Grafl B,et al.Real-time PCR assay for universal detection and quantitationof all five species of fowl adenoviruses(FAdV-A to FAdV-E).Journal ofVirological Methods,2012,183(2): 147-153.)测定病毒含量。咽拭子和泄殖腔拭子排毒监测结果如图10、图11所示。攻毒对照组攻毒后虽然不会引起死亡，但会出现比较严重的排毒现象。rAHR09-8bF免疫组与灭活苗组的呼吸道与消化道排毒量均较低，与攻毒对照组相比差异极显著(P≤0.01)。rAHR09-8bF组在攻毒后第3d呼吸道和消化道排毒量略高于灭活苗组，但差异不显著。说明重组病毒 rAHR09-8bF免疫能有效地降低试验鸡感染后FAdV-8b的排毒量。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> 新城疫病毒（Newcastle Disease Virus）
<400> 1
atggcgacct cgacgcctca cgccttctcc tttggccaaa tcggctcccg aaaacgccct 60
gcgggtggcg atggcgagcg agacgcctcc aaagtgccga aaatgcagac ccccgctccg 120
agcgcgaccg ccaacggaaa tgacgagctg gacctggtct accccttttg gctccaaaac 180
ggctctaccg gaggaggcgg cggcggttcc ggtggaaacc cgtccctcaa cccgccgttt 240
ttggacccca acggacccct ggccgtccaa aacagcctcc tgaaggtcaa taccgcagcc 300
cccatcaccg tcaccaataa ggccctgaca ctcgcctatg aaccggagag tctcgagctc 360
actaaccaac agcaactggc ggtcaaaatc gaccccgaag gacctctgaa agccacgacc 420
gagggaatac agctgtcggt cgaccctacg acgttggagg ttgatgatgt cgactgggag 480
ttaaccgtga aactcgaccc cgatggcccc ctggattcct cagccgcagg aatcacggtc 540
cgagtcgatg agaccttgct catcgaagat gatgtatccg gacagggcaa agaactcgga 600
gtcaatctca accccgcggg accgattacg gccgacgaac agggcctgga cttagaaata 660
gacaaccaga cactcaaggt caacagtgtc accggcgggg gcgtcctagc tgtacaactc 720
aaatcccaag gtggacttac cgtacagact gacggtatcc aagtgaacac tcagaacagc 780
atcaccgtta caaacggagc tctggacgtg aaagtagccg ccaacggacc tttggaatca 840
accgacaccg ggctcacact caactatgac cccggagact tcacagttaa tgcgggcaca 900
ttgagtatta ttagggatcc ggctctcgta gccaatgcgt acctcacatc cggcgcctcc 960
acccttcagc aatttacagc taagagtgag aattccagtc aattttcttt cccgtgcgcg 1020
tactatctgc aacagtggct ttccgatggg ttgattgtta gctccctcta tctgaagctc 1080
gacagagcac agttcacgaa catgccaacg ggtgctaact atcagaacgc taggtacttt 1140
accttctggg ttggagcggg cacttcgttt aatctttctg cccttaccgc acccactatt 1200
acacccaaca ccacacaatg gaatgcattc gcccctgccc ttgattactc aggtgctcct 1260
cccttcatct acgacgcgtc ttccgtagtt acgatttatt ttgaacccac cagtggtcga 1320
ctggaaagct atctccccgt ccttaccgat aactggagcc agacctacaa ccccggcacc 1380
gtcaccctgt gtgtaaaaac ggtaagggtt caattgagat cacaaggaac cttcagcact 1440
ctagtctgtt acaatttccg ctgtcagaac acgggcattt ttaacaacaa cgctacagcg 1500
ggaaccatga cacttggacc tatcttcttc agttgtcccg ccctaagcac agccaacgct 1560
ccgtaa 1566
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 2
atgattgcac aaccacgttt ttaagaaaaa atacgggtag aagccaccat ggcgacctcg 60
acgcct 66
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 3
atttttgaag ctgctagttt ggttacggag cgttggctgt gc 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 4
agggcagagc caaracarta c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 5
cgcrgtttgr ctccagagta t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 6
ccgggtcgat tgacgatcag aaa 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 7
gcacagtcgg ggcacttcga ttcta 25

Claims (3)

1.一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株，是表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的热稳定新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)rAHR09-8bF，保藏编号为CCTCC
NO:V201933。
2.权利要求1所述耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株的构建方法，其特征在于，在耐热新城疫病毒NDV/rAHR09的P与M基因间隔区插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。
3.权利要求1所述耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株在制备预防禽腺病毒感染药物中的应用。
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