CN102732545B - 鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，挑斑纯化后获得EGFP标记的重组病毒DPV-ΔgC-EGFP。实验结果表明，三种剂量重组病毒DPV-ΔgC-EGFP和弱毒疫苗一样能够给强毒攻击后的雏鸭提供100％保护，揭示其有望发展成为一种有效预防鸭瘟病的新型疫苗。

Description

鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程领域，特别是涉及一种鸭瘟病毒转移载体及其应用。 

背景技术

利用基因工程技术，将外源DNA转移到相应载体中，通过和病毒基因重组，可以使病毒基因功能丧失，或者表达外源蛋白。通过这种方式，一方面，可以更清楚地了解缺失基因的功能，另一方面，利用病毒表达外源DNA蛋白，可将病毒发展成为一种活载体疫苗。病毒活载体疫苗的转染效率高，表达的保护性外源蛋白接近翻译后水平的成熟蛋白；这种疫苗可同时启动机体细胞和体液免疫，可通过一次免疫预防多种疾病，疫苗用量少，既降低了生产成本，又简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗间的干扰现象，因此，病毒活载体疫苗成为了疫苗研究的一个重要方向。 

随着分子生物学的发展，对一些基因组较大病毒的分子位点和结构的认识逐渐清晰，从而将它们发展成为有效的重组病毒活疫苗。在禽病疫苗研究中，鸡痘病毒，腺病毒及包括火鸡疱疹病毒、鸡传染性喉气管炎和鸡马立克氏病病毒在内的疱疹病毒。其中，禽疱疹病毒具有宿主范围窄、外源基因容量大，病毒滴度高的特点，随着对它们基因组的了解，近年来被广泛研究。 

我国是世界最大的鸭、鹅等水禽生产和消费国，以龙头企业为代表的规模化养殖在不断发展，但是，传染病的危害仍然是影响水禽养殖业健康、可持续发展的重要因素，因此，亟待加强对水禽传染病的防治。 

鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭、鹅及多种雁形目水禽的急性接触性传染病，1923年由Baudet首次在荷兰报道该病，之后在法国、美国、印度、比利时、英国、泰国、加拿大等国家流行。我国于1957年首次发现并报道，随后在华南、华中和华东等养鸭业较发达的地方发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。在我国，鸭瘟曾被列为一类动物传染病，目前仍被列为二类动物传染病。 

目前，鸭瘟病毒的基因组结构已经比较清楚。NCBI上登录了鸭瘟病毒强毒株CHv(登录号：JQ647509)、欧洲株2085(登录号：JF999965)和疫苗株VAC株(登录号：NC_013036)全基因组，疫苗株Clone-03所有的ORF也已经全部上传。鸭瘟病毒的基因组为158-160kb的线状、双链DNA，基因组类型为D型，由UL和US及US两侧的重复区域IRS和TRS组成，共包括78个编码基因。与其他疱疹病毒一样，基因组庞大的鸭瘟病毒，也可以发展成为有效的病毒活载体疫苗。鸭瘟病毒的感染宿主为鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽，因此，鸭瘟病毒载体对其他动物和人类是安全的，但可以在防治水禽相关疾病中发挥重要作用。 

糖蛋白既是动物机体免疫系统识别的成分，也是病毒感染时细胞与病毒相互作用的重要因子，其基因结构和功能一直是疱疹病毒研究的热点之一。鸭瘟病毒可编码12种糖蛋白，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM和gN。在其它疱疹病毒，体外复制非必需的糖蛋白gC、gE、gG、gI和gM常常被用作外源基因的插入位点。但是，鸭瘟病毒的相关研究仍处于起步阶段，各种糖蛋白的功能仍待进一步研究。 

发明内容

本发明的目的在于：1)提供一种重组鸭瘟病毒的转移载体及其构建方法；2)研究开发我国适于水禽免疫的可复制性病毒活载体，研制相关基因工程疫苗，以期在控制水禽重要传染病方面发挥作用，3)为鸭瘟病毒基因功能研究提供参考。 

鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。 

所述的转移载体pUC-ΔgC-EGFP的制备方法，由以下步骤完成： 

1)用Xho I和BamH I双酶切pEGFP-C1，末端补平后，平末端连结，再通过PCR方法扩增出包含CMV启动子、EGFP和SV40polyA的片段共1315bp片段，克隆进载体 pMD19-T，构建pMD-EGFP，其中含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒； 

2)以鸭瘟病毒CHv株为材料，通过PCR方法将UL44基因的左端1178bp片段和右侧1421bp片段扩增出来，克隆进载体pMD19-T，构建质粒pMD-gCL和pMD-gCR，分别包含UL44基因的左侧1178bp片段和右侧142Ibp片段。 

3)先将pMD-gCL用Hind III和Xba I酶切，回收1178bp片段，克隆进已用相应酶酶切的pUC19载体，然后再将pMD-gCR中的UL44右侧片段以BamH I和EcoR I插入到已含有UL44左侧片段的pUC-gCL载体中，获得载体pUC-ΔgC，在该载体的Xba I和BamH I之间连接含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒，获得含有报告基因的转移载体pUC-ΔgC-EGFP。 

上述扩增UL44基因的左侧1178bp片段的上、下游引物分别是： 

gCLF：5′-TTGCCCAAGCTTGGGACAAGAACGGAGGTCAAGAC-3′ 

gCLR：5′-CTAGCTCTAGAGCGATATAGAATCGTTAAGTATT-3′ 

上述扩增UL44基因的右侧1421bp片段的上、下游引物分别是： 

gCRF：5′-ATACGGGATCCCGTGGCCGTTTGTTTCTATTAT-3′ 

gCRR：5′-ATCGGAATTCCATACACGGATTAGCCAGA-3′ 

上述扩增EGFP 1315bp片段的上、下游引物分别是： 

GFPF：5′-TACCGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3′ 

GFPR：5′-AACGCTCTAGAGCATGCAGTGAAAAAAATGCT-3′。 

鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，其于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V201137。 

所述鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP的制备方法，由以下步骤完成： 

1)鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞； 

2)所述的转移载体pUC-ΔgC-EGFP转染； 

3)收获出现荧光的细胞，反复冻融后接种鸭胚成纤维细胞； 

4)将出现荧光的细胞覆盖营养琼脂； 

5)挑出含荧光斑细胞，反复冻融； 

6)将反复冻融后的含荧光斑细胞按不同浓度稀释后接种鸭胚成纤维细胞，孵育2h后，吸去上清，覆盖营养琼脂； 

7)重复步骤5)和步骤6)至获得纯化的含EGFP基因的重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP。 

采用上述方案，本发明通过。 

附图说明

图1A为含CMV启动子、EGFP、SV40polyA的T克隆质粒pMD-EGFP结构示意图；B为转移载体pUC-ΔgC-EGFP结构示意图。 

图2UL44左右臂扩增引物位置示意图。 

图3鸭瘟病毒重组株DPV-ΔgC-EGFP一步生长曲线。 

图4A为第一代重组病毒形成的荧光斑；B为第二代重组病毒形成的荧光斑；C为经过连续十五代纯化后形成的均一荧光斑。 

图5中A、B、C分别为重组病毒DPV-ΔgC-EGFP在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片，D、E、F分别为鸭瘟病毒亲本株DPV CHv在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 

含转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432，分类命名为大肠杆菌DH5α/pUC-ΔgC-EGFP(Escherichia coli DH5α/pUC-ΔgC-EGFP)。 

鸭瘟病毒(Anatid herpesvirus 1)gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V201137。 

实验材料 

1病毒毒株、细胞和实验动物 

鸭瘟病毒强毒CHv株：鸭瘟病毒CH virulent株(DPV CHv)，简称CHv株，由本实验室分离保存，该病毒株已与2012年2月23日保存在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：V201209，分类命名为鸭瘟病毒CH virulent株(DPV CHv)； 

鸭瘟病毒弱毒疫苗株：成都天邦生物制品有限公司产品，兽药生产许可证证号：(2006)兽药生产证字07022号；批准文号：兽医生字(2006)070222023)；原代鸭胚成纤维细胞由9-11日龄鸭胚按常规方法制备；试验鸭为4周龄北京白鸭，经检测无DPV病毒感染。 

2质粒和载体 

pUC19购自宝生物(大连)有限公司；pEGFP-C1购自Clontech。 

3分子生物学试剂 

AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；Xho I、BamH I、Nhe I、Xba I、Hind III、Klenow fragment、DNA Ligation Kit Ver.2.0、 -TVector等购自宝生物(大连)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCRMasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司；Goldview购自北京赛百盛基因技术有限公司；Seaplaque低熔点琼脂糖购自LONZA；Lipofectamine 2000、OPTI-MEM、小牛血清、MEM购自Invitrogen。 

4实验所用溶液及其配制 

LB液体培养基：称取Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、NaCl 10g溶于800mL去离子水中，充分搅拌，调节pH值至7.0，定容至1L，高温高压灭菌后，4℃保存。 

LB固体培养基：在调整pH值至7.0，定容至100mL的LB液体培养基中，加入1.5g琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入0.1mL氨苄青霉素(100mg/mL)或卡那霉素(50mg/mL)，铺制平板，待凝固后，4℃避光保存。 

50×TAE：将24.2g Tris和3.7g EDTA溶于80mL去离子水中，充分搅拌后，加入5.7mL冰醋酸，充分混匀，定容至100mL，室温保存。 

0.8％琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖粉溶于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μL GoldView，再倒入制胶模中，并在适当位置处插上梳子，待凝固后，放入电泳槽中进行电泳。 

SOB培养基：称取Tryptone 2g、Yeast Extract 0.5g、NaCl 0.05g溶于80mL去离子水中，充分搅拌溶解，加入1mL 250mmol/L KCl溶液，调节pH值至7.0，定容至100mL，高温高压灭菌后，4℃保存；使用前加入0.5mL灭菌的2mol/L MgCl₂溶液。 

SOC培养基：向100mL SOB培养基中加入除菌的1mol/L葡萄糖溶液2mL，充分混匀，4℃保存。 

双抗：将100万IU青霉素和100万IU链霉素加入100mL去离子水中，过滤除菌，-20℃保存。 

MEM：将9.6g MEM干粉和2.2g碳酸氢钠溶于800mL去离子水，充分搅拌，调节pH值至7.4，定容至1L，过滤除菌，4℃保存。 

细胞生长营养液：取10mL小牛血清加入到90mL MEM中，再加入1mL双抗，充分混匀，现配现用。 

细胞维持液：取3mL小牛血清加入到97mL MEM中，再加入1mL双抗，充分混匀，现配现用。 

2×MEM：称取9.6g MEM干粉、2.2g碳酸氢钠溶于400mL去离子水，充分搅拌，调节pH值至7.4，定容至500mL，过滤除菌，4℃保存。 

2×细胞维持液：取6mL小牛血清加入到94mL 2×MEM中，再加入2mL双抗，充分混匀，现配现用。 

2％低熔点琼脂糖：称取2g低熔点琼脂糖溶于100mL去离子水中，高温高压灭菌，室温保存。 

实施例1.含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒的构建 

1.1质粒pEGFP-Cl的提取 

将带有质粒pEGFP-Cl的大肠杆菌划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基中，37 ℃培养20h，挑取单个菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒操作说明进行： 

取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清； 

加250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块； 

加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液； 

加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000×g离心10min； 

吸取离心上清并转移到制备管(置于2mL Eppendorf离心管中)，12000×g离心1min，弃滤液； 

将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液； 

将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液； 

以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液； 

将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。 

将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μL Eluent，室温静置1min。12000×g离心1min。 

1.2含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒的构建 

将pEGFP-C1质粒用Xho I和BamH I双酶切； 

反应体系如下： 

回收线性化的质粒pEGFP-C1，按天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明进行：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 

将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量； 

向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解； 

将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中； 

向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中； 

向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60秒，倒掉废液； 

将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。 

将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 

将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。 

补平胶回收的线性质粒的粘性末端，按宝生物Klenow fragment操作说明进行： 

在微量离心管中配制下列反应液： 

线性pEGFP-C1            25ng 

随机引物(1nmol/μL)     2μL 

加ddH₂O至               14μL 

95℃保温3分钟，然后冰中急冷5分钟； 

向反应体系中按顺序加入下列溶液； 

10×Klenow Fragment Buffer    2.5μL 

dNTP Mixture                  2.5μL 

Klenow Fragment(2U/μL)       1μL 

37℃反应3小时； 

65℃加热5分钟停止反应。 

乙醇沉淀法回收补平后的线性DNA，操作如下； 

加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)； 

加入2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟； 

离心，取DNA沉淀，用1mL的70％冷乙醇清洗DNA沉淀后，干燥； 

用TE溶解沉淀。 

对回收的补平后线性DNA连接，按宝生物DNA Ligation Kit Ver.2.0操作说明进行： 

取5μL用TE溶解的平滑末端DNA片段； 

向上述DNA溶液中加入等体积(5μL)的Solution I，充分混匀； 

16℃反应30分钟。 

将上述反应液加入至100μL的E.coli DH5a感受态细胞中进行转化，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养20h，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，从而获得删除了多克隆位点的质粒。 

以获取删除了多克隆位点的质粒为模板，利用引物GFPF/GFPR进行PCR扩增。 

GFPF：5′-TACCGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3′ 

GFPR：5′-AACGCTCTAGAGCATGCAGTGAAAAAAATGCT-3′ 

PCR反应体系如下： 

PCR扩增反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s，57.5℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。 

利用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，T克隆到pMD19-T，按宝生物 -T Vector操作说明进行： 

在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL； 

19-T Vector                    1μL 

胶回收PCR产物              0.3pmol 

加ddH₂O至                  5μL 

加入5μL(等量)的Solution I； 

16℃反应30分钟； 

全量(10μL)加入至100μL E.coli DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟； 

42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟； 

加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60分钟； 

涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养20h，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，挑取若干个单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。 

分别用Nhe I和BamH I对抽提的质粒进行单酶切鉴定，同时用BamH I和Xba I进行双酶切鉴定。 

将鉴定正确的质粒送Invitrogen进行测序。 

测序结果表明Xho I与BamH I之间的酶切位点及BamH I均被有效切除，CMV启动子、EGFP、SV40polyA序列正确，该质粒命名为pMD-EGFP(图1A)。 

实施例2.含EGFP基因转移质粒载体的构建 

2.1含UL44左侧和右侧质粒的构建 

根据DPV CHv株全基因组序列(GenBank登录号：JQ647509)中UL43-UL45片段序列设计两对引物(图2)，它们分别是： 

gCLF：5′-TTGCCCAAGCTTGGGACAAGAACGGAGGTCAAGAC-3′ 

gCLR：5′-CTAGCTCTAGAGCGATATAGAATCGTTAAGTATT-3′ 

gCRF：5′-ATACGGGATCCCGTGGCCGTTTGTTTCTATTAT-3′ 

gCRR：5′-ATCGGAATTCCATACACGGATTAGCCAGA-3′ 

它们分别扩增鸭瘟病毒基因组UL44片段左侧和右侧片段。 

常规方法提取鸭瘟病毒CHv株基因组后，PCR分别扩增UL44左侧片段和右侧片段，T克隆至pMD19-T载体，然后转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆增殖后抽提质粒，再进行酶切鉴定，对鉴定正确的质粒进行测序，将测序验证后的这两个质粒分别命名为pMD-gCL和pMD-gCR，其中pMD-gCL包含UL44基因左侧1178bp片段，pMD-gCR包含UL44基因右侧1421bp片段。 

2.2含EGFP基因转移质粒载体的构建 

先将pMD-gCL用Hind III和Xba I酶切，回收1178bp片段，克隆进已用相应酶酶切的pUC19载体，然后再将pMD-gCR中的UL44右侧片段以BamH I和EcoR I插入到已含有UL44左侧片段的pUC-gCL载体中，获得载体pUC-ΔgC，在该载体的Xba I和BamH I之间连接含含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒，获得含有报告基因的转移质粒载体pUC-ΔgC-EGFP(图1B)并进行测序鉴定，测序结果如下： 

CCAAGCTTGGGACAAGAACGGAGGTCAAGACAGAATTATTGCGGAATAAGATACCGATCGACTCGAACATGCATGCGTTTAACATAGCATATGTAACGGCGCTAGTATTATCTGTCGTATTCGGTACGCCAGTTTTCGCATACTACATTTCATGTGCCGCGACCGGAGCACCGCCGCATATGATAGCTACATTTATTAGTGCCTCTCTTGGCATTTCTTTGGGAATTGTAACCCCATTAATTAGAGGTAATGTGTGGATAGCGATTGGGTTTGGAGCCGCTATAATGATCTTGGGCTGTTTGAAGGACTATGGCGCAAAAATGCGTGACACATGTCATTACAAATTAGCGCGTTTTGCTACGATGAGGACATATGCGGATATGGGTTTCGGAGTAGCATTTCAGCCCGCTTCAATTCCACCAAATGGCGATGGACTACCTCGAATGCACATTGGAACACACGAAGAGGACGTGTCTATTTTTGATGTCCTTAAACGGCGGAAAAGACATTCATGTTATACACTATTTTCAATCCTAACAATTCCGTTTTTATACGGAGTACTTACCTTCCCATATGGTGGTACGATACCAATCATTAAGTTAACTGAGACTACTGCATTAGCAGTTCTGTTGGGGCATCTCGTAAATGTGTTTATATTACCACATAAGACATGTTCCATGGCCATTTATGTAGAGCGTGTACTTATAATAACATATATACTACTACAGGTTATCTCTACCATATTAGTGACTAGAGGTTATGAGGAACTAATATATAGTTACGTATTTTCCGTTAGTTCACAAGTAGCGTTGTGTATATTATTGCTGCACCGTCGATGCGTTGGACTCAAGGGGCTGGCATTTTCAGTAGTAGCACGTAGCATGTTTGCATTACTTTTTTGTTCAATCGCGCTAGGTCTTGGAATTACCTACGTTCGCCGTATTTACCAAATGAGTTACTAACTGTAACTTACAGCTCATAAAAAGCGTGTCCGTCGGTGAATAAAACCATTACTATCGAACACTGACTGCAACAGTACGGTATAACATTCGTTAAAAATAACGACATGGATTGCACATAAAAGTGTCGTGTTGAGCTTTTTTCCCAATTTAGCCGACGCACATAGTCTTCGGCCGGTGTATCCTTCGTACATCATCAAGTTGTAACAATACTTAACGATTCTATATCGCTCTAGAGCATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATC TCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTACGGGATCCCG  ATACTGGTTTAATATAAAATGTTTAATAAAGCTTTTGATAAATAAACGACGTTTTAAATAGCATTCATTATATTCGGGACGCTAACAATGGTAGTGTAGTTCGAGCGCTTCACAGTTCTACAGTCATTCAAATTAATTGAGTTTATAGATAGCACAACTTCAAAAATGATGGGGCAGTGTCTATACAGATTGTTCGGCACGTTCAGTCCAAAGCTTCATATAGTATCCGAACAAAAGGAATCATAGCCACATATTGTTACATCGTTTGTTCTCCAATCGTTTATTGAACGGGCAAAACGCCTAAAGACAACCTTTGGGTATACCACCATAGTAGTATTCATCGTCGCTTTGATTGTGCGCATACATTCACGTTTACTAGACGCGATTGCAAGTCCTATCAGCAATGCTAAACGATCAGCAAATACGCCAAGTCGCTTTGCGCAATAATGTGCCAAGATTCCGCCCTCGGTCAATAGCCATCCAATGCCATATTTATCGCTGACGTGCATAGTATCCACATGCAACAGCGCAGTCATATGGCCATTAAATACGACCAATTGTAGGATATACGGACTGATAGGACAGCAATCTACTTGTATCGTAAAATGCGCTGATGGACCGCGTCGAAGTATGTCCAACGCCGCGTCTATGCCGCCAAGCGGTACGGGTGTCATTGAATAATTGTCCCCCCAAGGACAGTACGGCTCGTCTCTTAACTTACGTTTTTCTTCCGATGCAGCTAAACGAATACGCGATGATAGATTTTTCTTGATGAGTTGCCATGGAACGCGTGATGTAGTAAACATTGGTACAGCGTTCCTCTCTAGCGAAAAATGCGCCACCAATCCGCTGACGCCGATCGAATTACGTGTTACACACGAAGTAATTAATTTCCCGAACCAATTGACCGGCCATTGTCGCTTTACAAATTCTCTAAGCATCCGTCCGTAAATTAAATCCGCATCACAGCCAATCGGCGAAATACATTCTTCGCAAGCAGAACAATGAATGCTGTACGCTTTGGGCATATCGAAGCGAGGCGAGATAACCTAAACTCTCGTAAAAGATAGGTTCTCCCTTGCTTTGACATGTCCTTTGGTGATAACACTGCCCCTTTAAATAAAGGTCCGGTGGAAATATACATAATGGGGCAACATTACTGAGAGGCCATTCATCAGTGATGTCATTTTCCAACCCCATTATTAAGATAATCTGACGCATTAAATCATAATATTACTAAATAACTAGAATGACACGTTACCGACCGTTGTGGCGCTAATTCATCACACAACTCATCGATTAAACCTTATGTTTAGGATACATAACTGGACACTTGCCCGTCAATCAATCCATCTGGCTAATCCGTGTATGG 

其中第一段下划线部分为左臂(gCL)序列；第二段下划线部分为SV40polyA序列；第三段下划线部分为EGFP基因序列(EGFP基因与UL44基因编码方向相反，其中有一部分加删除线表示被去除多克隆位点序列)；第四段下划线部分为CMV立即早期启动子序列；第五段下划线部分为右臂(gCR)序列(其中用斜体标出gC基因未被替换的部分)。测序结果表明：转移质粒载体pUC-ΔgC-EGFP由gCL和gCR组成且其上的UL44基因大部分片段由CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA替换，其中EGFP内部分多克隆位点被去除，EGFP基因与UL44基因编码方向相反。 

实施例3.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP的构建与纯化 

3.1含EGFP基因重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP的构建 

常规方法制备原代鸭胚成纤维细胞，在六孔细胞培养板中培养至形成单层，接种DPV CHv株，37℃作用2h；约1h后，先按照每孔加入240μL无血清OPTI-MEM和10μLLipofectamine 2000的比例计算配制溶液1，再按照每孔加入240μL无血清OPTI-MEM 和10μL含4μg pUC-ΔgC-EGFP转移质粒DNA计算配制溶液2，然后将溶液1与溶液2混合，置室温作用20min；在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍，每孔加入1.5mL无血清OPTI-MEM，再逐滴加入0.5mL孵育后的混合液，并留一孔作为对照；37℃ 5％ CO₂培养箱中作用6h，吸去转染液，加入含细胞维持液；37℃ 5％CO₂培养箱中培养2-3天，每天观察荧光，直至出现重组病毒荧光斑。 

3.2含EGFP基因重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP的纯化 

1)收集出现荧光孔中的细胞，反复冻融三次后，接种六孔板中长满单层的鸭胚成纤维细胞，37℃作用2h后，吸去上清液，加入细胞培养维持液37℃ 5％ CO₂培养箱中培养24-48h。 

2)待出现荧光(图4A)后，吸去维持液，在六孔板中覆盖营养琼脂(2×细胞维持液与2％低熔点琼脂糖等体积混合，每孔加入2mL)，待琼脂凝固后翻转细胞培养板，37℃ 5％ CO₂培养箱中继续培养24h左右，显微镜下标记含荧光斑细胞集落，用巴氏吸管将其吸出，置于1mL细胞培养维持液中，反复冻融三次。 

3)将反复冻融后的病毒液以不同的稀释倍数感染24孔细胞培养板上的鸭胚成纤维细胞，37℃作用2h后，吸去病毒液，覆盖营养琼脂，待琼脂凝固后翻转细胞培养板，37℃ 5％ CO₂培养箱中继续培养至出现较大荧光斑(图4B)，再进行荧光挑斑，然后置于1mL细胞培养维持液中，反复冻融三次。 

4)重复步骤3)至所有的空斑均出现荧光(图4C)。 

实施例4.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP特性之一：病毒感染原代鸭胚成纤维细胞后的致细胞病变观察 

常规方法制备原代鸭胚成纤维细胞及鸭瘟病毒重组株DPV-ΔgC-EGFP和亲本株DPV CHv的接种，待细胞出现病变后分别置显微镜和荧光显微镜下观察二者对原代鸭胚成纤维细胞的致细胞病变情况。结果(图5)显示：二者均能使鸭胚成纤维细胞皱缩、变圆并脱落形成空斑；荧光显微镜下，可以观察到重组病毒产生荧光，而亲本株则没有。这种表达荧光的重组病毒为鸭瘟病毒的生物学特性研究提供了一种新型材料和新的观察手段。 

实施例5.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP特性之二：病毒的一步生长曲线测定 

将亲本病毒DPV-CHv和重组病毒DPV-ΔgC-EGFP分别以MOI＝1接种原代鸭胚成纤维细胞，每4小时收集上清和细胞，-20℃冻存，待收集完全后，反复冻融三次，于24孔板中利用空斑实验检测病毒滴度。一步生长曲线如图3所示，重组病毒株较亲本株滴度降低，重组病毒接种24h后细胞内病毒(CAV)滴度达到最高，亲本病毒在接种40h后，上清中游离病毒(RV)滴度最高是重组病毒的约40倍。与亲本病毒随着时间变化上清中病毒含量的不断增加并超过细胞中病毒含量不同，重组病毒上清中病毒含量并未随着时间的变化超过细胞中病毒滴度的变化，表明gC蛋白的缺失影响了病毒的释放。 

实施例6.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP特性之三：重组病毒对鸭的致病性实验 

将重组病毒DPV-ΔgC-EGFP分别以10⁵PFU/mL、10⁴PFU/mL和10³PFU/mL接种4周龄雏鸭1mL，每组10只，并以DPV-CHv亲本株(10⁴PFU/mL)、PBS(1mL)和DPV弱毒疫苗(1mL/羽份)作为对照，每天观察临床症状，共监测3周。从临床症状来看，组间差异明显，10⁵PFU重组病毒组30％雏鸭于接种后3-15天，出现不食或减食，10％出现死亡；10⁴PFU重组病毒组30％雏鸭于接种后4-6天，仅出现不食或减食，无死亡；10³PFU重组病毒组仅10％出现于接种后5-6天出现减食；相比之下，DPV-CHv强毒组100％死亡，而DPV弱毒疫苗组未出现异常。本实验结果表明重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP对雏鸭的致病性降低但仍有一定的致病性，选择合适的接种剂量，这种作用会显著降低。 

实施例7.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP特性之四：重组病毒免疫鸭对鸭瘟强毒的免疫保护效果 

实施例6中的各组雏鸭接种3周后，除DPV-CHv强毒组全部死亡、10⁵PFU重组病毒组10％死亡外，各组用10⁴MLD(最小致死量)DPV CHv强毒攻击。攻毒后继续监测体温和进行临床症状观察，对死亡鸭剖检观察各组织病变情况，3周后，对未死亡鸭剖检以观察各组织病变情况。从临床症状来看，重组病毒各剂量组及弱毒组总体正常，未见死亡；PBS对照组攻毒后第6天出现死亡，至第10天全部死亡。从剖检变化来看，PBS对照组呈现鸭瘟病毒的典型变化，弱毒疫苗组和重组病毒各剂量组显著减轻了由于 强毒攻击造成的各组织病变。实验结果表明，三种剂量重组病毒DPV-ΔgC-EGFP和弱毒疫苗一样能够给强毒攻击后的雏鸭提供100％保护，揭示其有望发展成为一种有效预防鸭瘟病的新型疫苗。 

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (4)

1.鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP的制备方法，其特征在于由以下步骤完成：

1)用Xho I和BamH I双酶切pEGFP-C1，末端补平后，平末端连结，再通过PCR方法扩增出包含CMV启动子、EGFP和SV40polyA的片段共1315bp片段，克隆进载体pMD19-T，构建pMD-EGFP，其中含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒；

2)以鸭瘟病毒CHv株为材料，通过PCR方法将UL44基因的左端1178bp片段和右侧1421bp片段扩增出来，克隆进载体pMD19-T，构建质粒pMD-gCL和pMD-gCR，分别包含UL44基因的左侧1178bp片段和右侧1421bp片段；

3)先将pMD-gCL用Hind III和XbaI酶切，回收1178bp片段，克隆进已用相应酶酶切的pUC19载体，然后再将pMD-gCR中的UL44右侧片段以BamH I和EcoR I插入到已含有UL44左侧片段的pUC-gCL载体中，获得载体pUC-ΔgC，在该载体的Xba I和BamH I之间连接含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒，获得含有报告基因的转移载体pUC-ΔgC-EGFP；

上述扩增UL44基因的左侧1178bp片段的上、下游引物分别是：

gCLF：5′-TTGCCCAAGCTTGGGACAAGAACGGAGGTCAAGAC-3′

gCLR：5′-CTAGCTCTAGAGCGATATAGAATCGTTAAGTATT-3′

上述扩增UL44基因的右侧1421bp片段的上、下游引物分别是：

gCRF：5′-ATACGGGATCCCGTGGCCGTTTGTTTCTATTAT-3′

gCRR：5′-ATCGGAATTCCATACACGGATTAGCCAGA-3′

上述扩增EGFP1315bp片段的上、下游引物分别是：

GFPF：5′-TACCGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAATCAATIACG-3′

GFPR：5′-AACGCTCTAGAGCATGCAGTGAAAAAAATGCT-3′。

2.根据权利要求1所述方法构建的鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichiacoli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。

3.鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP的制备方法，其特征在于由以下步骤完成：

1)鸭瘟病毒Chv株感染原代鸭胚成纤维细胞；

2)根据权利要求1所述的方法制备的转移载体pUC-ΔgC-EGFP转染步骤1)所述的经鸭瘟病毒Chv株感染过的原代鸭胚成纤维细胞；

3)收获经步骤2)转染后出现绿色荧光的原代鸭胚成纤维细胞，反复冻融后接种原代鸭胚成纤维细胞；

4)待步骤3)中接种后的原代鸭胚成纤维细胞出现绿色荧光后，将出现荧光的细胞覆盖营养琼脂；

5)挑出含荧光斑细胞，反复冻融；

6)将反复冻融后的含荧光斑细胞按不同浓度稀释后接种鸭胚成纤维细胞，孵育2h后，吸去上清，覆盖营养琼脂；

7)重复步骤5)和步骤6)至获得纯化的含EGFP基因的重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP。

4.根据权利要求3所述方法构建的鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，其于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V201137。