CN108324937A - 表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其制备和应用；所述火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT‑Penton是火鸡疱疹病毒活载体的基因组上的基因UL45与基因UL46之间的间隙处插入Penton基因得到，该火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT‑Penton用于防治安卡拉病，利用本发明中的重组疫苗rHVT‑Penton可以达到同时预防马立克氏病和肝炎‑心包积液综合征的效果。由此类推，利用本发明中的火鸡疱疹病毒细菌人工染色体重组外源基因可以达到一针防治两种甚至多种疾病的目的。

Description

表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫 苗及其制备和应用
技术领域
本发明涉及动物基因工程疫苗领域，具体地指一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其制备和应用。
背景技术
肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)又名安卡拉病(Ankara disease)，是由禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的，以心包积液、包涵体肝炎为特征的禽类急性传染病。近几年，该病在世界多个国家和地区爆发，给养禽业带来巨大威胁和经济损失。该病毒可水平传播，也可以垂直传播。该病毒主要感染3-6周龄肉鸡，死亡率高达80％；也可感染10-20周龄蛋鸡和种母鸡；其它禽类如鹌鹑、鸽子等感染的案例也有报道。FAdV-4是无囊膜病毒，病毒粒子呈二十面体对称，其衣壳由六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤突蛋白(fiber)构成。病毒感染细胞的过程中，病毒表面的五邻体与细胞表面的整合素结合，促进整合素介导的细胞内吞，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。有研究表明，外源表达的禽腺病毒血清4型五邻体蛋白具有较好的免疫原性，可诱导机体产生免疫保护作用。
目前国内外防控肝炎-心包积液综合征主要使用传统的灭活疫苗，有用病毒感染的鸡的肝脏匀浆液制备的灭活疫苗，或者用细胞增殖的病毒制备的灭活疫苗。这类灭活疫苗存在灭活不完全的可能性，免疫鸡群存在很大的散毒风险。并且由于灭活疫苗在机体内不能复制，刺激机体产生免疫时间短，需要多次免疫才能达到免疫效果。
目前，没有防控该病的商品化疫苗。因此急需研发安全有效的防控肝炎-心包积液综合征的新型疫苗。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其制备和应用，该火鸡疱疹病毒活载体疫苗以火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株作为载体，构建其细菌人工染色体(Bacterial artificialchromosome,BAC)，在大肠杆菌中利用同源重组技术重组FAdV-4五邻体基因，构建火鸡疱疹病毒重组腺病毒五邻体基因工程活载体疫苗，为防控FAdV-4提供安全、有效的基因工程疫苗，为新型重组疫苗研发提供高效、快速的操作平台。
为实现上述目的，本发明提供的一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton，所述火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton是火鸡疱疹病毒活载体的基因组上的基因UL45与基因UL46之间的间隙处(在HVT-FC126基因组的95321位点和95322位点之间)插入Penton基因得到，其中，所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种制备上述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗的方法，包括以下步骤：
1)构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC
将火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株(简称HVT，购买自中国兽医药品监察所)的全基因组(GeneBank accession NO.:NC_002641.1)通过同源重组的方法插入到含有腺嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因(gpt)和绿色荧光蛋白基因(egfp)的BAC质粒上得到火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC；
2)含有penton基因和卡那基因(kan)的真核表达质粒的构建
在pCAGGS质粒(由湖北大学生命科学院马立新教授赠送，本实验室保存。质粒图谱如图1)EcoRI/SphI两个酶切位点之间插入penton基因得到重组质粒pCAGGS-Penton；同时将抗性筛选标记基因卡那基因(kan)插入到重组质粒pCAGGS-Penton，得到重组质粒pCAGGS-Penton-Kan；其中所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示，其Penton蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3)构建含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton；
运用Red/ET重组将含有五邻体基因和卡那基因的表达盒片段插快速稳定地插入到火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC中，从而得到含有五邻体和卡那基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton-Kan；然后阿拉伯糖再次诱导Red/ET重组删除卡那基因，从而得到含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton。
4)制备表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗
将重组质粒pHVT-BAC-Penton转染CEF细胞拯救出重组病毒，删除BAC骨架后，即获得表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton。
作为优选方案，制备上述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗的方法，包括以下步骤：
1)构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC
a.含有同源臂的BAC骨架的构建
以pHVTDS-pHA1质粒(英国Venugopal K.Nair教授赠送，质粒图谱见图2)为模板扩增包含火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段扩增(L、R)；扩增的基因片段两端含有Pac I酶切位点，引物为：
上游引物为：ttaattaaGATGAGCTGACGTGTGGAAT；
下游引物为：ttaattaaACTAATATGGGCACACCCAC(黑体部分为Pac I酶切位点)；
得到扩增片段经Pac I酶切后回收；pHA2质粒((购于华中农业大学刘正飞教授，质粒图谱见图4)同样经PacI酶切，回收后与PacI酶切的含同源臂的片段连接，得到含有同源臂、筛选标记及BAC骨架的转移载体pHA2-L-R，转移载体pHA2-L-R经NotI酶切后，电泳回收，﹣20℃冻存备用。
b.含有BAC骨架的重组病毒rHVT-BAC的筛选和纯化
待六孔板中新鲜制备的CEF细胞生长至80％密度，接种HVT-FC126病毒至六孔板中。转染上述中回收的线性化转移载体pHA2-L-R；转染后消化细胞转接原代CEF，再经筛选、纯化得到纯化的重组病毒rHVT-BAC；
c.重组病毒rHVT-BAC环状基因组的提取
将上述重组病毒rHVT-BAC感染细胞，培养并提取重组病毒rHVT-BAC感染细胞的总DNA(其中，含有环状的病毒重组病毒rHVT-BAC的DNA)，测DNA浓度后置于冰上备用。
d.重组病毒基因组电转到大肠杆菌GS1783感受态细胞
将rHVT-BAC环状基因组电转到GS1783感受态细胞，经过摇菌复苏，涂布于含氯霉素平板上培养，经鉴定筛选，最终得到含有火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒HVT全基因组的BAC质粒pHVT-BAC的大肠杆菌GS1783感受态细胞。
2)含有penton基因和卡那基因(kan)的真核表达质粒的构建
a.含有penton基因真核表达质粒pCAGGS-Penton的构建
提取禽腺病毒FAdV-4HB1502的病毒基因组，用EcoRI-Penton-F/SphI-Penton-R引物扩增penton基因；扩增的片段penton和pCAGGS载体分别经EcoRI和SphI双酶切，酶切产物经T4连接酶连接后转化DH5α感受态细胞；挑选单克隆提取质粒，经EcoRI和SphI双酶切鉴定，得到真核表达质粒pCAGGS-Penton；
b.含有kan基因的真核表达质粒pCAGGS-Penton-kan的构建
首先以pEPkan-S2质粒为模板，用kan-F/kan-R引物扩增以I-SceI酶切位点为起始的卡那霉素抗性基因kan；再以回收的kan为模板，以引物BglⅡ-50bp-kan-F/BglⅡ-50bp-kan-R扩增得到kan-box；kan-box片段和pCAGGS-Penton质粒分别经BglⅡ酶切、回收，再连接，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定得到含有kan基因的真核表达质粒pCAGGS-Penton-kan；
3)构建含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton
a.含有penton和kan基因的电转化产物的制备
以pCAGGS-Penton-kan为模板，Cassette-F/Cassette-R引物扩增Penton-kan表达盒，然后以Penton-kan表达盒为模板，用含有UL45/UL46插入位点上、下游各50bp序列基因的引物50bp-Cassette-F/50bp-Cassette-R扩增，扩增的PCR产物50-Penton-kan-Cassette-50，回收扩增产物，冻存于﹣20℃冻存备用。
b.电转化含有Penton-kan线性表达盒(第一次Red重组)
将50-Penton-kan-Cassette-50PCR产物加入到含有pHVT-BAC质粒的大肠杆菌GS1783/pHVT-BAC感受态细胞中；电转培养挑选单菌落RFLP、PCR鉴定，得到的重组质粒为pHVT-BAC-Penton-kan。
c.第二次Red重组
将第一次Red重组鉴定阳性的菌液接种LB培养基(30μg/mL氯霉素)培养筛选，在含有氯霉素和卡那霉素双抗性平板培养基中筛选鉴定，得到重组质粒pHVT-BAC-Penton；
4)制备表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗
a.重组病毒rHVT-BAC-Penton的拯救
提取重组质粒pHVT-BAC-Penton，转染次代CEF细胞拯救出重组病毒rHVT-BAC-Penton。
b.Cre/loxp重组删除重组病毒rHVT-BAC-Penton的BAC骨架
细胞培养板中培养CEF至90％，接种重组病毒rHVT-BAC-Penton；6h后转染表达Cre酶的质粒pCAGGS-NLS/Cre；培养挑选，最终得到表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton。
本发明还提供了一种上述含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton，其特征在于：所述重组质粒pHVT-BAC-Penton的基因组上基因UL45与基因UL46之间的间隙处(在HVT基因组95321位点和95322位点之间)插入Penton基因，其中，所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示。
作为优选方案，所述重组质粒pHVT-BAC-Penton的基因组US2区(HVT基因组139758位点和140762位点之间)插入BAC骨架，此BAC骨架含有腺嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因(gpt)和绿色荧光蛋白基因(egfp)。
本发明还提供了一种上述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton在防治安卡拉病中的应用。
本发明的原理：
本发明的火鸡疱疹病毒活载体利用构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒，即火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126的细菌人工染色体，在此基础上提供一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其应用。本发明利用大肠杆菌(例如GS1783)提取HVT重组质粒，转染鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)快速拯救出rHVT-BAC。进一步地，本发明利用Red/ET重组，在大肠杆菌中插入禽腺病毒血清4型五邻体基因到质粒pHVT-BAC，得到重组质粒pHVT-BAC-Penton，随后提取重组质粒，转染CEF细胞，即可获得含有禽腺病毒血清4型五邻体基因重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗株。
本发明的有益效果在于：
1.利用本发明中的火鸡疱疹病毒细菌人工染色体操作平台构建重组病毒，利用绿色荧光和卡那抗性双筛选标记筛选重组病毒，大大缩短了获得重组病毒的周期。
2.本发明中的火鸡疱疹病毒细菌人工染色体重组外源基因后对细菌人工染色体进行了剔除，无功能性外源序列插入，对病毒基因组也无影响，不存在遗传物质发生跨物种转移的可能。
3.利用本发明中的重组疫苗rHVT-Penton可以达到同时预防马立克氏病和肝炎-心包积液综合征的效果。由此类推，利用本发明中的火鸡疱疹病毒细菌人工染色体重组外源基因可以达到一针防治两种甚至多种疾病的目的。
4.利用本发明中的重组疫苗rHVT-Penton免疫18日龄鸡胚或者免疫1日龄时雏鸡，免疫时间早，可较早产生抗体，重组疫苗可长期存在于体内，一次免疫即可提供终身保护。
综上所述，因此，我们开发了表达禽腺病毒血清4型免疫原性蛋白的活载体疫苗。我们以火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株作为载体，构建其细菌人工染色体(Bacterialartificial chromosome,BAC)，在大肠杆菌中利用同源重组技术重组FAdV-4五邻体基因，构建火鸡疱疹病毒重组腺病毒五邻体基因工程活载体疫苗。以火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株作为载体的重组疫苗具有安全性高，保存运输方便；不受母源抗体影响，一次免疫即可在机体持续存在；胚胎免疫或1日龄免疫，可以较早的诱导机体产生免疫反应的优势。该重组疫苗为防控FAdV-4提供安全、有效的基因工程疫苗，为新型重组疫苗研发提供高效、快速的操作平台。
附图说明
图1为pCAGGS质粒图谱；
图2为pHVTDS-pHA1质粒图谱；
图3为含有火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段扩增图；
图4为pHA2质粒图谱；
图5为转移载体pHA2-L-R的基因构成示意图；
图6为真核表达质粒pCAGGS-Penton的鉴定图；
图中，图6A为EcoRI-Penton-F/SphI-Penton-R引物PCR扩增penton基因鉴定图；
图6B为pCAGGS-Penton质粒EcoRI和SphI双酶切鉴定图；
图6C为pCAGGS-Penton质粒转染DF1细胞，Penton蛋白在DF1细胞中表达westernblot图；
图7为重组质粒pHVT-BAC-Penton的构建图；
图中，图7A为PCR扩增含有50bp同源臂的表达盒50-Penton-kan-Cassette-50的电泳图，其长度为4963bp；
图7B为kan基因删除前后的表达盒扩增的电泳图；泳道1和泳道2：Penton上游引物Penton-F和表达盒下游引物Cassette-R扩增第一次Red/ET重组的阳性克隆得到约3131bp的PCR产物；泳道4和泳道5：Penton上游引物Penton-F和表达盒下游引物Cassette-R扩增第二次Red/ET重组的阳性克隆得到约2083bp的PCR产物；
图8为重组病毒rHVT-BAC-Penton在倒置显微镜470nm蓝色激发光下可见带有绿色荧光的病毒噬斑的示意图；
图9为删除BAC骨架的重组病毒rHVT-Penton在倒置显微镜470nm蓝色激发光下病毒噬斑没有绿色荧光(黑色箭头所指)的示意图；
图10为Western blot检测rHVT-Penton表达Penton蛋白的示意图；
图11为免疫重组疫苗rHVT-Penton诱导机体血清中产生抗体水平图；间接ELISA检测免疫重组疫苗rHVT-Penton后1-5周产生较高水平的针对五邻体蛋白的抗体；
图12为免疫重组疫苗rHVT-Penton后第五周机体外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+和CD3+T细胞的比例图；
图13为免疫重组疫苗rHVT-Penton刺激机体外周血淋巴细胞产生的CD4+/CD8+T淋巴细胞比例图；
图14为免疫重组疫苗rHVT-Penton刺激机体血清中产生IFN-γ和IL-4图；
图15为免疫105PFU和104PFU重组疫苗rHVT-Penton对禽腺病毒血清4型强毒株攻毒的保护率图；
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
下述的技术步骤中如未特别说明，均为本领域的常规方案，下述试剂或原料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：含有BAC骨架的重组病毒的筛选和纯化
1.含有同源臂的BAC骨架的构建
以pHVTDS-pHA1质粒(英国Venugopal K.Nair教授赠送，质粒图谱见图2)为模板扩增包含火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段扩增(L、R)。扩增的基因片段两端引入Pac I酶切位点，
扩增上游引物为：ttaattaaGATGAGCTGACGTGTGGAAT；
下游引物为：ttaattaaACTAATATGGGCACACCCAC(黑体部分为PacI酶切位点)。
PCR扩增体系：Primer star 0.5μL；2×Primer star buffer 25μL，dNTP 4μL，模板1μL，上下游引物各1μL，ddH2O补齐50μL，混匀后按以下程序进行反应：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸8min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段长度约7.7kb(图3)，经Pac I酶切后回收。pHA2质粒(购于华中农业大学刘正飞教授，质粒图谱见图4)同样经Pac I酶切，回收后与Pac I酶切的含同源臂的片段连接，构建的含有同源臂、筛选标记及BAC骨架的转移载体pHA2-L-R，全长约16.6kb，其示意图如图5。
2.含有同源臂的BAC骨架重组到HVT基因组
转移载体pHA2-L-R经NotI酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳回收。取9-10日龄SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通)制备原代CEF细胞，24h后0.05％胰酶(购自Gibico公司)消化，消化的细胞以1.3×106/孔的量接种六孔板。12h后，待细胞生长至80％密度，以1MOI在六孔板中接入HVT病毒(火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株简称HVT，购买自中国兽医药品监察所)的全基因组(GeneBank accession NO.:NC_002641.1)。6h后，转染4μg回收的线性化转移载体pHA2-L-R。转染36h后，用0.05％胰酶将细胞消化下来，接种新鲜制备的原代CEF。
3.含有BAC骨架的重组病毒rHVT-BAC的筛选和纯化
每12h观察细胞，待绿色荧光噬斑产生且病变达到70％～80％时，用0.05％含有EDTA的胰酶消化，转接到新鲜制备的原代CEF。并加入加压筛选培养基，加压培养基用1mL1mol/L氢氧化钠溶液溶解定量的麦考酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤，溶解后迅速加入Medium199培养基中，再用盐酸调节pH值(麦考酚酸终浓度为300μg/mL，黄嘌呤为60μg/mL，次黄嘌呤为100g/mL)。每24h更换一次加压筛选培养液。待细胞出现病变，且病变达到70％～80％时，再次转接到已更换加压筛选培养基新鲜原代CEF上。经过几轮加压筛选，直至所有的病变噬斑均有绿色荧光。
实施例2：重组病毒基因组电转到大肠杆菌GS1783
1.GS1783感受态细胞的制备
将-80℃保存的大肠杆菌GS1783在LB平皿上划线，挑选单菌落接种于5mL SOB培养基中，32℃170r/min振荡培养过夜。以1:100将培养过夜的GS1783接种于100mL的SOB培养基，32℃170r/min振荡培养。2h后测定菌液的OD600，当OD600＝0.5-0.6时，将其置于冰水混合物中，晃动使菌液均匀冷却，之后每隔5min晃动一次，共冰浴20min。将菌液转移至冰浴预冷的50mL离心管中，4℃4000r/min离心10min，弃掉上清，收集菌体。菌体用去离子水配好的灭菌的10％甘油洗涤，洗涤前10％甘油需预冷。细菌完全重悬后，10％甘油补满离心管，4℃。4000r/min离心10min，弃掉上清。再用10％甘油重复洗涤2遍，吸净上清沉淀用600-800μL的10％甘油重悬，分装于1.5mL离心管中，每管50μL。冻于﹣80℃备用。
2.重组病毒rHVT-BAC环状基因组的提取
制备好次代CEF铺于100mm细胞培养皿，待细胞长满80％-90％，接种2MOI量的重组病毒。48-60h细胞保持良好形态，荧光显微镜观察50％以上的细胞带有绿色荧光。此时，PBS洗两遍。向细胞培养皿中加2mL细胞裂解液(0.6％SDS，10mM EDTA,pH7.5)，轻轻均匀晃动，室温放置20min使所有细胞都被裂解。用细胞刮铲将细胞轻轻刮入两个2mL离心管中，每管加入10μL RnaseA，室温放置30min。加入660μL的5M NaCl轻轻混匀后4℃冰箱放置至少8h(放置过夜或24h)。4℃下12000r/min离心30min。剪去枪头的尖端吸取上清于新的离心管中，加入等体积的酚仿异戊醇(25:24:1)抽提蛋白，轻轻上下颠倒离心管。4℃下12000r/min离心10min，用剪去尖端的枪头吸取上清，氯仿异戊醇再次抽提蛋白两遍。吸取上清，加入预冷的2倍体积无水乙醇，轻柔混匀，-20℃静置2h 4℃下12000r/min离心30min，轻轻倒掉上清。沉淀用预冷的70％乙醇洗涤1遍，置于超净工作台5-10min吹干(不宜太干否则不易溶解)。加入50-100μL的去离子水(Elution buffer)溶解DNA(不要吹吸，静置溶解)，测得DNA浓度后置于冰上电转化用。
3.重组病毒基因组电转到大肠杆菌GS1783感受态细胞
0.1cm的电转杯和1.5mL EP管置于冰上预冷。将40μL新鲜制备的GS1783感受态细胞加入1.5mL EP管中。用光滑的枪头轻轻加入上一步新鲜提取的含有rHVT-BAC环状基因组的总DNA，冰浴10min。将电转条件设定为1500V、200Ω、25uF。用光滑的枪头将电转化感受态细胞GS1783与重组MDV感染细胞总DNA的混合物吸入到0.1cm的冰冷灭菌的电转杯中(不要吹吸)，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸将电转杯四周的水珠吸干，盖好盖，立即放人电击室中，按一下Pulse键，听到蜂鸣声并看到电击完成后显示屏上的电击参数和曲线后，并看到显示屏的右下角的“P”不断闪烁时，立即打开电击室的盖，迅速在电转杯中加入32℃的400μL SOC培养基(LB中含0.2mmol/L葡萄糖，0.1mmol/L MgSO4，0.1mmol/L MgCl2)。轻轻重悬细胞后，迅速吸出转移到2mL无菌Eppendorf管中，32℃、225转/min摇菌复苏2h。所有400μL SOC涂板，涂布于含氯霉素(Cm 34μg/mL)的LB培养基平板上，32℃培养24h。
实施例3：含有HVT全基因组的BAC质粒的拯救
1.含有HVT病毒基因组的质粒(pHVT-BAC)的提取
将用BAC分子克隆化病毒克隆提取质粒，扩增egfp基因，普通凝胶电泳法初步鉴定为阳性的单菌落，用Qiagen plasmid Midi kit试剂盒(QIAGEN中量提取试剂盒，购自Qiagen公司)大量提取质粒。具体步骤为：
将初步鉴定BAC分子克隆化病毒的阳性克隆，划线于含氯霉素(Cm 34μg/mL)的抗性LB培养基平板上，32℃培养24h，挑取阳性克隆，小瓶摇菌16h后再用中瓶摇菌200mL，摇菌12h-14h，按试剂盒说明书和改进的方法提取BAC分子克隆化病毒的质粒，用500mL灭菌离心瓶，4℃，6000转离心15min；尽量弃上清，加入P1溶液(含LyseBlue和RNaseA酶，购自Qiagen公司)10mL，彻底混匀。加入P2溶液(购自Qiagen公司)15mL，立即轻轻混匀，直到蓝色均匀。加入P3(购自Qiagen公司)溶液15mL，立即轻轻混匀，到蓝色彻底消失为止。4℃，20000转离心30min，将上清过柱子，用Wash Buffer(购自Qiagen公司)洗涤两次，加入200μL TE洗脱下来备用。
2.病毒的拯救
新鲜制备的次代CEF按1.3×106孔接种6孔板，细胞长满至80％。将0.5μg鉴定正确的阳性质粒pHVT-BAC按照脂质体介导的转染方法转染。转染36h后用0.05％胰酶消化细胞，含5％血清维持液吹打将细胞分散，转接原代CEF。每隔12h观察荧光噬斑。
实施例4：含有penton基因真核表达质粒pCAGGS-Penton的构建
禽腺病毒FAdV-4HB1502(GenBank accession N.:KX421401.2)由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室于2015年在某鸡场采集病料中分离得到。分离方法是，感染的肝脏组织病料匀浆后冻融三次，12000rpm/min 4℃离心10min，取上清经绒毛尿囊膜途径接种9日龄SPF鸡胚，鸡胚传三代。收取的鸡胚尿囊液用EasyPure Viral DNA/RNA Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取病毒基因组，用EcoRI-Penton-F/SphI-Penton-R引物(表1)扩增penton基因如图6A(1578bp)。扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳回收，回收penton片段和pCAGGS载体(pCAGGS质粒由湖北大学生命科学院马立新教授赠送，本实验室保存。质粒图谱如图1，其长度为4790bp)分别经EcoRI和SphI双酶切，酶切产物经T4连接酶连接后转化DH5α感受态细胞。挑选单克隆提取质粒，经EcoRI和SphI双酶切鉴定(图6B)，鉴定正确的阳性质粒进行测序，测序结果显示penton基因正确插入pCAGGS载体。将鉴定正确的质粒pCAGGS-Penton转染DF1细胞，转染48h后收取细胞，western blot结果显示pCAGGS-Penton质粒转染DF1细胞能够正确表达Penton蛋白，大小约65KD(图6C)。
表1
实施例5：含有kan基因真核表达质粒pCAGGS-Penton-kan的构建
首先以pEPkan-S2质粒为模板，用kan-F/kan-R引物扩增988bp 5’端以I-SceI酶切位点为起始的卡那霉素抗性基因kan。在pCAGGS-Penton质粒的Penton表达盒上选择单一酶切位点BglⅡ。再以回收的kan为模板，以引物BglⅡ-50bp-kan-F/BglⅡ-50bp-kan-R扩增得到kan-box(1048bp)。kan-box片段和pCAGGS-Penton质粒分别经BglⅡ酶切、回收，再连接转化DH5α感受态细胞，挑选单菌落PCR和酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pCAGGS-Penton-kan。引物见表2。
表2
实施例6：Red/ET重组得到重组质粒pHVT-BAC-Penton
1.含有penton和kan基因的电转化产物的制备
以pCAGGS-Penton-kan为模板，Cassette-F/Cassette-R引物(见表3)扩增Penton-kan表达盒，然后以Penton-kan表达盒为模板，用含有UL45/UL46插入位点上、下游各50bp序列基因的引物50bp-Cassette-F/50bp-Cassette-R(见表3)扩增，扩增的PCR产50-Penton-kan-Cassette-50，4963bp，其琼脂糖凝胶电泳图如图7A。回收扩增产物经基因测序显示序列完全正确冻存于﹣20℃备用。
2.含有pHVT-BAC质粒的大肠杆菌GS1783/pHVT-BAC感受态细胞的制备
将﹣80℃保存的大肠杆菌GS1783/pHVT-BAC在LB平皿上划线，挑选单菌落接种于5mL LB(+30μg/mL氯霉素)培养基中，32℃170r/min振荡培养过夜。按1:50接菌5mL，32℃，220rpm摇菌，OD600接近0.5-0.7。迅速将菌液置42℃水浴摇床中，220rpm摇15min。菌液置于冰水混合物中冰浴20min。集菌，4℃，4000rpm/min离心5min，弃上清。预冷的10％甘油重悬菌体。4℃，4000rpm/min离心5min，弃上清，共洗涤三次。50μL 10％甘油重悬菌体，置冰上备用。
3.电转化含有Penton-kan线性表达盒(第一次Red重组)
将100ng 50-Penton-kan-Cassette-50PCR产物加入到50μL感受态细胞中。将DNA/感受态混合物加入到预冷的点转杯中(冰浴10min)，1.5kV，25uF，200Ω条件下电转化。将电转后的菌液转移到1mL无抗生素的SOC中。32℃摇菌1-2h。取100μL菌液到LB固体平板(30μg/μL氯霉素和50μg/mL卡那霉素)。32℃孵育24h。挑选单菌落RFLP、PCR、测序鉴定Penton-kan表达盒正确插入到HVT UL45/UL46区的质粒命名为pHVT-BAC-Penton-kan。
4.第二次Red重组
将第一次Red重组鉴定阳性的菌液接种1mL LB培养基(30μg/mL氯霉素)，32℃，220rpm摇菌1-2h直到菌液浑浊。加入预热的含有30μg/mL氯霉素和2％L-阿拉伯糖的等体积LB液体培养基(L-阿拉伯糖必须新鲜配置过滤除菌)，32℃，220rpm摇菌1h。迅速转移至42℃水浴摇床，220rpm摇菌30min；转移至32℃，220rpm摇菌2-3h；取1mL菌液测OD600。取5-10μL菌液按1:100稀释(OD600≤0.5)或1：1000(OD600≥0.5)稀释涂布含30μg/m氯霉素和1％L-阿拉伯糖的LB的固体平板。32℃培养1-2d直到大小均匀的单菌落长出。挑单菌落分别涂含30μg/mL氯霉素和含30μg/mL氯霉素、卡那霉素双抗性平板。阳性菌落在氯霉素平板上可生长，在氯霉素和卡那霉素双抗性平板不能生长。RFLP、PCR、测序鉴定正确的重组质粒命名为pHVT-BAC-Penton。用Penton上游引物Penton-F和表达盒下游引物Cassette-R扩增第一次Red/ET重组的阳性克隆得到约3131bp的PCR产物(如图7B，泳道1和泳道2)；用相同的引物扩增第二次Red/ET重组的阳性克隆得到约2083bp的PCR产物(如图7B，泳道4和泳道5)。引物见表3。
表3
实施例7：重组病毒的拯救
按照实施例3中的方法提取重组质粒pHVT-BAC-Penton，转染CEF拯救出重组病毒rHVT-BAC-Penton(图8)。
实施例8：Cre/loxp重组删除重组病毒rHVT-BAC-Penton的BAC骨架
六孔细胞培养板中培养CEF至90％，按1MOI接种重组病毒rHVT-BAC-Penton。6h后转染表达Cre酶的质粒pCAGGS-NLS/Cre。待80％细胞病变后，将转染后收集的含有重组病毒的细胞用培养基从10-1开始作连续10倍梯度稀释，共6个稀释度。分别加入1mL稀释后的病毒液接种细胞单层，置37℃CO2培养箱。病毒吸附6h后弃除液体，用PBS洗两次，用含4％血清的2×无酚红DMEM和等体积2％低熔点琼脂糖混合，吸取混合液2mL缓慢覆盖，超净台静置30min左右，凝固后置于37℃CO2培养箱培养。出现空斑后，在荧光显微镜下观察，删除BAC骨架的病毒蚀斑有病变没有绿色荧光，没有删除BAC骨架的病毒蚀斑有病变有绿色荧光(图9)。用记号笔在没有有绿色荧光空斑处做记号。在超净工作台用无菌的将记号处的琼脂糖除去，克隆环(Corning，美国)置于孔中，加入适量0.05％胰酶消化细胞。用50μL含1％青-链霉素的M199培养基吹吸细胞，吸起细胞放入灭菌的1.5mL EP管中。将消化的细胞接种12孔细胞培养板中长满单层的CEF，72h左右可见细胞病变，荧光显微镜下观察若有绿荧光，继续纯化。重复以上步骤，直到所挑取的空斑接种CEF后使所有病变细胞都没有绿荧光，再进行最后一轮空斑筛选得到表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton，即简称重组疫苗rHVT-Penton。
实施例9：重组疫苗rHVT-Penton五邻体蛋白表达验证
将上述纯化的重组疫苗rHVT-Penton和HVT病毒接种CEF细胞，待达到80％病变时收集细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。当SDS-PAGE电泳将结束时，用蒸馏水淋洗石墨板，用不被吸收的纸巾擦干。戴上手套，剪6张3MM滤纸和1张硝酸纤维素滤膜。滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶(否则两滤纸边缘的接触会造成电流短路)，把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的上面，先借毛细作用使膜从下往上润湿后，将膜完全浸没于水中，浸泡5min除去滤膜上残留的气泡，用软铅笔在滤膜一角做标记。在一托盘中加入少量电转缓冲液(称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加水至总量为1000mL)，把6张滤纸浸泡于其中。戴上手套安装转移装置，平放底部电极(阳极)，石墨一边朝上，在这一电极上放置3张浸泡过的滤纸，精确对齐，用玻璃棒赶出气泡，把硝酸纤维素滤膜放在滤纸上，保证对齐，没有气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略略漂洗一下，然后精确平放于硝酸纤维素滤膜上，凝胶左下角与滤膜标记对齐，戴手套排除气泡。把最后3张滤纸放在凝胶上方，同样保证精确对齐不留气泡。将上方的电极(阴极)盖于夹层物上，石墨一边朝下，连接电源，根据凝胶面积按0.65mA～1.0mA/cm2接通电流，电转移1.5～2h。
Western blot方法：转印或自然晾干结束后，将上述所得NC膜置于TBST(Tris-base 2.42g，NaCl 8.77g，调pH至7.2-7.4，定容至1000mL，再加Tween-20 2Ml)中，漂洗一下，再放入封闭液(TBST+1％(w/v)BSA)中，37℃平缓摇动1-2h或4℃过夜。然后将NC膜取出，与TBST稀释的一抗(鼠源HA的单抗，兔源gB的多抗，内参GAPDH的单抗均购自武汉晟亚生物有限责任公司)37℃反应1h，TBST洗涤4-6次，每次5min，加入二抗(鼠二抗和兔二抗，购自武汉晟亚生物有限责任公司)37℃反应1h，TBST洗4-6次，每次5min，将膜置于干净的滤纸上吸干表面的水分用于化学发光(ECL，enhanced chemiluminescen)显色。
ECL显色：按2mL/膜加入ECL，并在Kodak 2000MM上获取Western Blot结果(见图10)，Penton蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
实施例10：重组疫苗rHVT-Penton对雏鸡免疫效果评价
1.重组疫苗rHVT-Penton的制备
将重组疫苗rHVT-Penton及HVT亲本病毒接种CEF细胞(见实施例2中的CEF细胞制备)，当细胞病变达到80％以上时，无菌收获病毒，进行空斑计数(PFU)，达到1x105PFU左右即可作为疫苗种子液。
2.重组疫苗rHVT-Penton免疫效果
购自北京梅里亚的SPF种蛋在无菌孵化箱孵化的170只1日龄SPF雏鸡，分为6组，1-5组每组30只，第6组20只。1组按照105PFU/只剂量免疫重组疫苗rHVT-Penton，2组按照105PFU/只剂量免疫亲本病毒，3组按照104PFU/只剂量免疫重组疫苗rHVT-Penton，2组按照104PFU/只剂量免疫亲本病毒。第5组为攻毒对照组，免疫CEF细胞。第6组为不免疫不攻毒对照组。
2.1重组疫苗rHVT-Penton刺激机体产生的抗体水平检测
2.1.1所用试剂
包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na2CO3：1.59g，NaHCO3：2.93g，用ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
10倍洗涤液：NaCl：80g，KCl：2g，Na2HPO4·12H2O：29g，KH2PO4：2g，Tween-20：5mL，用ddH2O定容至1000mL(pH＝7.4)。
封闭液：5g脱脂乳溶于100mL洗涤液。
底物液：分为底物A液和底物B液。具体组成如下：底物A液：0.006％浓度的H2O2缓冲液。底物B液：取Na2HPO4·12H2O：14.2g，柠檬酸：10.5g，用ddH2O定容至500mL配成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)，然后按终浓度为20mg/L添加联苯二胺(TMB)(使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用)。
终止液(终浓度0.025％氢氟酸溶液)：取浓度为40％氢氟酸溶液625μL，用ddH2O定容至100mL。
2.1.2间接ELISA操作步骤
(1)包被抗原的制备：penton基因连接原核表达载体构建pET28a-Penton，转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导penton蛋白表达，组氨酸层析柱纯化蛋白后测定蛋白浓度。
(2)包被：用包被液稀释抗原至工作浓度，每孔100μl加入到酶标板中，2～8℃温育15小时。
(3)洗板：弃包被液，PBST洗涤液，200μL/孔，洗涤3次，每次3min。(4)封闭：拍干酶标板，加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点。
(5)洗板：弃封闭液，同步骤(4)。
(6)加待检血清：拍干酶标板，加入待检血清，100μL/孔，设阴性对照，37℃孵育30min。
(7)洗板：弃待检样品液，同步骤(4)。
(8)加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的阳抗鸡酶标二抗(购自美国KPL公司)，体积比为1∶1000倍稀释，100μL/孔，37℃放置30min。
(9)洗板：弃酶标抗体，同步骤(3)。
(10)显色：每孔加入新配的底物A液、底物B液各50μL，室温避光显色10min。
(11)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应。
(12)测定OD450值：酶标仪测定波长为450nm时OD值。若OD450值≥0.26，判定为阳性，OD450值＜0.26，判定为阴性。
2.1.3免疫重组疫苗rHVT-Penton血清抗体检测结果
1日龄免疫，于免疫后1-5周采血分离血清，用本实验室原核表达五邻体Penton蛋白包被酶标版，间接ELISA检测血清抗体，检测OD450值高于0.26为阳性。结果如图11，阴性对照和空白对照组血清中抗体均低于阳性检测线，并且免疫亲本毒的两个组免疫血清中抗体也都低于阳性检测线。免疫104PFU重组疫苗rHVT-Penton组在免疫后第三周以后血清中抗体检测为阳性。免疫105PFU重组疫苗rHVT-Penton组在免疫后第二周血清中抗体检测为阳性，随后抗体滴度不断提高，至第五周其OD值达到最高值1.365，该组产生的抗体滴度均显著高于免疫104PFU重组疫苗rHVT-Penton(p<0.05)。免疫重组疫苗的两组均能产生针对Penton蛋白的特异性抗体。
2.2重组疫苗rHVT-Penton刺激机体产生的细胞免疫水平检测
2.2.1T淋巴细胞亚群检测
免疫后第5周(35日龄)，每组5只鸡采集抗凝血，使用外周血淋巴细胞分离试剂盒(购自天津灏洋生物技术有限公司)，按照试剂盒说明书操作步骤分离外周血淋巴细胞。分离的外周血淋巴细胞，分离的淋巴细胞分别进行细胞计数。每个样品取1×106个，200μLPBS重悬后分别加入2μL CD3、CD4、CD8抗体，4℃避光孵育20min；3000rpm/min 4℃离心10min，弃去上清，500μL PBS重悬，继续3000rpm/min 4℃离心10min；用PBS共洗涤两遍，然后用500μL含有牛血清白蛋白的PBS重悬，流式细胞仪进行细胞分选计数。流式细胞仪检测不同免疫组20000个淋巴细胞中CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞数量，并计算各淋巴细胞的比例，结果显示如下图12。免疫105PFU rHVT-Penton、104PFU rHVT-Penton和105PFU HVT-FC126的三个组产生的CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞数量均显著高于免疫CEF对照组。免疫104PFU和105PFU重组疫苗rHVT-Penton刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例显著高于免疫相同剂量的亲本毒HVT-FC126组刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例(p<0.01)。免疫105PFU重组疫苗刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例显著高于免疫104PFU重组疫苗刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例(p<0.01)；同样免疫105PFU亲本毒刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例显著高于免疫104PFU亲本毒刺激机体产生的CD4+T淋巴细胞比例(p<0.01)。免疫105PFU重组疫苗rHVT-Penton刺激机体产生的CD8+T淋巴细胞比例显著高于免疫相同剂量的亲本毒HVT-FC126组刺激机体产生的CD8+T淋巴细胞比例(p<0.05)。以上结果表明免疫两个剂量的亲本毒和重组毒均可刺激机体产生CD4+T淋巴细胞，免疫高剂量(105PFU)重组病毒才能刺激机体产生CD8+T淋巴细胞。进一步计算CD4+、CD8+T淋巴细胞比例，结果如图13所示。
2.2.2细胞因子IFN-γ和IL-4检测
免疫后第五周翼下静脉采血分离的血清，按照武汉基因美科技有限公司鸡IFN-γELISA检测试剂盒(产品编号：JYM0007Ch)，鸡IL-4ELISA检测试剂盒(产品编号：JYM0034Ch)说明书操作步骤稀释标准品，随后将标准品和待测样品加入酶标板上，最终根据标准品测得OD值分别绘制标准曲线，随后分别计算待测样品IFN-γ和IL-4浓度。细胞免疫反应导致相应的细胞因子产生。Th1型细胞免疫反应产生IFN-γ，Th2型细胞免疫反应产生IL-4。为了检测免疫重组疫苗后刺激机体产生的细胞免疫反应，我们检测了免疫后第五周疫苗免疫组和CEF空白对照组鸡血清中的IFN-γ和IL-4的含量。结果如图14所示，免疫重组疫苗rHVT-Penton和亲本病毒HVT就能产生高水平的IFN-γ和IL-4，其中重组疫苗rHVT-Penton和亲本病毒HVT刺激机体产生的IFN-γ和IL-4的水平与空白对照组相比差异极显著(p≤0.001)。而重组疫苗rHVT-Penton和亲本病毒HVT刺激机体产生的IFN-γ和IL-4量均无差异(p＞0.05)。
3.免疫重组疫苗rHVT-Penton对禽腺病毒血清4型强毒株攻毒的保护
免疫后第5周(即35日龄)按100LD50剂量攻毒，用FAdV-4强毒株HB1502(GenBankaccession N.:KX421401.2)攻毒。攻毒后观察鸡的精神状态，统计死亡情况。攻毒后1-3周每周采血，分离血清。第三周采血后，处死全部鸡只，并统计组织器官病变情况。结果显示攻毒对照组(CEF control)死亡率达到95％。免疫105PFU和104PFU重组疫苗rHVT-Penton对FAdV-4强毒攻毒的保护率分为60％和40％的，免疫105PFU和104PFU亲本毒株HVT-FC126对FAdV-4强毒攻毒的保护率分别为35％和20％。同时死亡的鸡立即解剖，肉眼观察攻毒对照组的鸡均有很严重的心包积液，而免疫重组疫苗的组，死亡鸡心包积液量相对对照组要少，仅有极少量或者完全没有心包积液。如图15，攻毒之后第四天开始出现鸡死亡的情况，第七天之后没有发生鸡只死亡情况。
4.免疫重组疫苗rHVT-Penton对马立克强毒株RB1B攻毒的保护
免疫重组疫苗7d后，从免疫的六组疫苗免疫鸡中每组随机取10只。1-5组按照所示按1000PFU/羽的剂量经腹腔注射攻MDV强毒株RB1B。攻毒后的鸡饲养在单独的负压隔离器中，统计生长和死亡情况。60d后将所有鸡处死、解剖，观察各脏器肿瘤形成情况。免疫104和105PFU重组疫苗或者亲本病毒对MDV强毒株RB1B攻毒的保护效率为100％。剖检显示免疫重组疫苗和亲本病毒的四个组的鸡均无肿瘤形成，各个脏器和组织也没有损伤。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗的制备及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> Fowl adenovirus serotype 4
<400> 1
atgtgggggt tgcagccgcc gacgtcgatt ccgccgcctc ctccgccgac cgagttaacg 60
ccctcgacct atccggcgat ggtgaacggc tatccgcctc cggccgcgtc cgcgcagagc 120
tgtccctcta gcgacggtca gagcgagctg tatatgcccc ttcagcgggt gatggcccct 180
acggggggac ggaacagcat taagtatcgc gattacacgc cgtgtcgtaa caccaccaag 240
ctgttttacg tagacaacaa ggctagcgat atcgatacgt ataacaaaga cgccaaccat 300
agcaatttcc gcaccacggt gatccataac caggatctgg acgcggacac ggccgccacc 360
gagtccatcc agttggacaa ccgctcctgc tggggcggcg acctaaaaac agccgtgcgc 420
accaactgcc cgaacgtgag cagttttttc cagagtaaca gcgtgcgcgt gcgcatgatg 480
tggaagcgcg acccgccgac tagcacggct cctccgagcg cggtaggcag cggctattcg 540
gtgcccggcg cgcagtacaa gtggtacgac ctgacgatac ccgagggtaa ctacgcgctg 600
tgcgaactga tagacctgct caacgagggc atcgtgcagc tctacctgag cgaggggcgc 660
cagaacaacg tgcaaaaatc ggacatcggg gtcaagttcg acacgcgcaa cttcggcttg 720
ctccgcgacc ccgtgacggg actggtaact ccgggcacgt acgtgtacaa gggttaccac 780
cccgacatcg tgctgctgcc cggatgcgcg atcgacttta cgtacagccg cctgagcctg 840
ctcctgggca tagggaagcg cgagccctac tcgaaggggt tcgttattac ctacgaggat 900
ctgcagggag gggatatccc ggctctgctg gacctcgact ccgtcgacgt gaacgacgct 960
gacggtgaag tgatcgagct cgacaacgct gctccccttt tacatgacag cgcgggcgtg 1020
tcgtataacg tcatttacga ccaggtgacg ggtaaacccg tgacggtgta tcgatcgtgg 1080
atgttggctt acaacgtgcc taactcgccg gccaatcaga cgaccttgct gacggtgccc 1140
gatatggcgg gcgggatcgg ggcgatgtac acgtccctgc ccgatacctt tatcgcgcct 1200
accgggttca aggaagataa cacgaccaac ctttgcccgg tcgtcggcat gaacctgttc 1260
cccacctaca ataaagttta ttaccaggcg gcgtccacgt acgtgcagcg cctggaaaat 1320
tcctgccagt cggccacagc cgccttcaac cgctttcccg aaaacgagat tctgaagcaa 1380
gcgcccccca tgaatgtttc gtccgtgtgc gataaccaac ccgccgtcgt tcagcagggt 1440
gtgttgcctg tgaagacctc gctccccgga ctgcagcgcg tgctgatcac agacgaccag 1500
cgtcgtccga taccctacgt gtataagtct atcgcgacgg ttcagccgac cgttctgagt 1560
tccgcgacct tgcagtag 1578
<210> 3
<211> 525
<212> PRT
<213> Fowl adenovirus serotype 4
<400> 3
Met Trp Gly Leu Gln Pro Pro Thr Ser Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro
1 5 10 15
Thr Glu Leu Thr Pro Ser Thr Tyr Pro Ala Met Val Asn Gly Tyr Pro
20 25 30
Pro Pro Ala Ala Ser Ala Gln Ser Cys Pro Ser Ser Asp Gly Gln Ser
35 40 45
Glu Leu Tyr Met Pro Leu Gln Arg Val Met Ala Pro Thr Gly Gly Arg
50 55 60
Asn Ser Ile Lys Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Cys Arg Asn Thr Thr Lys
65 70 75 80
Leu Phe Tyr Val Asp Asn Lys Ala Ser Asp Ile Asp Thr Tyr Asn Lys
85 90 95
Asp Ala Asn His Ser Asn Phe Arg Thr Thr Val Ile His Asn Gln Asp
100 105 110
Leu Asp Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Ser Ile Gln Leu Asp Asn Arg
115 120 125
Ser Cys Trp Gly Gly Asp Leu Lys Thr Ala Val Arg Thr Asn Cys Pro
130 135 140
Asn Val Ser Ser Phe Phe Gln Ser Asn Ser Val Arg Val Arg Met Met
145 150 155 160
Trp Lys Arg Asp Pro Pro Thr Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ala Val Gly
165 170 175
Ser Gly Tyr Ser Val Pro Gly Ala Gln Tyr Lys Trp Tyr Asp Leu Thr
180 185 190
Ile Pro Glu Gly Asn Tyr Ala Leu Cys Glu Leu Ile Asp Leu Leu Asn
195 200 205
Glu Gly Ile Val Gln Leu Tyr Leu Ser Glu Gly Arg Gln Asn Asn Val
210 215 220
Gln Lys Ser Asp Ile Gly Val Lys Phe Asp Thr Arg Asn Phe Gly Leu
225 230 235 240
Leu Arg Asp Pro Val Thr Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr Tyr Val Tyr
245 250 255
Lys Gly Tyr His Pro Asp Ile Val Leu Leu Pro Gly Cys Ala Ile Asp
260 265 270
Phe Thr Tyr Ser Arg Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ile Gly Lys Arg Glu
275 280 285
Pro Tyr Ser Lys Gly Phe Val Ile Thr Tyr Glu Asp Leu Gln Gly Gly
290 295 300
Asp Ile Pro Ala Leu Leu Asp Leu Asp Ser Val Asp Val Asn Asp Ala
305 310 315 320
Asp Gly Glu Val Ile Glu Leu Asp Asn Ala Ala Pro Leu Leu His Asp
325 330 335
Ser Ala Gly Val Ser Tyr Asn Val Ile Tyr Asp Gln Val Thr Gly Lys
340 345 350
Pro Val Thr Val Tyr Arg Ser Trp Met Leu Ala Tyr Asn Val Pro Asn
355 360 365
Ser Pro Ala Asn Gln Thr Thr Leu Leu Thr Val Pro Asp Met Ala Gly
370 375 380
Gly Ile Gly Ala Met Tyr Thr Ser Leu Pro Asp Thr Phe Ile Ala Pro
385 390 395 400
Thr Gly Phe Lys Glu Asp Asn Thr Thr Asn Leu Cys Pro Val Val Gly
405 410 415
Met Asn Leu Phe Pro Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Tyr Gln Ala Ala Ser
420 425 430
Thr Tyr Val Gln Arg Leu Glu Asn Ser Cys Gln Ser Ala Thr Ala Ala
435 440 445
Phe Asn Arg Phe Pro Glu Asn Glu Ile Leu Lys Gln Ala Pro Pro Met
450 455 460
Asn Val Ser Ser Val Cys Asp Asn Gln Pro Ala Val Val Gln Gln Gly
465 470 475 480
Val Leu Pro Val Lys Thr Ser Leu Pro Gly Leu Gln Arg Val Leu Ile
485 490 495
Thr Asp Asp Gln Arg Arg Pro Ile Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Ile Ala
500 505 510
Thr Val Gln Pro Thr Val Leu Ser Ser Ala Thr Leu Gln
515 520 525

Claims (6)

1.一种表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton，其特征在于：所述火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton是火鸡疱疹病毒活载体的基因组上的基因UL45与基因UL46之间的间隙处插入Penton基因得到，其中，所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示。
2.一种制备权利要求1所述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC
将火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株通过同源重组的方法插入到含有腺嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因gpt和绿色荧光蛋白基因egfp的BAC质粒上得到火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC；
2)含有penton基因和卡那基因kan的真核表达质粒的构建
在pCAGGS质粒的EcoRI/SphI两个酶切位点之间插入penton基因得到重组质粒pCAGGS-Penton；同时将抗性筛选标记基因卡那基因kan插入到重组质粒pCAGGS-Penton，得到重组质粒pCAGGS-Penton-Kan；其中所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示，其Penton蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；
3)构建含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton；
运用Red/ET重组将含有五邻体基因和卡那基因的表达盒片段插快速稳定地插入到火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC中，从而得到含有五邻体和卡那基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton-Kan；然后阿拉伯糖再次诱导Red/ET重组删除卡那基因，从而得到含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton；
4)制备表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗
将重组质粒pHVT-BAC-Penton转染CEF细胞拯救出重组病毒，删除BAC骨架后，即获得表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton。
3.根据权利要求2所述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒pHVT-BAC
a.含有同源臂的BAC骨架的构建
以pHVTDS-pHA1质粒为模板扩增包含火鸡疱疹病毒US2区上、下游同源臂的基因片段扩增；扩增的基因片段两端含有Pac I酶切位点，引物为：
上游引物为：ttaattaaGATGAGCTGACGTGTGGAAT；
下游引物为：ttaattaaACTAATATGGGCACACCCAC；
得到扩增片段经Pac I酶切后回收；pHA2质粒同样经PacI酶切，回收后与PacI酶切的含同源臂的片段连接，得到含有同源臂、筛选标记及BAC骨架的转移载体pHA2-L-R，转移载体pHA2-L-R经NotI酶切后，电泳回收，﹣20℃冻存，备用；
b.含有BAC骨架的重组病毒rHVT-BAC的筛选和纯化
待六孔板中新鲜制备的CEF细胞生长至80％密度，接种HVT-FC126病毒至六孔板中，转染上述中回收的线性化转移载体pHA2-L-R；转染后消化细胞转接原代CEF，再经筛选、纯化得到纯化的重组病毒rHVT-BAC；
c.重组病毒rHVT-BAC环状基因组的提取将上述重组病毒rHVT-BAC感染细胞，培养并提取重组病毒rHVT-BAC感染细胞的总DNA，测DNA浓度后置于冰上备用；
d.重组病毒基因组电转到大肠杆菌GS1783感受态细胞
将rHVT-BAC环状基因组电转到GS1783感受态细胞，经过摇菌复苏，涂布于含氯霉素平板上培养，经鉴定筛选，最终得到含有火鸡疱疹病毒细菌人工染色体质粒HVT全基因组的BAC质粒pHVT-BAC的大肠杆菌GS1783感受态细胞；
2)含有penton基因和卡那基因kan的真核表达质粒的构建
a.含有penton基因真核表达质粒pCAGGS-Penton的构建
提取禽腺病毒FAdV-4HB1502的病毒基因组，用EcoRI-Penton-F/SphI-Penton-R引物扩增penton基因；扩增的片段penton和pCAGGS载体分别经EcoRI和SphI双酶切，酶切产物经T4连接酶连接后转化DH5α感受态细胞；挑选单克隆提取质粒，经EcoRI和SphI双酶切鉴定，得到真核表达质粒pCAGGS-Penton；
b.含有kan基因的真核表达质粒pCAGGS-Penton-kan的构建
首先以pEPkan-S2质粒为模板，用kan-F/kan-R引物扩增以I-SceI酶切位点为起始的卡那霉素抗性基因kan；再以回收的kan为模板，以引物BglⅡ-50bp-kan-F/BglⅡ-50bp-kan-R扩增得到kan-box；kan-box片段和pCAGGS-Penton质粒分别经BglⅡ酶切、回收，再连接，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定得到含有kan基因的真核表达质粒pCAGGS-Penton-kan；
3)构建含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton
a.含有penton和kan基因的电转化产物的制备
以pCAGGS-Penton-kan为模板，Cassette-F/Cassette-R引物扩增Penton-kan表达盒，然后以Penton-kan表达盒为模板，用含有UL45/UL46插入位点上、下游各50bp序列基因的引物50bp-Cassette-F/50bp-Cassette-R扩增，扩增的PCR产物50-Penton-kan-Cassette-50，回收扩增产物，冻存于﹣20℃冻存，备用；
b.电转化含有Penton-kan线性表达盒，即为第一次Red重组
将50-Penton-kan-Cassette-50PCR产物加入到含有pHVT-BAC质粒的大肠杆菌GS1783/pHVT-BAC感受态细胞中；电转培养挑选单菌落RFLP、PCR鉴定，得到的重组质粒为pHVT-BAC-Penton-kan；
c.第二次Red重组
将第一次Red重组鉴定阳性的菌液接种LB培养基(30μg/mL氯霉素)培养筛选，在含有氯霉素和卡那霉素双抗性平板培养基中筛选鉴定，得到重组质粒pHVT-BAC-Penton；
4)制备表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗
a.重组病毒rHVT-BAC-Penton的拯救
提取重组质粒pHVT-BAC-Penton，转染次代CEF细胞拯救出重组病毒rHVT-BAC-Penton；
b.Cre/loxp重组删除重组病毒rHVT-BAC-Penton的BAC骨架
细胞培养板中培养CEF至90％，接种重组病毒rHVT-BAC-Penton；转染表达Cre酶的质粒pCAGGS-NLS/Cre；培养挑选，最终得到表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton。
4.一种含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton，其特征在于：所述重组质粒pHVT-BAC-Penton的基因组上基因UL45与基因UL46之间的间隙处插入Penton基因，其中，所述Penton基因序列为SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求1所述含有禽腺病毒血清4型五邻体基因的重组质粒pHVT-BAC-Penton，其特征在于：所述重组质粒pHVT-BAC-Penton的基因组US2区插入BAC骨架，所述BAC骨架含有腺嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶基因gpt和绿色荧光蛋白基因egfp。
6.一种权利要求1所述表达禽腺病毒血清4型五邻体蛋白的火鸡疱疹病毒活载体疫苗rHVT-Penton在防治安卡拉病中的应用。
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