CN110218706A

CN110218706A - 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用

Info

Publication number: CN110218706A
Application number: CN201910398647.7A
Authority: CN
Inventors: 亓文宝; 苏冠铭; 廖明; 张旭; 陈意群; 马凯雄
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: CN110218706B

Abstract

本发明公开了一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用。该重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒(HVT)的编码序列的非必需复制区中的HVT‑065和HVT‑066基因之间插入外源基因表达盒；其中，外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40 poly A依次连接而成；所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供该重组火鸡疱疹病毒的构建方法，是利用超声裂解破碎的方法进行纯化，缩短筛选的时间，获得的重组火鸡疱疹病毒rHVT‑H7HA对高致病性H7N9亚型禽流感病毒提供良好的保护，可用于后续开发新型的禽流感病毒疫苗。

Description

表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，特别涉及一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用。

背景技术

火鸡疱疹病毒(HVT)Fc-126株与马立克氏病病毒(MDV)具有抗原相关性，被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗，该疫苗无致致病性，保护效果出色^[1]。相比其它病毒载体，HVT具有其独特的优势^[2-7]，如：HVT本身就是疫苗候选株，可以感染的宿主包括鸡和水禽，但不致病，庞大的基因组可为外源基因提供多个插入位点，具有成为多价疫苗的潜力；HVT为细胞结合性病毒，可克服母源抗体的影响，可同时诱导较强的细胞和体液免疫；HVT可在宿主体内终生繁殖，一次免疫可以使宿主持续免疫；HVT载体疫苗适合早期规模化免疫，节约成本，提高效率。

目前多家公司研制的的表达不同抗原的基于HVT载体的商品化疫苗已经上市^[8-10]，例如：-ND-SB(MSD Animal Health)、HVT-ILT(MSD AnimalHealth)、HVT-IBD(Merial)、HVT-AI(Ceva)、HVT-NDV(Ceva)、HVT-IBD(Ceva)。HVT载体的商品化疫苗在多个国家的家禽养殖业中投入使用，保护效果良好。哈尔滨兽医研究所开展了H5N1亚型禽流感病毒HVT载体疫苗的研究^[11]，扬州大学和中国农业大学开展了H9亚型禽流感病毒HVT载体疫苗的研究^[12,13]。

在第5波H7N9亚型禽流感病毒流行中，出现了对鸡具有高致病性H7N9亚型禽流感病毒，对养禽业造成重大经济损失^[14,15]；2016年10月至2017年6月，全国有752例人感染H7N9禽流感病毒。我国从2017年下半年开始在全国养殖场推广H5/H7禽用二价苗，人感染H7N9禽流感病毒病例迅速下降，该研究结果表明，病毒主要在家禽之间以及从家禽到人类传播，疫苗可以有效阻断病毒在家禽之间传播，从而减少病毒在家禽和人之间传播^[16]。因此，禽用禽流感疫苗不但可以促进养禽业发展而且可以降低H7N9流感病毒对公共卫生安全的威胁。

目前国内使用的禽用禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗虽然可以保护家禽，降低禽流感爆发的风险，但是全病毒灭活疫苗自身的缺陷增加了禽流感防控的难度^[17,18]。首先，该类疫苗容易受母源抗体干扰，需要大剂量多次免疫，成本高。其次，不能准确区分野毒感染和疫苗免疫，为禽流感流行病学监控增加难度。而且，由于该类疫苗主要产生体液免疫，因此疫苗株与流行株要高度同源，否则免疫效果不理想。开发新型的禽流感病毒疫苗对防控禽流感具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

本发明的另一目的在于提供一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法。

本发明的又一目的在于提供所述表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒(HVT)的编码序列的非必需复制区中的HVT-065和HVT-066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；

所述的外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40 poly A依次连接而成；

所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的MCMV启动子优选为鼠源MCMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的火鸡疱疹病毒优选为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株。

所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的分类命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，保藏编号为CCTCC NO:V201914，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，为利用同源重组原理，将外源基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)的基因组中，经过筛选和纯化获得重组病毒，即所述表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)构建转移质粒pG-65/66-H7HA

①以火鸡疱疹病毒的总DNA为模板，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物，进行PCR扩增，得到左同源臂L1片段；同时，以SEQ ID NO:6和为SEQ ID NO:7引物，进行PCR扩增，得到右同源臂R1片段；

②用引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9融合左同源臂L1片段和SV40 polyA序列，得到L2片段；用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10融合右同源臂R1片段和MCMV启动子序列，得到R2片段；

③将L2片段和R2片段用限制性内切酶Aflii进行酶切，然后用T4连接酶连接L2酶切后的产物和R2酶切后的产物，得到L2+R2片段；最后将L2+R2片段克隆到pGEM-T-Vector上，得到重组质粒pG-65/66；

④利用限制性内切酶Aflii和NheI，以及T4连接酶将H7HA片段亚克隆到重组质粒pG-65/66中，得到转移质粒pG-65/66-H7HA；其中，H7HA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

⑤将火鸡疱疹病毒接种原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，得到感染亲本病毒的细胞；接着将转移质粒pG-65/66-H7HA线性化后电转染感染亲本病毒的细胞，然后在37℃条件下培养至细胞病变，经过鉴定、筛选和富集，得到感染重组病毒的细胞；

⑥将感染重组病毒的细胞重悬在SPGA缓冲液中，然后进行超声破碎提取游离的病毒粒子，筛选能够表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白的重组病毒火鸡疱疹rHVT-H7HA，即为所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

步骤①中所述的火鸡疱疹病毒优选为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株。

步骤②中所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

步骤②中所述的MCMV启动子优选为鼠源MCMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

步骤⑤中所述的线性化为采用限制性内切酶BsmBI进行线性化。

步骤⑤中所述的电转染的条件为：1.5kV/cm，脉冲时间0.5ms。

步骤⑤中所述的培养所用的培养基为含有2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。

步骤⑤中所述的筛选为采用有限稀释法进行筛选。

步骤⑥中所述的SPGA缓冲液配方如下：蔗糖0.218M，磷酸二氢钾0.0038M，磷酸氢二钾0.0072M，谷氨酸钠0.0049M，牛血清白蛋白1％(w/w)。

步骤⑥中所述的超声破碎提取体系中感染重组病毒的细胞的浓度优选为2×10⁶个/mL。

步骤⑥中所述的超声破碎的条件优选为：功率140W～220W，时间2min。

所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在重组表达HA蛋白中的应用。

所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在制备疫苗中的应用。

所述的疫苗为H7亚型高致病性禽流感疫苗，上述获得的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒可作为活性成分用于制备H7亚型高致病性禽流感疫苗，该重组火鸡疱疹病毒能够提供针对H7N9亚型高致病性禽流感病毒的良好保护力。

所述的H7亚型禽流感疫苗的剂量优选为1500～5000PFU。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、火鸡疱疹病毒(HVT)是一种细胞结合性的胞内病毒，病毒粒子在细胞核内成熟，胞浆和细胞培养上清液几乎不能检测到感染性的病毒粒子^[19]。普通的冻融法不能高效裂解细胞核，释放感染性病毒粒子，而且病毒粒子在普通条件下不稳定。基于HVT的病毒特性，目前纯化重组HVT主要是限稀释法，以感染病毒的细胞为单位，重复筛选，直至筛选纯化出重组病毒。这种方法的缺点在于，1个细胞可以被多个病毒粒子感染，细胞成为一个装载重组毒和亲本毒的容器，以细胞为单位进行纯化，需要经过长时间的筛选，才能得到重组病毒。本发明首先利用有限稀释法富集重组病毒，在细胞病变区域内，重组病毒的比例占多数时，即可利用SPGA作为稳定剂，超声破碎裂解细胞，释放出单个病毒粒子，再通过有限稀释法把重组病毒和亲本病毒区分，进行纯化，缩短筛选的时间，得到纯化更彻底得病毒粒子。

2、本发明中构建了能够表达H7N9流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，HA基因能够在该重组火鸡疱疹病毒基因组中稳定存在，并可在体外可稳定表达。

3、本发明构建的重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA对高致病性H7N9亚型禽流感病毒提供良好的保护。

附图说明

图1是转移质粒pG-65/66-H7HA的构建图谱。

图2是重组病毒rHVT-H7HA的构建策略图。

图3是重组病毒富集图；其中，图A为白光图；B为荧光图。

图4是重组病毒rHVT-H7HA PCR鉴定结果图；其中，图A为H7HA表达盒基因；图B为重组病毒rHVT-H7HA PCR鉴定结果(泳道M：250bp Mark；泳道1:重组病毒rHVT-H7HA的HA基因；泳道2：亲本病毒；泳道3：CEF细胞)。

图5是重组病毒rHVT-H7HA间接免疫荧光鉴定图；其中，图A为重组病毒株；图B为亲本病毒株。

图6是重组病毒rHVT-H7HA遗传稳定性PCR图(M：Mark；泳道1：0代；泳道2：5代；泳道3：10代；泳道4：15代)。

图7是重组病毒rHVT-H7HA遗传稳定性间接免疫荧光图(图中：1代表0代；2代表5代；3代表10代；4代表15代)。

图8是重组病毒rHVT-H7HA蛋白表达鉴定图。

图9是血清抗体变化结果图；其中，图A为免疫DMEM培养液抗体滴度变化；图B为免疫1500PFU重组病毒抗体滴度变化；图C为免疫5000PFU重组病毒抗体滴度变化。

图10是攻毒保护实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得；其中，火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株购自中国兽医药品监察所。

实施例1、火鸡疱疹病毒(HVT)的增殖和DNA的提取

用9～10日龄SPF鸡胚(新兴大华农禽蛋有限公司)，按照常规方法制备和培养原代及次代鸡胚成纤维细胞(CEF)，24h后细胞长成单层。火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株感染次代CEF，培养3～5d(天)，出现典型的细胞病变，待细胞病变到80％，胰酶(GIBCO公司)消化收获含有病毒的细胞，加入细胞冻存液，液氮保存。提取细胞和病毒的总DNA(细胞和病毒总DNA的提取如文献^[20]所述)。

实施例2、转移质粒pG-65/66H7HA的构建(图1、2)

2.1改造HA基因

H7N9亚型禽流感病毒株(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016^[15]；GISAID website序列号为EPI_ISL_248796)是高致病性禽流感病毒，对鸡致死，提取该病毒的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板分别用引物(HA-F和HA1-R；HA1-F和HA-R)进行PCR扩增，得HA1和HA2片段。用引物(HA-F和HA-R)融合HA1和HA2，获得改造的H7HA片段(SEQ ID NO:1)，即通过PCR突变技术把高致病性H7N9亚型禽流感病毒的HA片段裂解位点附近碱性氨基酸删除，由高致病性转为低致病性。H7HA片段大小约为1.7kb。引物序列如下(5'-3')：

HA-F：GTCGCTAGCATGAACACTCAAATCCTGGTATT(SEQ ID NO:4)；

HA-R：GGCCTTAAGTTATATACAAATAGTGCACCGCATG(SEQ ID NO:5)；

HA1-F:AATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGTG(SEQ ID NO:6)；

HA1-R:AAATAGGCCTCTTCCCTTTGGAATCTCAGGAACATTCTTC(SEQ ID NO:7)。

H7HA基因序列(SEQ ID NO:1):

ATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCATTCCAACAAATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACTGAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACACCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCTAGAATTTTCGGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGAAAATTCGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAACCCATGGGATTCACATACAATGGAATAAGAACTAATGGGGTGACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCACAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAGAAAGCCCAGCTATAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTTTCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGGAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTCGTACCGAGTCCAGGAGCAAGACCACAAGTTAATGGTCAATCCGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATACTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAAACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGCAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAAAGGAGTCTTCTGCTGGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGTACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGGAAATTGAACCGGCTTATAGCAAAAACCAACCAACAATTTAAGTTGATAGACAATGAATTCAATGAGGTAGAGAAGCAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTATGGTCATACAATGCTGAACTCTTGGTGGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTAAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACGGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGAAAATACAGAGAAGAAGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAA。

2.2构建质粒pG-65/66

以实施例1中获得的HVT总DNA为模板，以L1-F和L1-R引物PCR扩增左同源臂L1片段(约1280bp)；以R1-F和R1-R引物扩增右同源臂R1片段(约1100bp)。鼠源MCMV启动子序列(SEQ ID NO:2)和SV40 polyA序列(SEQ ID NO:3)由北京擎科生物科技有限公司合成得到；然后用引物L1-F和L2-R融合左同源臂L1片段和SV40 polyA尾片段，得到L2片段；并用引物R2-F和R1-R融合右同源臂R1片段和鼠源MCMV启动子片段，得到R2片段。用限制性内切酶Aflii(Takara公司)对L2和R2进行酶切，然后用T4连接酶把L2酶切后产物和R2酶切后产物进行连接，得到L2+R2片段，再与pGEM-T-Vector(Promega公司)进行连接，转化进DH5α感受态细胞(Takara公司)，按照质粒提取试剂盒(Omega公司)说明书提取质粒，将获得的重组质粒命名为pG-65/66，其中引物序列如下(5'-3')：

R1-F：GGGCGGAGTTGGGGGATCCACTAGTGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC(SEQ ID NO:8)；

R1-R：CTAGTGATTGAGACGCAGGGTATGCATATTCCATAACAGAAAT(SEQ ID NO:9)；

L1-F：AGGGATCCATCAGCAATGCGGG(SEQ ID NO:10)；

L1-R：GTTTTTTCGGATCCTCTAGAGTCGACAATTATTTTATTTAATAACATATA(SEQ ID NO:11)；

R2-F:TTTCTTAAGCCCGCCGCTAGCCGCTGCGATCGACGAGTTCT(SEQ ID NO:12)；

L2-R:TTTCTTAAGGATCTAGAGCGGCCGCGGG(SEQ ID NO:13)；

鼠源MCMV启动子序列如下(5'-3')(SEQ ID NO:2)：

AACTCCGCCCGTTTTATGACTAGAACCAATAGTTTTTAATGCCAAATGCACTGAAATCCCCTAATTTGCAAAGCCAAACGCCCCCTATGTGAGTAATACGGGGACTTTTTACCCAATTTCCCAAGCGGAAAGCCCCCTAATACACTCATATGGCATATGAATCAGCACGGTCATGCACTCTAATGGCGGCCCATAGGGACTTTCCACATAGGGGGCGTTCACCATTTCCCAGCATAGGGGTGGTGACTCAATGGCCTTTACCCAAGTACATTGGGTCAATGGGAGGTAAGCCAATGGGTTTTTCCCATTACTGGCAAGCACACTGAGTCAAATGGGACTTTCCACTGGGTTTTGCCCAAGTACATTGGGTCAATGGGAGGTGAGCCAATGGGAAAAACCCATTGCTGCCAAGTACACTGACTCAATAGGGACTTTCCAATGGGTTTTTCCATTGTTGGCAAGCATATAAGGTCAATGTGGGTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGTATTCTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGCGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGATGAGTCAATGGGAAAAACCCATTGGAGCCAAGTACACTGACTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACATTGAGTCAATAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATGGGAGGTAAGCCAATGGGTTTTTCCCATTACTGGCACGTATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGAGCTCCTCGCTGCAG。

SV40 polyA序列如下(5'-3')(SEQ ID NO:3)：

GATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTT。

2.3构建转移质粒pG-65/66-H7HA

利用限制性内切酶Aflii和NheI(Takara公司)和T4连接酶(Thermo FisherScientific公司)把上述H7HA片段亚克隆至重组质粒pG-65/66中，获到转移质粒pG-65/66-H7HA。

实施例3、构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

3.1构建和富集重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

感染火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株的CEF(即实施例1中获得的含有病毒的细胞)接种新鲜原代CEF(实施例1中制备)，37℃孵育4h后，胰酶消化，取感染后的8×10⁶个原代CEF细胞悬浮在PBS缓冲液中，加入40μg已用限制性内切酶BsmBI(NEB公司)线性化的转移质粒pG-65/66-H7HA，总体积为0.7ml，混匀，转移至电转杯中，电转染条件为：1.5kV/cm，脉冲时间0.5ms，在电转仪(美国BTX公司Gemini X²型号)中进行电转染。电转完成后，把细胞转移至60mm培养皿(dish)中，加入10％(v/v)血清(Biological Industries胎牛血清)，24h后换2％(v/v)血清DMEM维持培养基(含2％(v/v)血清)，37℃培养3～5d。用胰酶消化感染病毒的细胞，取100个感染病毒的细胞接种至1块96孔板中，37℃培养3～5d，弃掉培养液，加入50μL胰酶消化30s，弃掉胰酶，加入100含10％(v/v)血清的DMEM培养液中止消化，吹打均匀，把每孔的细胞悬液平均加入两块对应的96孔板，37℃培养3～5d，其中1块板进行间接免疫荧光试验(IFA)：甲醇固定30min，PBS洗3次，一抗为1:400稀释鼠抗H7N9流感病毒阳性血清(鼠抗H7N9流感病毒阳性血清的制备过程如下：4周龄BALB/c小鼠(购于北京维通利华生物有限公司)鼻腔攻毒50μL L 10⁶EID₅₀，攻毒14天后收集小鼠血清，其中，所用病毒为H7N9亚型流感病毒(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)孵育2h，PBS洗3次，每次10min；二抗为1:400稀释的山羊-鼠IgG-FITC(北京全式金生物技术有限公司)，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察绿色荧光。标记出荧光数量多细胞病变少的孔，另一块用于收集相对应的孔的感染重组病毒的细胞至EP管中，完成一轮纯化。再取100个感染重组病毒的细胞接种至1块96孔板中，重复操作，直至病变区域大部分出现绿色荧光细胞簇，完成重组病毒的富集(图3)。

3.2.2纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

把富集的感染病毒的细胞(1×10⁷个)重悬在5mLSPGA缓冲液中，其中SPGA缓冲液配方如下^[21]：蔗糖(sucrose)0.218M，磷酸二氢钾(monopotassium phosphate)0.0038M，磷酸氢二钾(dipotassium phosphate)0.0072M，谷氨酸钠(monosodium glutamate)0.0049M，牛血清白蛋白(bovine albumin powder)1％(w/w)。然后进行超声裂解破碎细胞，获取游离病毒粒子，其超声裂解条件为：功率140W，时间2min。破碎后，将溶液5000g离心15min，取上清液，连续10倍稀释，接种至96孔板中，放在含5％CO₂的37℃培养箱培养3d，把每孔的细胞悬液平均分成两份，加入两块对应的铺满CEF的96孔细胞培养板中，放在含5％CO2的37℃培养箱培养3～5d，一块用于IFA检测，选取稀释度最低，荧光数量最多，细胞病变区域最少的孔。把相对应的板，符合标准的孔用0.25％EDTA胰酶消化后，分成3份，1分提取病毒和细胞总DNA用引物L1-F(SEQ ID NO:10)和R1-R(SEQ ID NO:9)、HA-F(SEQ ID NO:4)和HA-R(SEQID NO:5)进行PCR鉴定(图4)。2分接种至两块相对应6孔板中，放在含5％CO₂的37℃培养箱培养3～5d，其中一块板用于IFA检测(图5)，另一块板用于收获纯化完全的感染重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA的细胞，加入细胞冻存液，液氮保存。

所述的重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:V201914。

实施例4、重组火鸡疱疹病毒体外连续传代稳定性和表达稳定性

4.1rHVT-H7HA的PCR分析

将重组病毒rHVT-H7HA连续传15代，每间隔5代，用特异性引物(HA-F和HA-R；见实施例2.1)扩增HA基因，以亲本HVT(即火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株)及CEF细胞为对照。重组病毒样品泳道出现特异性的大小约为1.7kb的条带，说明HA基因能够在重组火鸡疱疹病毒基因组中稳定存在(图6)。

4.2rHVT-H7HA的间接免疫荧光实验

rHVT-H7HA连续传15代，每间隔5代进行间接免疫荧光检测(见实施例3.2)，以亲本毒株(即火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株)为对比。rHVT-H7HA产生的病变区域在波长为530nm可观察到绿光，亲本毒株不能观察到绿色荧光。证明rHVT-H7HA在体外可稳定表达(图7)。

实施例5、rHVT-H7HA的Western blot分析

1000PFU重组病毒rHVT-H7HA接种6孔板，等到出现明显病变，用蛋白裂解液(碧云天)处理感染病毒的细胞，以转移质粒pG-65/66-H7HA以及亲本毒株(即火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株)为对照；把收获的细胞进行SDS-PAGE电泳，转NC膜。将膜放置孵育盒，加入5％(w/w)脱脂奶粉，37℃封闭2h。TBST洗膜3次，每次摇晃15min。加入一抗兔抗H7N9 AIV HA蛋白单克隆抗体(北京义翘神州)，孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15min。加入1:10000稀释的羊抗兔IgG波长为800nm的荧光二抗(Odessey)，避光孵育1h。TBST洗膜。在扫膜仪中扫描，拍照(图8)。

实施例6、动物实验

6.1免疫后抗体滴度监测

把30只1d龄SPF鸡(新兴大华农禽蛋有限公司)分成3组，每组10只。G1组免疫DMEM细胞培养液200μL；G2组以1500PFU剂量免疫重组病毒rHVT-H7HA；G3组以5000PFU剂量免疫重组病毒rHVT-H7HA；感染重组病毒rHVT-H7HA的细胞用DMEM细胞培养液进行稀释成1500PFU和5000PFU，以颈部皮下注射方式免疫1d SPF鸡。免疫后每隔1周颈静脉采集血液，持续5周，将采集血液静置7h，收集析出的血清。用血凝抑制实验(HI)测定血清抗体水平：在96孔血凝板中先加入25μL PBS缓冲液，加入25μL血清进行2倍梯度稀释，每孔加入25μL的4单位抗原，抗原为灭活的H7N9亚型禽流感病毒株(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)，37℃反应30min，加入25μL1％鸡红细胞(参考2007年版国家流感中心标准操作规程制备)，37℃反应30min。每周血清抗体变化如图9所示。

6.2攻毒保护实验

5周后，G1和G2组每只鸡通过滴鼻方式以10⁵ELD₅₀/0.2mL的剂量的高致病性禽流感病毒即H7N9亚型禽流感病毒株(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)。攻毒后持续观察14d，记录各组发病及死亡情况。G1组和G2组分别有1只发病并死亡，保护率为90％，对照组鸡只全部发病且死亡(图10)。

上述结果表明重组病毒rHVT-H7HA能够提供针对H7N9亚型高致病性禽流感病毒的完全保护力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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序列表

<110> 华南农业大学

<120> 表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H7HA基因序列

<400> 1

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaaccc atgggattca catacaatgg aataagaact 420

aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccacagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg gaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatccgg aagaattgac 720

tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccaa accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagcaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020

ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080

tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagtact 1140

caatcggcaa ttgatcaaat aacagggaaa ttgaaccggc ttatagcaaa aaccaaccaa 1200

caatttaagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260

aattggacca gagattctat aacagaagta tggtcataca atgctgaact cttggtggca 1320

atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380

gtaaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca cgggttgctt tgaaatattt 1440

cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagaaaa 1500

tacagagaag aagcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560

tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620

gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtgaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 1391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 鼠源MCMV启动子

<400> 2

aactccgccc gttttatgac tagaaccaat agtttttaat gccaaatgca ctgaaatccc 60

ctaatttgca aagccaaacg ccccctatgt gagtaatacg gggacttttt acccaatttc 120

ccaagcggaa agccccctaa tacactcata tggcatatga atcagcacgg tcatgcactc 180

taatggcggc ccatagggac tttccacata gggggcgttc accatttccc agcatagggg 240

tggtgactca atggccttta cccaagtaca ttgggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt 300

tttcccatta ctggcaagca cactgagtca aatgggactt tccactgggt tttgcccaag 360

tacattgggt caatgggagg tgagccaatg ggaaaaaccc attgctgcca agtacactga 420

ctcaataggg actttccaat gggtttttcc attgttggca agcatataag gtcaatgtgg 480

gtgagtcaat agggactttc cattgtattc tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 540

atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acactgcgtc aatagggact ttccattggg 600

ttttgcccag tacataaggt caatagggga tgagtcaatg ggaaaaaccc attggagcca 660

agtacactga ctcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 720

gggtgagtca acaggaaagt cccattggag ccaagtacat tgagtcaata gggactttcc 780

aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat gggaggtaag ccaatgggtt tttcccatta 840

ctggcacgta tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 900

aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt caatagggac 960

tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc 1020

cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080

aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140

cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200

aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260

tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320

ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380

cctcgctgca g 1391

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SV40 polyA序列

<400> 3

gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 60

aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 120

tgcaataaac aagtt 135

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HA-F

<400> 4

gtcgctagca tgaacactca aatcctggta tt 32

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HA-R

<400> 5

ggccttaagt tatatacaaa tagtgcaccg catg 34

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HA1-F

<400> 6

aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc ctatttggtg 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HA1-R

<400> 7

aaataggcct cttccctttg gaatctcagg aacattcttc 40

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R1-F

<400> 8

gggcggagtt gggggatcca ctagtgaatt cgtttaatgt tagtttattc 50

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R1-R

<400> 9

ctagtgattg agacgcaggg tatgcatatt ccataacaga aat 43

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1-F

<400> 10

agggatccat cagcaatgcg gg 22

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1-R

<400> 11

gttttttcgg atcctctaga gtcgacaatt attttattta ataacatata 50

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R2-F

<400> 12

tttcttaagc ccgccgctag ccgctgcgat cgacgagttc t 41

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L2-R

<400> 13

tttcttaagg atctagagcg gccgcggg 28

Claims

1.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒的编码序列的非必需复制区中的HVT-065和HVT-066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；

所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：

所述的MCMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒FC126株。

3.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：

所述的重组火鸡疱疹病毒的分类命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，保藏编号为CCTCC NO:V201914，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心。

4.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建转移质粒pG-65/66-H7HA

②用引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9融合左同源臂L1片段和SV40polyA序列，得到L2片段；用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10融合右同源臂R1片段和MCMV启动子序列，得到R2片段；

(2)构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

5.根据权利要求4所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤⑥中所述的超声破碎的条件为：功率140W～220W，时间2min。

6.根据权利要求4所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤①中所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株；

步骤②中所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

步骤②中所述的MCMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根据权利要求4所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤①中所述的SPGA缓冲液配方如下：蔗糖0.218M，磷酸二氢钾0.0038M，磷酸氢二钾0.0072M，谷氨酸钠0.0049M，牛血清白蛋白1％(w/w)。

8.权利要求1～3任一项所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在重组表达HA蛋白中的应用。

9.权利要求1～3任一项所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在制备疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述的疫苗为H7亚型高致病性禽流感疫苗。