CN116375818A - 携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用 - Google Patents

携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用，涉及分子生物学和基因工程领域。本发明提供了一种核酸分子，可用于构建重组H5N8亚型禽流感病毒，该重组H5N8亚型禽流感病毒相比野生型H5N8病毒毒力减弱，且可在SPF鸡肺脏中复制并表现致病性。

Description

携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建 及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，尤其是涉及携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用。
背景技术
禽流感病毒是A型流感病毒属的负链RNA病毒，根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原性差异可分成不同亚型，HA有16种抗原型，NA有9种抗原型，不同的HA和NA组成不同的流感病毒亚型。目前已确认可感染人的禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H5N2、H5N8、H10N7和H6N1。新型H5N8是2013年爆发的能感染人类的禽流感病毒亚型，人感染后主要表现为流感样症状，进而发展为肺炎和急性呼吸窘迫综合征等重症，患者重症比例高，致死率可达29％，因此引起了社会各界的广泛关注。
哺乳动物流感病毒的相关研究中，多是在细胞破膜基础上通过流式或者免疫荧光技术检测感染细胞中病毒的NP蛋白表达情况来进行体外研究，或通过免疫组化、荧光切片等方法来检测其体内感染情况。这些方法不仅步骤复杂、耗时长、成本高，且还不能直观分析病毒在体内的分布。利用反向遗传技术构建融合荧光报告基因的流感病毒是病毒研究领域中的一种重要技术方法。目前，携带报告基因的多种不同亚型流感病毒已成功用于体内或体外研究，包含H9N2、H7N9、H1N1等多种亚型，但还没有携带报告基因的H5N8亚型重组病毒的研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种NS蛋白，含该NS蛋白的重组H5N8亚型禽流感病毒具有比野生型H5N8病毒减弱的毒力，且可在SPF鸡肺脏中复制并表现致病性。
本发明还提供一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒。
本发明还提供生物材料。
本发明还提供上述重组H5N8亚型禽流感病毒的构建方法。
本发明还提供上述核酸分子、生物材料、构建方法、携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的应用。
本发明还提供一种基于重组H5N8亚型禽流感病毒的禽类动物感染模型的构建方法。
根据本发明的第一方面实施例的一种NS蛋白，所述NS蛋白的氨基酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列、mApple荧光报告基因的氨基酸序列、SEQID NO.2第480-600位所示氨基酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2第第222至457位所示。
根据本发明的一些实施例，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第711至1418位所示。
根据本发明的一些实施例，所述NS蛋白由含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体表达得到。
根据本发明的一些实施例，所述NS蛋白还包括连接肽1和连接肽2；所述连接肽1用于连接SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列与mApple荧光报告基因的氨基酸序列；所述连接肽2用于连接mApple荧光报告基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2第480-600位所示氨基酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述连接肽1为非自剪切肽。可以为柔性连接肽或刚性连接肽。所述柔性连接肽包括但不限于GSGG。所述刚性连接肽包括但不限于EAAAK。
根据本发明的一些实施例，所述连接肽2为自剪切肽。所述自剪切肽包括但不限于P2A、T2A、E2A和F2A。
根据本发明的一些实施例，所述NS蛋白还可以包括N端或/和C端连接的标签。
根据本发明的第二方面实施例的一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒，所述重组H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA由如1)和2)所示的8个独立的RNA片段组成；
1)与野生型H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码HA蛋白的RNA片段1、编码NA蛋白的RNA片段2、编码M蛋白的RNA片段3、编码PA蛋白的RNA片段4、编码PB1蛋白的RNA片段5、编码PB2蛋白的RNA片段6以及编码NP蛋白的RNA片段7；
2)编码本发明第一方面实施例中所述的NS蛋白的RNA片段8。
根据本发明的一些实施例，所述野生型H5N8亚型禽流感病毒包括H5N8亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/JM01/2020株。
根据本发明的一些实施例，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2第第222至457位所示。
根据本发明的一些实施例，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第711至1418位所示。
根据本发明的第三方面实施例的如A1至A6任一项所述的生物材料，
A1：编码本发明第一方面实施例中所述的NS蛋白的核酸分子；
A2：含有A1中所述核酸分子的表达盒；
A3：含有A1中所述核酸分子的重组载体；
A4：含有A1中所述核酸分子的重组微生物；
A5：含有A1中所述核酸分子的转基因细胞系；
A6：含有A1中所述核酸分子的重组病毒。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述核酸分子所编码的蛋白质的DNA分子。包括但不限于启动子、转录终止序列。例如：还可以包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。具体地，可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
根据本发明的一些实施例，重组微生物具体可为细菌、酵母、藻或真菌。
根据本发明的一些实施例，所述转基因细胞系不包括动植物繁殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组病毒可为携带有所述核酸分子的重组腺病毒、重组腺相关病毒等。
根据本发明的一些实施例，A1中所述核酸分子如B1至B3任一项所示；
B1：所述核酸分子的核苷酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.1第1-710位所示核苷酸序列、所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列、SEQ ID NO.1第1419至1876位所示核苷酸序列；
B2：与B1中所述的核酸分子杂交且编码相同蛋白的核酸分子；
B3：与B1或B2中所述的核酸分子具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的核酸分子。
根据本发明的第四方面实施例的携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建方法，包括以下步骤：
将能够表达本发明第二方面实施例所述的8个RNA片段对应的cDNA片段的重组表达载体组合转染细胞，将培养后获得的细胞液接种鸡胚，培养获得所述携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒。
根据本发明的一些实施例，所述重组表达载体组合为将各个基因或多个基因插入表达载体得到的重组载体；即各个基因可以插入同一表达载体，也可以拆解为若干组别，分别插入于不同的表达载体中。各个基因单独或多个分布在各个重组载体上；也就是说，每个重组载体可以表达单独的基因，也可以表达多个基因偶联基因。上述各个基因指分别编码HA蛋白、NA蛋白、M蛋白、PA蛋白、PB1蛋白、PB2蛋白、NP蛋白或本发明第一方面实施例中所述的NS蛋白的cDNA片段。
根据本发明的一些实施例，所述细胞为H5N8亚型禽流感病毒的病毒复制许可的宿主细胞。所述细胞包括哺乳动物细胞。
根据本发明的一些实施例，所述哺乳动物细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38、HL-8或Hela细胞。
根据本发明的一些实施例，所述重组表达载体包括双向表达载体。所述双向表达载体包括但不限于pDZ-B5载体或pHW2000。本领域常用的双向表达载体均可适用。
根据本发明的一些实施例，所述共转染细胞的时间为4～8h。例如，可以为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8h。
根据本发明的一些实施例，所述细胞液包括细胞、细胞裂解产物和细胞培养上清中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述细胞液的获取方法包括：用含胰酶和牛血清白蛋白(BSA)的培养基培养共转染后细胞，冻融后即得细胞液。培养时间优选为36～60h。例如，可以为36、40、44、48、52、56或60h。
根据本发明的一些实施例，所述鸡胚包括9-11日龄SPF鸡胚。
根据本发明的第五方面实施例的C1至C7任一项在D1或D2中的应用，
C1：本发明第一方面实施例所述的NS蛋白；
C2：本发明第二方面实施例所述的携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒；
C3：本发明第三方面实施例所述的生物材料；
C4：本发明第四方面实施例所述的构建方法；
D1：制备筛选抗H5N8亚型禽流感病毒的细胞模型或动物模型；
D2：制备研究H5N8亚型禽流感病毒感染机制的产品。
根据本发明的一些实施例，所述动物模型包括禽类动物模型和哺乳动物模型。所述禽类动物模型包括但不限于鸡、鸭、鹅和鹌鹑。所述哺乳动物包括但不限于猪、小鼠。
根据本发明的第六方面实施例的一种基于重组H5N8亚型禽流感病毒的禽类动物感染模型的构建方法，包括以下步骤：
将本发明的第二方面实施例所述的携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒通过鼻腔接种到禽类动物体内，即得禽类动物感染模型。所述禽类动物感染模型可用活体成像仪器进行观察。
根据本发明的一些实施例，所述禽类动物包括但不限于鸡、鸭、鹅和鹌鹑。可以为SPF级的禽类动物。
根据本发明的一些实施例，所述禽类动物为鸡，所述携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的接种有效量为103～106EID50。优选为3周龄鸡。
根据本发明的一些实施例，所述感染的时间为2～14天。例如：可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。
本发明至少具有如下有益效果：
1、H5N8病毒为高致病性禽流感病毒，在构建重组病毒过程中，由于其高致病力，易在病毒拯救的适应性传代操作中致死鸡胚，导致鸡胚在24h内死亡，使得收集传代后的病毒困难。本发明构建了一种重组H5N8亚型禽流感病毒，相比于野生型病毒毒力减弱，并可在SPF鸡肺脏中复制并表现致病性。经SPF鸡胚传代后，仍可保持致病性与发光特性，具有良好的稳定性。
2、相比于小鼠，鸡的组织及羽毛因自发荧光会干扰成像的灵敏度和特异性。相比其他荧光素酶基因，红色荧光蛋白mApple在介质中具有更好穿透性和亮度更强，且在细胞内成像背景低，其发光不需要底物参与催化反应，适于体内外感染方面的研究，能够避免鸡的组织及羽毛自发荧光的干扰，利于活体成像观测。利用携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒构建得到禽类动物感染模型(包括鸡感染模型)具有可视化功能，在无需解剖的条件下，能够通过全器官成像和流式细胞术检测重组H5N8亚型禽流感病毒在体内的分布位置及感染动态，还能对病毒载量进行快速评估。这为禽流感病毒的研究建立了一种可视化工具，也对流感病毒传播性、致病性及致病机制研究具有重要意义。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是本发明一实施例的重组质粒pDZ-B5-NS-mApple的构建示意图；
图2是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒P1-P4代的mApple基因鉴定电泳图；
图3是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒P1-P4代以及野生型H5N8病毒的NS1蛋白及GAPDH蛋白的Western-Blot检测结果；
图4是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒以不同感染复数(MOI)感染MDCK细胞荧光检测结果；
图5是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒在MDCK细胞中的增殖曲线图；其中，H5N8-mApple重组病毒记为H5N8-mApple，野生型H5N8病毒记为H5N8；
图6是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒与野生型H5N8病毒对SPF鸡(无特定病原体鸡)致病力的比较结果图；其中A为H5N8-mApple重组病毒感染SPF鸡的存活率图；B为重组病毒与野生型病毒以104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡的存活率对比图；C为重组病毒与野生型病毒感染SPF鸡后2～4天口咽拭子病毒滴度对比图；D为重组病毒与野生型病毒感染SPF鸡后2～4天泄殖腔拭子病毒滴度对比图；E为重组病毒与野生型病毒感染SPF鸡后第3天脑、肺、气管病毒滴度对比图；
图7是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡的体内成像图；A左为野生型病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后第3天肺脏成像图；A右为H5N8-mApple重组病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后第3天肺脏成像图；B为H5N8-mApple重组病毒不同EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后3DPI荧光信号分布情况；C为H5N8-mApple重组病毒不同EID50/200μL感染剂量和野生型病毒感染SPF鸡后荧光信号转化为荧光强度值图；D为H5N8-mApple重组病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后3、5、7天荧光信号分布情况；E为为H5N8-mApple重组病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后3、5、7天荧光信号转化为荧光强度值图；
图8是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒104EID50/200μL感染剂量感染SPF鸡后第3、5天肺脏被感染免疫细胞(mApple+CD45+)变化图；其中，上图为H5N8-mApple感染组和对照组的3只鸡在第3、5天时被感染的免疫细胞(mApple+CD45+)的等高线图；下图为被感染的免疫细胞(mApple+CD45+)在感染后第3、5天的变化图；
图9是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒感染组和对照组在不同MOI体外感染外周血单个核细胞(PBMC)后检测mApple阳性和NP阳性细胞群的等高线图；
图10是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒以不同MOI体外感染外周血单个核细胞(PBMC)后mApple阳性和NP阳性细胞群比例检测结果；
图11是本发明一实施例的H5N8-mApple重组病毒以MOI＝10体外感染外周血单个核细胞(PBMC)后感染的单核/巨噬细胞(mApple+KUL01+)比例图；其中，上图为mApple和KUL01双阳性细胞等高线图，下图为mApple和KUL01双阳性比例检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明中涉及的双向表达载体pDZ-B5、293T细胞系和MDCK细胞由人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。
9-11日龄鸡胚购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司。SPF鸡均购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司。
本发明中涉及的pDZ-B5-HA、pDZ-B5-NA、pDZ-B5-M、pDZ-B5-PA、pDZ-B5-PB1、pDZ-B5-PB2、pDZ-B5-NP是以pDZ-B5质粒为出发质粒构建得到，其中，
质粒pDZ-B5-HA是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8禽流感病毒A/chicken/Guangdong/JM01/2020株(以下简称野生型H5N8病毒)HA基因(GenBank：OP748410)的cDNA(即用上下游含有同源臂即pDZ-B5载体的部分序列的特异性引物扩增，然后将带有同源臂的HA基因的cDNA通过同源重组连接到质粒pDZ-B5上；下同)；
质粒pDZ-B5-NA是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒NA基因(GenBank:OP748414)的cDNA；
质粒pDZ-B5-M是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒M基因(GenBank:OP748415)的cDNA；
质粒pDZ-B5-PA是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒PA基因(GenBank:OP748417)的cDNA；
质粒pDZ-B5-PB1是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒PB1基因(GenBank:OP748412)的cDNA；
质粒pDZ-B5-PB2是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒PB2基因(GenBank:OP748411)的cDNA；
质粒pDZ-B5-NP是在pDZ-B5质粒BsmB I位点插入了H5N8病毒NP基因(GenBank:OP748413)的cDNA。
NS基因重组质粒pDZ-B5-NS-mApple的构建
重组质粒pDZ-B5-NS-mApple的构建示意图如图1所示。
NS-mApple片段序列如SEQ ID NO.1所示：首端限制性内切酶BsmBI的保护碱基及其识别位点(第1-21位)、病毒NS节段3’端非编码区序列(第22-47位)、病毒NS1节段编码区序列(不含终止子)(第48-698位)、Linker(GSGG)序列(第699-710位)、mApple荧光报告基因序列(不含终止子)(第711-1418位)、PTV-1病毒2A肽段编码序列(第1419-1484位)、病毒NEP节编码区序列(第1485-1850位)、病毒NS节段5’非编码区序列(第1851-1876位)、末端限制性内切酶Bsm I的保护碱基及其识别位点(第1877-1897位)。NS-mApple测序正确后通过同源重组试剂盒(One step Cloning Kit，购于诺唯赞公司)，然后连接在经BsmB I(购于NEB公司)酶切后的pDZ-B5质粒上，获得pDZ-B5-NS-mApple重组质粒。
NS-mApple片段(SEQ ID NO.1)：
CGACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATACCAACACTATGCTAAGCTTTCAGGTAGACTGTTTTCTTTGGTATGTCCGCAAACGATTCGCAGACCAAGAACTGGGTGATGCCCCTTTCCTTGACCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCTTTAAGAGGAAGAGGCACCACTCTTGGTCTGAGCATCGAAGCAGCTACTCGTGAGGGAAAGCAGATAGTGAAGCGAATTCTGAAGGAAGAGTCTGATGAGGCACTTAAAATGACTGTTGCTTCAGGTCCGTCTTCACGCTACCTAACTGATATGACTCTTGAAGAGATGTCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAACGGAAAGTGGCAGGTCCACTTTGCATCAAAATGGACCAGGCAATAATGGATAAAAACATCATATTGAAAGCAAACTTCAGTGTAATTTTCAACCGGCTGGAAGCTCTAATACTACTTCGAGCTTTCACAGAAGAAGGAGCAATTGTGGGAGAAATCTCACCGTTACCTTCTTTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGGCTTGAATGGAATAATAACACAGTTCGGGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAACAGTGATGAGGATGGGAGACCTTCACTCCCTCCAAAGGGATCCGGTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGCCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGTCTAC ATTAAGCACCCAGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAGGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCATTATTCACGTTAACCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGTGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCGAGGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGAGCGAGATCAAGAAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGCCGCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACATCGTCGACATCAAGTTGGACATCGTGTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGATACCAACACTATGCTAAGTTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGGCTTGAATGGAATAATAACACAGTTCGGGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAACAGTGATGAGGATGGGAGACCTTCACTCCCTCCAAAGTAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTGGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGCGACATAGACTGAAGATTACAGAAAATAGCTTCGAACAGATAACGTTTATGCAAGCCTTACAACTATTGCTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTGATGATAAAAAACACCCTTGTTTCTACTAATAACCCGGCGGCCCAAAAT。
NS-mApple蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MDTNTMLSFQVDCFLWYVRKRFADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGTTLGLSIEAATREGKQIVKRILKEESDEALKMTVASGPSSRYLTDMTLEEMSRDWFMLMPKRKVAGPLCIKMDQAIMDKNIILKANFSVIFNRLEALILLRAFTEEGAIVGEISPLPSFPGHTDEDVKNAIGVLIGGLEWNNNTVRVSETLQRFAWRNSDEDGRPSLPPKGSGGMVSKGEENNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEAFQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKVYIKHPADIPDYFKLSFPEGFRWERVMNFEDGGIIHVNQDSSLQDGVFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASEERMYPEDGALKSEIKKRLKLKDGGHYAAEVKTTYKAKKPVQLPGAYIVDIKLDIVSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDTNTMLSFQDILMRMSKMQLGSSSEGLNGIITQFGSLKLYRDSLGETVMRMGDLHSLQSRNGKWREQLGQKFEEIRWLIEEVRHRLKITENSFEQITFMQALQLLLEVEQEIRTFSFQLI*(SEQ ID NO.2)。
H5N8-mApple重组病毒的构建
利用反向遗传学技术拯救携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒H5N8-mApple。步骤如下：
取293T细胞平铺至用多聚赖氨酸包被的6孔板内，用含有10％胎牛血清(购于Gibco公司)的DMEM培养基(购于Gibco公司)培养至细胞密度80％-90％。将携带mApple荧光报告基因的流感反向遗传系统所需的八个质粒pDZ-B5-HA、pDZ-B5-NA、pDZ-B5-M、pDZ-B5-PA、pDZ-B5-PB1、pDZ-B5-PB2、pDZ-B5-NP和pDZ-B5-NS-mApple共同转染6孔板中，转染后6h，弃去培养液并更换为含0.35μg/ml TPCK胰酶，终浓度为0.2％BSA的Opti-MEM培养基。培养48h后反复冻融3次收集细胞液，接种9-11日龄鸡胚。48h后收取HA阳性鸡胚尿囊液，即得H5N8-mApple重组病毒。
H5N8-mApple重组病毒的传代
将上述方法中得到的HA阳性鸡胚尿囊液(即H5N8-mApple重组病毒)用PBS稀释1000倍后，取200μL尿囊液接种于9-11日龄的SPF鸡胚，37℃孵育48h后，收集HA阳性的鸡胚尿囊液，保存于-80℃冰箱，重复操作四次。
其中，以HA阳性鸡胚尿囊液中的H5N8-mApple重组病毒为P1代，经9-11日龄的SPF鸡胚传代后获得的H5N8-mApple重组病毒依次命名为P2-P4代。
H5N8-mApple重组病毒的鉴定
(1)mApple荧光报告基因的鉴定
使用RNA快速抽提试剂盒(购于飞捷公司)抽提上述方法中得到的P1-P4代的H5N8-mApple重组病毒的总RNA，使用随机引物经反转录获得cDNA。使用mApple荧光报告基因特异性引物(mApple-F和mApple-R)，以野生型H5N8病毒为对照(记为：WT)进行PCR扩增后，送生工生物工程公司测序，并结合电泳以确定是否存在mApple荧光报告基因。
mApple-F和mApple-R的核苷酸序列如下：
mApple-F：AAGGGATCCGGTGGAATGGTGAGCAAGGG；
mApple-R：TGAAGTTGGTGGCGCCGGATCCCTTGTACAGCTCG。
鉴定结果如图2所示。
构建得到的P1-P4代的H5N8-mApple重组病毒均存在mApple荧光报告基因。这也说明构建得到的H5N8-mApple重组病毒具有一定的稳定性，能够稳定传代。经测序，序列显示为正确。
(2)H5N8-mApple重组病毒的Western-Blot检测
H5N8-mApple重组病毒以MOI为1.0感染MDCK细胞，37℃培养箱孵育1h后，弃掉病毒液，更换为含0.25μg/mL TPCK胰酶和终浓度为0.1％BSA的DMEM维持液。感染12h后，弃掉孔内液体，加入500μL RIPA裂解缓冲液处理细胞，收集蛋白样品后，加入5×SDS上样缓冲液煮沸10分钟，变性后的样品经SDS-PAGE(使用10％胶体)后转移到硝化纤维素膜上，加入5％脱脂奶粉封闭1h，TBST洗膜3次后分别与兔抗NS1蛋白抗体(购自Thermo公司)和鼠抗GAPDH蛋白抗体(购自Abbkine公司)4℃孵育过夜；再经TBST洗膜3次后分别与HRP处理的山羊抗兔二抗(购自TransGen Biotech公司)和山羊抗小鼠二抗(购自Abbkine公司)室温孵育1h。TBST洗3次后膜经HRP显色液(购自Millipore公司)避光处理后使用红外成像系统成像。以野生型H5N8病毒为对照(记为：WT)。
检测结果如图3所示。
H5N8-mApple重组病毒和亲本野生型H5N8病毒感染MDCK细胞后，NS1蛋白都能正常表达，H5N8-mApple重组病毒NS1蛋白与mApple荧光报告蛋白以融合蛋白的形式表达。
H5N8-mApple重组病毒在MDCK细胞中的生长动力学检测
(1)组织半数感染量(TCID50)的检测
MDCK细胞铺96孔板，采用10-4-10-9稀释度的H5N8-mApple重组病毒液(P1代)感染96孔板中生长状态良好的MDCK细胞。以接种不含病毒的空白培养基作为阴性对照。37℃培养箱孵育1h后，用PBS清洗两遍细胞，更换为含0.25μg/ml TPCK胰酶、终浓度为0.2％BSA的DMEM培养基处理，37℃培养箱孵育48h后收集细胞上清，进行血凝效价测定，并按照Reed-Muench氏法计算TCID50。
以10-4稀释度接种的细胞孔全部出现病变(8/8)；10-5稀释度接种的细胞出现6孔病变(6/8)；10-6稀释度接种的细胞出现2孔病变(2/8)；10-7～10-9稀释度接种的细胞孔没有病变。经Reed-Muench法计算，P1代H5N8-mApple重组病毒的TCID50为10-5.5/0.1mL。
(2)生长曲线的检测
在12孔板中生长良好的MDCK细胞在37℃感染不同MOI(MOI＝0.1、MOI＝0.01、MOI＝0.001)H5N8-mApple重组病毒(P1代)，37℃培养箱孵育1h后使用PBS清洗两遍，更换为含0.25μg/ml TPCK胰酶、终浓度为0.2％BSA的DMEM培养基处理，分别在12、24、36、48、60、72小时收集培养物上清，采用TCID50法测定重组病毒在MDCK细胞上的生长曲线。以野生型H5N8病毒为对照。
检测结果如图4和5所示。
相比亲本野生型H5N8病毒，H5N8-mApple重组病毒在MDCK细胞中复制减弱。以不同MOI感染MDCK细胞显示，MOI越大，其mApple荧光强度越强(图4)；H5N8-mApple重组病毒和亲本野生型H5N8病毒在MDCK细胞中的生长动力学有显著差异(图5)。
H5N8-mApple重组病毒不同鸡胚半数感染量(EID50)感染剂量感染SPF鸡的病毒载量及体内成像
实验方法如下：
将病毒液稀释至每200μL PBS中含103EID50、104EID50、105EID50、106EID50的H5N8-mApple重组病毒，取200μL稀释好的H5N8-mApple重组病毒液(P1代)滴鼻感染3周龄SPF鸡，作为H5N8-mApple组；以104EID50/200μL野生型H5N8病毒滴鼻感染3周龄SPF鸡，作为H5N8组；以200μL PBS溶液滴鼻3周龄SPF鸡，作为对照组。每天监测三组SPF鸡的存活情况，并在感染后第2-4天采集各组SPF鸡的口咽拭子及泄殖腔拭子，采用EID50法接种9-11日龄SPF鸡胚测定拭子中的病毒滴度；在感染后3天取鸡脑、肺、气管，采用EID50测定其病毒载量；通过IVISLumina LT(Series III)活体成像仪分别对感染后第3、5、7天不同组的SPF鸡及其肺脏进行成像。
检测结果如图6和7所示。
H5N8-mApple重组病毒的致病性相比于野生型H5N8病毒有所下降，105EID50/200μL攻毒剂量下，第3天死亡率20％，在第4天鸡全部死亡；106EID50/200μL攻毒剂量下，鸡在第3天全部死亡；H5N8-mApple重组病毒可在肺部、脑部、气管进行高效复制(尤其是肺部)，但病毒滴度低于野生型H5N8病毒。如图6所示。
H5N8-mApple重组病毒可在肺部高效复制，并显示荧光；肺部的荧光强度随着mApple-H5N8重组病毒攻毒剂量的增加而增加；同一剂量感染SPF鸡时，感染后第5天比第3、7天体内检测的荧光强度强。如图7所示。
H5N8-mApple重组病毒感染SPF鸡后肺脏中免疫细胞的感染情况
实验方法如下：
将H5N8-mApple重组病毒液(P1代)用PBS分别稀释至每200μL PBS中含104EID50的H5N8-mApple重组病毒，经鼻感染3周龄SPF鸡，在感染后的第3天和第5天取鸡肺脏消化分离得到细胞悬液，取细胞(1×106)与APC标记的CD45抗体(购自SouthernBiotech)避光孵育30min，PBS清洗后，使用流式细胞仪(购自Beckman Coulter公司)分析染色细胞，记为感染组(Infection group)。对照组(Control group)为经PBS处理的SPF鸡制备的肺脏单细胞悬液作相同染色处理。
检测结果如图8所示。
与对照组相比(0.58％～0.95％)，H5N8-mApple重组病毒感染SPF鸡后第3天，在肺脏免疫细胞中检测到重组病毒荧光蛋白mApple的显著表达，免疫细胞感染的比例为4.55％～18.2％(CD45+mApple+)。此外，感染后第5天仍能检测到被重组病毒感染的免疫细胞(1.24％～3.7％)，但与第3天相比显著性下降(P<0.05)。
H5N8-mApple重组病毒体外感染外周血单个核细胞
实验方法如下：
采集SPF鸡颈静脉血，使用鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒(购于天津灏洋生物公司)分离得到鸡外周血单核(PBMC)细胞悬液，吸取细胞悬液与0.08％台盼蓝以1:1比例混匀后进行计数。分别以MOI＝5、10、15mApple-H5N8重组病毒感染PBMC细胞(细胞数量为2×106)，39℃孵育1h，其间轻弹管壁，使病毒与细胞充分接触。PBS清洗两次后使用含0.25μg/mL TPCK胰酶的1640完全培养基重悬细胞，于39℃培养箱中继续孵育6h。取H5N8-mApple重组病毒感染后的PBMC细胞(细胞数量为2×106)分别与FITC标记的小鼠抗KUL01单克隆抗体(购自SouthernBiotech)和FITC标记的小鼠抗NP单克隆抗体(购自Abcam公司)(含0.02％saponin)避光4℃孵育30分钟，PBS洗两次后，用流式细胞仪分析(购自Beckman Coulter公司)染色细胞，记为感染组(Infection group)。对照组(Control group)为经PBS处理的PBMC细胞作相同处理。
检测结果如图9、10、11所示。
H5N8-mApple重组病毒体外感染SPF鸡PBMC细胞中，NP阳性率与mApple阳性率的相关系数为r>0.5(r＝0.7594)，统计学分析P值小于0.05(P＝0.0176)，表明两者比例存在显著相关性。因此，mApple可作为检测重组病毒感染的指标。在MOI为10的时候感染效率最佳，mApple阳性细胞的比例为11.8％～13.6％(图9，图10)。此外，在H5N8-mApple重组病毒体外感染PBMC实验中，单核/巨噬细胞(KUL01+mApple+)的感染比例较高，为55.1％～80.4％(图11)。这表明鸡单核/巨噬细胞也是禽流感病毒感染的重要靶标细胞。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种NS蛋白，其特征在于，所述NS蛋白的氨基酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列、mApple荧光报告基因的氨基酸序列、SEQ ID NO.2第480-600位所示氨基酸序列。
2.一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述重组H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA由如1)和2)所示的8个独立的RNA片段组成；
1)与野生型H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码HA蛋白的RNA片段1、编码NA蛋白的RNA片段2、编码M蛋白的RNA片段3、编码PA蛋白的RNA片段4、编码PB1蛋白的RNA片段5、编码PB2蛋白的RNA片段6以及编码NP蛋白的RNA片段7；
2)编码权利要求1中所述NS蛋白的RNA片段8。
3.根据权利要求2所述的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述野生型H5N8亚型禽流感病毒包括H5N8亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/JM01/2020株。
4.根据权利要求2所述的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第222至457位所示；
优选地，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第711至1418位所示。
5.如A1至A6任一项所述的生物材料，其特征在于，
A1：编码权利要求1所述NS蛋白的核酸分子；
A2：含有A1中所述核酸分子的表达盒；
A3：含有A1中所述核酸分子的重组载体；
A4：含有A1中所述核酸分子的重组微生物；
A5：含有A1中所述核酸分子的转基因细胞系；
A6：含有A1中所述核酸分子的重组病毒。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，A1中所述核酸分子如B1至B3任一项所示；
B1：所述核酸分子的核苷酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.1第1-710位所示核苷酸序列、编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列、SEQ ID NO.1第1419至1876位所示核苷酸序列；
B2：与B1中所述的核酸分子杂交且编码相同蛋白的核酸分子；
B3：与B1或B2中所述的核酸分子具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的核酸分子。
7.权利要求2至4任一项所述的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将能够表达权利要求2至4任一项所述的8个RNA片段对应的cDNA片段的重组表达载体组合转染细胞，将培养后获得的细胞液接种鸡胚，培养获得所述携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述细胞包括哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38、HL-8或Hela细胞。
9.C1至C7任一项在D1或D2中的应用，其特征在于，
C1：权利要求1所述的NS蛋白；
C2：权利要求2至4任一项所述的携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒；
C3：权利要求5或6所述的生物材料；
C4：权利要求7或8所述的构建方法；
D1：制备筛选抗H5N8亚型禽流感病毒的细胞模型或动物模型；
D2：制备研究H5N8亚型禽流感病毒感染机制的产品。
10.一种基于重组H5N8亚型禽流感病毒的禽类动物感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2至4任一项所述的携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒通过鼻腔接种到禽类动物体内，即得禽类动物感染模型。
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