WO2012059217A1 - Vecteurs derives de densovirus pour le transfert de gene chez l'insecte - Google Patents

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WO2012059217A1
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vector
recombinant
particles
nucleotide sequence
densovirus
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Application number
PCT/EP2011/005516
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Mylène OGLIASTRO
Aurélie PERRIN
Max Bergoin
François COUSSERANS
Philippe Fournier
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Institut National De Recherche Agronomique
Universite De Montpellier
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    • C12N2750/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/75—Vector systems having a special element relevant for transcription from invertebrates

Definitions

  • the present invention relates to methods for producing non-replicating recombinant Junonia coenia densoviruses for transferring a gene encoding a toxin into an insect and their use in the control of insect pests of culture.
  • Densoviruses are pathogenic viruses capable of autonomous replication and belonging to the parvovirus family.
  • the densovirus genome encapsidated in a non-enveloped icosahedral capsid, consists of a linear single-stranded DNA approximately 6 kilobases in length and comprising two regions of coding sequences.
  • One of these coding regions comprises a 5 'open reading frame (ORF1) encoding the four capsid (VP) proteins on one strand.
  • the other coding region comprises three open reading frames ORF2, ORF3 and ORF4 5 'on the complementary strand and encoding the nonstructural proteins (NS) of the densovirus.
  • ITRs inverted repeat terminal sequences
  • Densoviruses have the interesting feature of being pathogenic only with regard to invertebrates and especially insects and crustaceans. It has not been established pathogenicity in mammals and especially humans. The use of such densoviruses to control crop pests is therefore of great interest. This interest was confirmed by the possibility of inserting the genome of densovirus into bacterial plasmids, because of their small size, thus favoring genetic manipulation as well as the production of recombinant densoviruses.
  • Junonia coenia densoviruses have the particularity of benefiting from a host spectrum extended to several species of Lepidoptera, notably Agla ⁇ s urticae L. (Nymphalidae), Lymantria dispar L. (Lymantriidae), Bombyx mori L. (Bombyco ⁇ dae). ), Mamestraoleracea, M. brassicae L. (Noctuidae), Spodoptera exigua, S. littoralis, S. frugiperda (Noctuidae).
  • the recombinant JcDNV particles according to the invention can not replicate in the environment, but they make it possible to combat insect pests of culture, and in particular lepidopterans, by the expression of a toxin in the cells of said insects after infection.
  • Figure 1 Constructs for the production of recombinant and non-replicating JcDNV particles.
  • a first subject of the invention relates to a vector, which vector is derived from the Junonia Coenia densovirus genome, comprising a nucleotide sequence decomposing as follows:
  • a 5' inverted terminal repeat (ITR) nucleotide sequence comprising at least nucleotides 1 to 149 of the sequence SEQ ID No. 1, the length of said 5 'ITR sequence being less than or equal to at 259 nucleotides; (ii) centrally, a nucleotide sequence operably linked to a promoter, said nucleotide sequence encoding a toxin; and (iii) at the 3 'position, a 3' inverted terminal repeat (ITR) nucleotide sequence comprising at least nucleotides 369 to 518 of the sequence SEQ ID NO: 3, the length of said 3 'ITR sequence being less than or equal to 259 nucleotides, preferably said 3 'ITR nucleotide sequence is complementary to the 5' ITR nucleotide sequence;
  • Said vector does not comprise other viral nucleotide sequences of Junonia coenia densovirus than the ITR sequences according to (i) and (iii).
  • vector means any vehicle capable of facilitating the transfer of a nucleotide sequence into a cell, preferably an insect cell.
  • the vectors according to the invention include, without limitation, the plasmids, cosmids, phagemids or any other vehicle derived from viral or bacterial sources that have been manipulated for the insertion or incorporation of a nucleotide sequence, for example, and without limitation, baculovirus-type vectors.
  • the vectors may include selection markers so as to allow the identification of the cells having integrated said vectors.
  • the vectors according to the invention are plasmid vectors, also called plasmids.
  • Plasmids have been widely described in the prior art and are well known to those skilled in the art (see, for example, SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). By way of examples, mention may be made of the most commonly used plasmids such as pBR322, pUC18, pUC19, pRC / CMV, SV40, and pBlueScript. Plasmids can be engineered by the use of restriction enzymes and ligation reactions to remove or add specific DNA fragments.
  • the plasmids in which the nucleotide sequences are inserted are in the form of a linear or circular single or double-stranded DNA.
  • the plasmids can be delivered to the cells by transformation, according to the method described below.
  • the vector derived Junonia coenia densovirus can be called "toxic vector" in that it carries a nucleotide sequence that encodes a term-expressed toxin in the infected insect cell.
  • nucleotide sequence refers to a DNA sequence (for example a cDNA or genomic or synthetic DNA) or to an RNA sequence (for example a messenger RNA or synthetic RNA), as well as DNA or RNA analogs containing unnatural nucleotide analogues, unnatural internucleotide linkages, or both.
  • said nucleotide sequence is a DNA sequence.
  • the nucleotide sequences may have any topological conformation, such as linear or circular.
  • ITRs inverted repeated terminal sequences
  • ITRs means sequences with a hairpin structure located at the 5 'and 3' ends of the Junonia coenia densovirus genome ( respectively SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3). These ITR sequences with a length of 518 nucleotides are known for their involvement in the phenomenon of encapsidation of the viral genome as well as for their role in the replication of the viral genome.
  • the ITRs sequences according to the invention have the particularity of having been partially deleted.
  • the minimal sequences of ITRs of the vector according to the invention thus retain their function of encapsidation of the genome in the structural proteins of the capsid.
  • the absence of any other viral sequences on the vector prevents replication of the vector autonomously.
  • the 5 'ITR nucleotide sequence does not comprise more than 225 nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, as examples not more than 200 or 175 nucleotides, and more preferably not more than 160 nucleotides. of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the 5 'ITR sequence consists of nucleotides 1 to 149 of the sequence SEQ ID No. 1 (SEQ ID No. 2).
  • the 5 'ITR nucleotide sequence does not comprise more than 225 nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, as examples not more than 200 or 175 nucleotides, and more preferably not more than 160 nucleotides. of the sequence SEQ ID No. 3.
  • the 3 'ITR sequence consists of nucleotides 369 to 518 of the sequence SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 4).
  • toxin means a molecule exhibiting a toxic activity on a cell, which toxic activity may cause cell death but also a disruption of one or more cellular functions, which cellular disturbances are likely to cause an organism to be delayed. growth or death of said organism.
  • organism refers to any insect infected with recombinant and non-replicating JcDNV particles.
  • a toxin according to the invention may be a vector polypeptide of a toxicity in the cell in which it is expressed.
  • This toxicity causes in particular harmful effects such as destruction of the cell, its components or its functions.
  • polypeptides known for their toxic activity with regard to insects, and especially lepidopterans such as toxic polypeptides derived from the venom of various animals (venom neurotoxin).
  • toxic polypeptides produced by plants or microorganisms such as ricin or Cry toxins of Bacillus thuringiensis (Bt Kurstaki 1970, Bt aizawai 1989).
  • the neurotoxin of scorpion venom AaH-IT1 of protein sequence SEQ ID No. 5 will be used.
  • a toxin according to the invention may be a DNA or RNA nucleic acid molecule, such as RNA interference (RNAi), said molecule having an inhibitory activity against the expression of a specific gene. .
  • RNAi RNA interference
  • This activity results in particular in the rapid degradation of a targeted messenger RNA and leads to the extinction of the transcription of the targeted gene.
  • a toxin having a medium stability will be selected.
  • Medium stability means a toxin that degrades in less than 7 days, in less than a day or in less than 7 hours.
  • operably linked to a promoter is meant the link by which a promoter is located contiguous to a nucleotide sequence of interest for controlling the expression of said sequence.
  • the promoter is here operably linked to the nucleotide sequence coding for the toxin to control its expression.
  • promoters allowing the expression of a toxin in insect cells
  • ubiquitous promoters such as the Bombyx mori Actin A3 promoter of SEQ ID No. 6 or specific promoters can be used. of a fabric.
  • the promoter allowing the expression of a toxin of the vector according to the invention is an inducible promoter so as to be able to regulate the expression of said toxin by administering, simultaneously or otherwise, the vector and the inducer of said promoter.
  • the vector according to the invention does not comprise other viral nucleotide sequences of Junonia coenia densovirus than the ITR sequences according to (i) and (iii).
  • This vector is in fact constructed from a vector comprising the complete genome of the Junonia coenia of sequence SEQ ID No. 7.
  • the vector according to the invention does not comprise other nucleotide sequences of the sequence SEQ ID No. 7.
  • a second subject of the invention relates to a method for producing recombinant and non-replicating Junonia coenia (JcDNV) densovirus particles, said method comprising the following steps:
  • nucleotide sequences coding for the structural proteins VP1 (SEQ ID NO: 8), VP2 (SEQ ID NO: 9), VP3 (SEQ ID NO: 10) and VP4 (SEQ ID NO: 1) of the Junonia coenia or their derivatives, said nucleotide sequences being operably linked to a promoter, preferably the JcDNV P9 promoter, and
  • nucleotide sequences coding for the nonstructural proteins NSI (SEQ ID No. 13), NS2 (SEQ ID No. 14) and NS3 (SEQ ID No. 15) of the Junonia coenia densovirus or their derivatives, said nucleotide sequences being operably linked to a promoter, preferably the JcDNV P93 promoter,
  • the second vector according to the invention constitutes a complementation vector, also known as a "helper" vector, that is to say a vector carrying the various functions or elements missing from the carrier vector of the nucleotide sequence coding for a vector.
  • toxin such as the nucleotide sequences encoding the proteins necessary for encapsidation (NS) or the capsid-forming proteins (VP), necessary for the production of a recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particle.
  • Structural proteins also known as viral proteins (VPs) are the proteins of the capsid of the densovirus. They are 4 in number: VP1, VP2, VP3 and VP4, respectively having the following protein sequences: SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 and SEQ ID No. 11.
  • the promoter used for the expression of said structural proteins VP is the P9 promoter of Junonia coenia densovirus of sequence SEQ ID No. 12.
  • Nonstructural proteins also known as non-structural proteins (NS) participate in the replication and assembly of the VP structural proteins for capsid formation. These nonstructural proteins are three in number: NSI, NS2 and NS3, respectively having the following protein sequences: SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14 and SEQ ID No. 15.
  • the promoter used for the expression of said nonstructural NS proteins is the P93 promoter of JcDNV of sequence SEQ ID No. 16.
  • derivative is intended to mean a nucleotide sequence coding for a polypeptide having an identity percentage of at least 95% with the polypeptide sequence of a structural protein (VP) or non-structural protein (NS) of Junonia coenia densovirus such as previously defined.
  • VP structural protein
  • NS non-structural protein
  • percentage identity between two polypeptide sequences is meant the percentage of identical amino acids, between two sequences to be compared, obtained with the best possible alignment of said sequences. This percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed throughout the length of the amino acid sequences.
  • “best possible alignment or optimal alignment” is meant alignment to obtain the highest percentage of identity. Sequence comparisons between two amino acid sequences are usually performed by comparing said sequences after they have been aligned in the best possible alignment; the comparison is then performed on comparison segments so as to identify and compare regions of similarity.
  • the best possible alignment for comparison can be achieved using the global homology algorithm developed by SMITH and WATERMAN ⁇ Ad. App. Math., Vol.2, p: 482, 1981), using the local homology algorithm developed by NEDDLEMAN and WUNSCH (J. Mol Biol., Vol.48, p: 443, 1970), using the similarity method developed by PEARSON and LIPMAN ⁇ Proc. Natl. Acd. Sci.
  • the BLAST program will preferably be used with the BLOSUM matrix 62 or the PAM matrix 30.
  • the percentage of identity is determined by comparing the two optimally aligned sequences, said sequences may comprise additions or deletions with respect to the reference sequence so as to obtain the best possible alignment between these two sequences.
  • the identity percentage is calculated by determining the number of identical positions between the two sequences, dividing the number obtained by the total number of positions compared and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences. .
  • the 5 'inverted terminal repeat (ITR) sequence comprising at least nucleotides 1 to 149 of the sequence SEQ ID No. 1, the length of said 5' ITR sequence being less than or equal to 259 nucleotides. is not included in any complementation vector as defined above.
  • the inverted terminal repeat nucleotide sequence (ITR) at the 3 'position comprising at least the nucleotides 369 to 518 of the sequence SEQ ID No. 3, the length of said ITR sequence at 3' being less than or equal to 259. nucleotides, is not included in any complementation vector.
  • Two vectors according to the invention do not share sequences of more than 100 base pairs, more than 50 base pairs or more than 25 base pairs that share more than 50% identity, 30% identity or 20 base pairs. % identity.
  • transformation is meant any method for the transfer of a gene, preferably in an insect cell.
  • the transformation of the insect cells can be carried out using methods known to those skilled in the art such as the use of transfection or transduction.
  • transfection is used to transfer the nucleotide sequences into the insect cells.
  • transfection is meant the introduction of DNA into a eukaryotic cell.
  • the transfection of the cells can be carried out by the use of calcium phosphate, liposomes or lipid vectors such as Lipofectamine® (INVITROGEN), highly branched polycationic agents.
  • the harvesting of the recombinant and non-replicating JcDNV particles can be carried out according to the following protocol, said protocol not being limiting: four days post-transfection, the cells and the culture supernatants were harvested to undergo three cycles of freezing / thawing followed by ultrasound treatment. Subsequently, the supernatants are clarified for 10 minutes at 5000 g, and then the virus particles are concentrated by ultracentrifugation at 175,000 g in a Beckman SW41ti rotor for 2 hours at 4 ° C. The viral particles are resuspended in PBS.
  • a third subject of the invention relates to an insect cell comprising:
  • Said insect cell is in particular used for the production of recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles according to the method described previously.
  • An insect cell according to the invention has the characteristics of being culturable and transformable. Said cell is also capable, after transformation with the vectors according to the invention, of replicating the recombinant densovirus, but also of expressing the viral (VP) and non-structural (NS) proteins to produce recombinant Junonia coenia densovirus particles and non-replicative.
  • VP viral
  • NS non-structural
  • insect cells As examples of insect cells, the following cells can be used:
  • culture conditions of the insect cells As examples of culture conditions of the insect cells, the following conditions can be used:
  • a fourth subject of the invention relates to a kit for producing recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles according to the method defined previously comprising:
  • the kit for producing recombinant and non-replicating JcDNV particles of the present invention comprises:
  • the kit for producing recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles further comprises insect cells as defined above.
  • a fifth subject of the invention relates to a recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particle obtainable according to the method defined above and consisting of a capsid containing a nucleotide sequence which comprises:
  • nucleotide sequence operably linked to a promoter, said nucleotide sequence encoding a toxin; and (iii) at the 3 'position, an inverted repeat terminal nucleotide sequence (ITR) at 3' as defined above;
  • recombinant Junonia coenia densovirus particle means a viral particle produced from a modified densovirus genome.
  • the genome of the recombinant Junonia coenia densovirus according to the invention was modified by the partial deletion of the inverted repeat terminal sequences (ITRs) in 5 'and 3' to maintain at least the encapsidation function of these sequences, as well as by the deletion of all the viral sequences of JcDNV between the two ITRs sequences.
  • ITRs inverted repeat terminal sequences
  • a nucleotide sequence coding for a toxin has also been inserted between partially deleted ITR sequences.
  • recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particle means a recombinant Junonia coenia densovirus viral particle that does not have the capacity to replicate its genome for the purpose of producing densoviruses from its genetic material alone or from that of the host cell.
  • the recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles are produced in the method described above from the carrier vector of the nucleotide sequence coding for a toxin with the aid of the carrier complementing vector (s). viral sequences necessary for encapsidation and viral replication. Thus, in the absence of these complementation vectors expressing the structural and nonstructural proteins, the recombinant Junonia coenia densovirus particles can not replicate.
  • a sixth object of the invention relates to a use of recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles as defined above as an agent for controlling Lepidoptera.
  • the genome of the recombinant and non-replicating JcDNV particles according to the invention comprises a nucleotide sequence operably linked to a promoter, said nucleotide sequence coding for a toxin.
  • Said toxin may be expressed in infected insect cells and is the means of controlling these particles of densovirus against lepidopteran pests culture.
  • a seventh subject of the invention relates to a composition comprising the recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles as described above.
  • said composition according to the invention also comprises a promoter inducer operably linked to the nucleotide sequence coding for a toxin when said promoter is an inducible promoter.
  • An eighth object of the invention relates to a use of a composition as described above as a means of combating Lepidoptera.
  • a ninth object of the invention relates to a method for treating plants, said method comprising a step of spreading recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles as described above on plant cultures.
  • the plants treated according to said treatment method are rice, corn, cotton, soybean, sorghum, sugar cane, tomato, pepper, alfalfa.
  • the sequence encoding the toxin is under the control of an inducible promoter and the plant treatment method according to the invention comprises a step of spreading the compound inducing said promoter simultaneously, before or after the step of spreading recombinant and non-replicating Junonia coenia densovirus particles as previously described.
  • the complementation vectors carry the structural genes (VPs) under the control of a promoter and / or non-structural genes (NS) also under the control of a promoter without however carrying the ITRs sequences.
  • VPs structural genes
  • NS non-structural genes
  • plasmid pJA The plasmid carrying the NS and VP genes without the ITRs sequences, named plasmid pJA, is derived from the plasmid pBRJ-H by deletion of the inverted terminal repeat regions (ITRs) at the Fspl site (Li, 1993, PhD Thesis of the University Jardin II pp.124).
  • ITRs inverted terminal repeat regions
  • a deletion of the structural genes was carried out by digestion of the plasmid pJA with the BamHI and HpaI restriction enzymes (position 38 bp at 2162 bp) and then by religation with T4 DNA ligase (INVITROGEN, USA), thus generating the plasmid pJAAVP ( Figure 1.a).
  • a plasmid carrying only the structural genes was obtained by deleting the nonstructural genes (NS) by digesting the plasmid pJA with the restriction enzymes Bsml and KpnI (position 2732 bp at 521 1 bp). ) generating the plasmid pJAANS ( Figure 1.b).
  • ITRs inverted terminal repeat regions
  • constructs carrying a recombinant genome have been developed to determine the minimum ITR sequences necessary for encapsidation. Initially, constructions carrying only the ITRs are obtained by digestion of the plasmid pBRJ-H at the BstEll sites. (position 337 bp at 6028 bp) or BamHI (position 446 bp at 5920 bp), thus deleting the part of the viral genome coding for NS and VP.
  • a first recombinant vector was constructed by cloning an A3GFP expression cassette containing the gene encoding the "Green Fluorescent Protein” (GFP) under control of the Actin promoter of Bombyx mori A3 (SEQ ID NO: 6 ) at the restriction sites of the BstEII and BamHI enzymes of plasmid pBRJ-H whose viral genome has been deleted.
  • the A3GFP expression cassette used is derived from plasmid pASA3-GFP, lepidopteran expression vector (Bossin, 1998, Thesis of adjoin II University, pp. 240) ( Figure 1.c).
  • the vector generated thus constitutes one of the recombinant genomes to be encapsidated.
  • the corresponding constructs are named pITR-A3GFP-2? StEII and pITR-A3GFP-5a / wHI.
  • the recombinant plasmid vector containing the gene coding for the red fluorescent protein, DsRed2 was constructed from the pITR-A3GFP-.Z3 ⁇ 4tEII vector by deletion of the GFP reporter gene at the BamHI and NotI restriction sites.
  • the DsRed2 gene was amplified, from the plasmid pDsRed2 (CLONTECH, USA), by PCR using primers integrating the BamHI and NotI restriction sites and then inserted in place of the GFP gene. This construction was named pITR-A3DsRed2-55tEII.
  • the recombinant plasmid vector containing the gene coding for the scorpion neurotoxin Androctonus australis (AaH-IT1) (SEQ ID No. 5) obtained from the plasmid pcD-Tox (Bougis et al., 1989) was constructed according to the same method only for the vector pITR-A3DsRed2-i? s EII.
  • the generated vector has been named pITR-A3 AaH-ITl -IstEII.
  • the recombinant JcDNV particles were produced by multi-transfection into insect cells.
  • A3AaH-IT1 at a ratio of 1: 1 or 1: 2;
  • Tri-transfection with the pJAANS complementation vectors carrying the VP and pJAAVP genes carrying the NS genes as well as with a recombinant encapsidation vector pITR-A3GFP or pITR-A3DsRed2 or pITR-A3AaH-IT1, in a ratio of 1: 1: 1 or 1: 1: 2.
  • Transfection efficiency was determined by fluorescence microscopic observation of transfected Ld cells with the pITR-A3GFP construct and shown to be at most 30%.
  • part of the previous suspension is deposited on a microscope to carry out negative staining (phosphotungstic acid 2%, pH 7.0).
  • a stage of visualization in Transmission Electron Microscopy (TEM) made it possible to confirm the production of viral particles by the cells.
  • the viral DNA was extracted from the viral particles and then digested with DpnI.
  • a PCR amplification step was subsequently performed on the digested DNAs using primers specific for the A3GFP expression cassette, sense primers: 5'-ATTTACTAAggTgTgCTCgAAC AgT-3 '(SEQ ID NO: 17) and primer antisense: 5'-TACTTgTAC AgCTCgTCCATgCCg-3 '(SEQ ID NO: 18).
  • the results show a specific amplification from DNA extracted from viral particles and no amplification in plasmid control (pASA3-GFP) digested with DpnI.
  • the virus particle suspensions obtained in Example 3 were used to infect Ld cells.
  • Ld cells cultured in complete TC100 medium, were prepared in 96-well plate so as to be 80% confluent at 24 hours of culture. The next day, the cell culture medium was removed and 50 ⁇ of purified virus particles were added. The cells are incubated for 1 h at 26 ° C with the inoculum. Subsequently, complete TC100 medium was added and the cells were kept in an oven at 26 ° C until observation.
  • Example 5 In order to confirm the non-replicative nature of the isolated virus particles, the culture supernatant of the cells infected in Example 5 was harvested and subjected to the same protocol as that of Example 3 (clarification, ultracentrifugation and resuspension of the pellet in PBS ). One volume of this suspension was used to infect new Ld cells with a protocol identical to that used in Example 4. In the same way, the fluorescence of Ld cells was followed regularly after infection.
  • the haemocytes were taken at a false paw with a 0.2 mm diameter needle.
  • the haemolymph of each larva was recovered and cultured in 96-well plate with 100 ⁇ l of culture medium TC100, 1% antibiotics and 0.03 ⁇ PTU (N-phenylthiourea). Haemocytes were observed at 4 h post-culture under a fluorescence microscope.
  • the haemocytes of the GFP, DsRed, positive and negative control groups were observed under a fluorescence microscope as early as 4 hours after culturing (6 days PI). A fluorescent green and red signal was observed in some haemocytes of the larvae injected with the GFP and DsRed coding particles, respectively. No fluorescence was observed in the positive and negative controls.
  • the tissues were mounted on slides and observed under a fluorescence microscope. A green and red specific fluorescence is observed in the tracheas of the larvae infected respectively by the recombinant particles GFP and DsRed. No specific fluorescence was observed in the tracheal larvae of the positive and negative control groups.
  • Larvae infected with the recombinant particles were sacrificed at 6 days post-infection. The remaining portion of the larvae stored at -20 ° C was milled in PBS. The supernatants were clarified for 10 minutes at 5000 g and then injected at 10 ⁇ into larvae of Spodoptera frugiperda moth larvae aged 7 days after hatching using a microinjector. After injection, the larvae were fed on an artificial medium and kept in an oven at 26 ° C. for 6 days.
  • the haemocytes were taken at the level of a false paw and the haemolymph of each larva was cultured in 96-well plate with 100 ⁇ l of culture medium TC100, 1% antibiotics and 0, 03 ⁇ PTU (N-phenylthiourea). Haemocytes were observed at 4 h post-culture under a fluorescence microscope.
  • the larvae After recovery of the haemocytes, the larvae were partially dissected so as to isolate the following different tissues: the intestine, the tracheas, the nervous ganglia and the epidermis. The different organs were observed directly under a fluorescence microscope.
  • the Baculovirus expression system is commonly used for the production of large quantities of recombinant proteins because of its ease of use and high level of expression.
  • the principle of producing non-replicating recombinant Densovirus particles in the Baculovirus expression system is based on:
  • JcDNV Junonia coenia Densovirus
  • VP structural
  • NS non-structural
  • Complementation expression vectors carry the structural genes (VPs) under the control of a promoter or non-structural genes (NS) also under the control of a promoter without however carrying the ITRs sequences.
  • VPs structural genes
  • NS non-structural genes
  • the expression vector carrying the NS genes without the ITRs sequences is obtained after PCR amplification of the NS sequences including the homologous P93 promoter, using primers integrating the NotI and XhoI restriction sites ( underlined sequences):
  • P93_NS_pFastBAC_F 5 '- AT AAgCggCCgTT ATTgTgACCTCgTTTgA-3' (SEQ ID NO: 19) and
  • NS_pBAC_R 5 '-CCgCTCgAgTT AA A ATgT AAT ATATTT ATT ATTC AAT AAA-
  • the fragment obtained was inserted at the NotI-XhoI sites of the multi-cloning site of the pFastBac TM 1 expression vector.
  • the expression of the nonstructural genes (NS) is made under the control of the homologous promoter P93.
  • the expression vector carrying the VP genes without the ITRs sequences was obtained after PCR amplification of the VP sequences, using primers integrating the NotI and XhoI restriction sites (underlined sequences):
  • the fragment obtained was inserted at the NotI-XhoI sites of the multi-cloning site of the pFastBac TM 1 expression vector.
  • the expression vector named pFastBac-ITR-A3GFP, carries the ITRs regions of JcDNV flanking the A3-GFP expression cassette. This construction derives from the plasmid pITR-A3GFP-i3 ⁇ 4tEIi already described. Thus the sequence including the ITRs regions and the expression cassette was amplified by PCR using primers integrating the EcoRI and XhoI sites (underlined sequences):
  • A3GFP_pFastBAC_F 5'-CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC -3 '(SEQ ID NO: 23) and
  • A3 GFP_pFastB AC_R 5'-CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg -3 '(SEQ ID NO: 24).
  • the resulting fragment was inserted at the EcoRI-XhoI sites of the multi-cloning site of the pFastBac TM 1 expression vector.
  • the expression vectors pFastBac-NS, pFastBac-VP and pFastBac-ITR-A3GFP were transformed into DH1OBac competent cells in order to generate the recombinant Bacmids (BAC-NS, BAC-VP and BAC-ITRA3GFP).
  • the amplification of recombinant Baculoviruses and the generation of high-titre viral stocks are made from low-level stocks by serial passage into insect cells.
  • the viral titer of each recombinant Baculovirus is also estimated by quantitative PCR and then confirmed by plate assay.
  • the high-titre recombinant Baculovirus stocks are used for multi-infected Sf9 insect cells.
  • Non-replicating recombinant Densovirus particles as well as Baculoviruses are produced during this infection.
  • DNVs particles Purification of the DNVs particles is done by heat. In fact, Baculoviruses are enveloped viruses and therefore not very resistant to heat, unlike Densoviruses, which are non-enveloped viruses. This purification process is used routinely by the GENETHON teams. After purification, the particles produced are characterized and validated according to the same method as previously used.

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Abstract

La présente invention porte sur un vecteur comprenant (i) en position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR), (ii) en position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine; et (iii) en position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR), ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii). La présente invention porte également sur une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs utilisant un tel vecteur. Finalement, la présente invention porte sur l'utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que produites selon la méthode précédemment définie en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.

Description

VECTEURS DERIVES DE DENSOVIRUS POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ
L'INSECTE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes de production de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs permettant le transfert d'un gène codant pour une toxine dans un insecte et leur utilisation dans la lutte contre les insectes ravageurs de culture.
ART ANTERIEUR
Les densovirus (DNV) sont des virus pathogènes capable de se répliquer de manière autonome et appartenant à la famille des parvovirus. Le génome des densovirus, encapsidé dans une capside icosahédrale non enveloppée, consiste en un ADN simple brin linéaire d'environ 6 kilobases de longueur et comprenant deux régions de séquences codantes. L'une de ces régions codantes comprend un cadre de lecture ouvert (ORF1) en 5' codant pour les quatre protéines de la capside (VP) sur un brin. L'autre région codante comprend trois cadres de lecture ouverts ORF2, ORF3 et ORF4 en 5' sur le brin complémentaire et codant pour les protéines non structurales (NS) du densovirus. Ces deux régions codantes sont délimitées aux extrémités 5' et 3' par des séquences terminales répétées inversées (ITRs) avec une structure en épingles à cheveux d'une longueur supérieure à 500 nucléotides et incluant les promoteurs responsables de l'expression des protéines VP et NS.
Les densovirus présentent la particularité intéressante de n'être pathogènes qu'à l'égard des invertébrés et notamment des insectes et crustacés. Il n'a en effet pas été établi de pathogénicité chez les mammifères et plus particulièrement les humains. L'utilisation de tels densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture présente donc un grand intérêt. Cet intérêt s'est vu confirmé par la possibilité d'insérer le génome de densovirus dans des plasmides bactériens, du fait de leur petite taille, favorisant de ce fait les manipulations génétiques ainsi que la production de densovirus recombinants.
Toutefois, la capacité des densovirus à se répliquer et se multiplier dans l'environnement présente un inconvénient dans l'utilisation de densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture.
Dans le but de pallier à cet inconvénient, les inventeurs ont mis au point une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants dénuées de toute capacité de réplication et exprimant en outre une toxine dans les cellules d'insectes infectées. Les densovirus de Junonia coenia (JcDNV) présentent la particularité de bénéficier d'un spectre d'hôte étendu à plusieurs espèces de lépidoptères, notamment Aglaïs urticae L. (Nymphalidae), Lymantria dispar L. (Lymantriidae), Bombyx mori L. (Bombycoïdae), Mamestraoleracea, M. brassicae L. (Noctuidae), Spodoptera exigua, S. littoralis , S. frugiperda (Noctuidae).
Les particules de JcDNV recombinants selon l'invention ne peuvent se répliquer dans l'environnement mais permettent de lutter contre les insectes ravageurs de culture, et notamment les lépidoptères, par l'expression d'une toxine dans les cellules desdits insectes après infection.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1. Constructions pour la production de particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un vecteur, lequel vecteur est dérivé du génome du densovirus Junonia Coenia, comprenant une séquence nucléotidique se décomposant comme suit :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides l à 149 de la séquence SEQ ID N°l, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ; (ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N°3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, de préférence ladite séquence nucléotidique ITR en 3' est complémentaire à la séquence nucléotidique ITR en 5';
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
On entend par « vecteur » tout véhicule capable de faciliter le transfert d'une séquence nucléotidique dans une cellule, de préférence une cellule d'insecte. De manière générale, les vecteurs selon l'invention incluent, sans limitation, les plasmides, cosmides, phagemides ou tout autre véhicule dérivé de sources virales ou bactériennes qui ont été manipulées pour l'insertion ou incorporation d'une séquence nucléotidique, par exemple, et sans limitation, des vecteurs de type baculovirus.
Par ailleurs, les vecteurs peuvent inclure des marqueurs de sélection de manière à permettre l'identification des cellules ayant bien intégré lesdits vecteurs.
De manière préférée, les vecteurs selon l'invention sont des vecteurs plasmidiques, également appelés plasmides. Les plasmides ont été largement décrits dans l'art antérieur et sont bien connus de l'Homme du métier (voir par exemple SANBROOK et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A titre d'exemples, on peut citer les plasmides les plus communément utilisés tels que pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, et pBlueScript. Les plasmides peuvent être conçus par l'utilisation d'enzymes de restriction et de réactions de ligation pour éliminer ou ajouter des fragments d'ADN spécifiques. Les plasmides dans lesquels sont insérées les séquences nucléotidiques sont sous forme d'un ADN simple ou double brin, linéaire ou circulaire.
Les plasmides peuvent être délivrés aux cellules par transformation, selon la méthode décrite ci-dessous.
Le vecteur dérivé du densovirus de Junonia coenia peut être appelé « vecteur toxique » en ce qu'il porte une séquence nucléotidique qui code pour une toxine exprimée à terme dans la cellule d'insecte infectée.
Le terme « séquence nucléotidique » se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un cDNA ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire.
On entend par « séquences terminales répétées inversées », plus connues sous le nom d' « Inverted Terminal Repeats » ou ITRs, les séquences avec une structure en épingle à cheveux situées aux extrémités 5' et 3' du génome du densovirus de Junonia coenia (respectivement SEQ ID N°l et SEQ ID N°3). Ces séquences ITRs d'une longueur de 518 nucléotides sont connues pour leur implication dans le phénomène d'encapsidation du génome viral ainsi que pour leur rôle dans la réplication du génome viral.
Les séquences ITRs selon l'invention présentent la particularité d'avoir été partiellement délétées. Les séquences minimales d'ITRs du vecteur selon l'invention conservent ainsi leur fonction d'encapsidation du génome dans les protéines structurales de la capside. L'absence de toutes autres séquences d'origine virale sur le vecteur empêche la réplication du vecteur de manière autonome.
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N°l, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID N°l .
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 5' consiste en les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N°l (SEQ ID N°2).
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N°3, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID N°3.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 3 'consiste en les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N°3 (SEQ ID N°4).
On entend par « toxine » une molécule présentant une activité toxique sur une cellule, laquelle activité toxique peut entraîner une mort cellulaire mais également une perturbation d'une ou plusieurs fonctions cellulaires, lesquelles perturbations cellulaires sont susceptibles d'entraîner chez un organisme des retards de croissance ou la mort dudit organisme.
Le terme « organisme » désigne tout insecte infecté par les particules de JcDNV recombinantes et non réplicatives.
Selon un mode de réalisation particulier, une toxine selon l'invention peut être un polypeptide vecteur d'une toxicité dans la cellule dans laquelle il est exprimé. Cette toxicité provoque notamment des effets néfastes tels qu'une destruction de la cellule, de ses composants ou de ses fonctions. Ainsi, on pourra utiliser des polypeptides connus pour leur activité toxique vis-à-vis des insectes, et notamment les lépidoptères, tels que des polypeptides toxiques provenant du venin de divers animaux (neurotoxine de venin de scorpion AaH-ITl, toxines des glandes de venin de guêpes parasitoïdes, etc), ou encore des polypeptides toxiques produits par des plantes ou microorganismes telles que la ricine ou les toxines Cry de Bacillus thuringiensis (Bt Kurstaki 1970, Bt aizawai 1989).
De manière préférée, on utilisera la neurotoxine de venin de scorpion AaH-ITl de séquence protéique SEQ ID N°5.
Selon un autre mode de réalisation, une toxine selon l'invention peut être une molécule d'acide nucléique ADN ou ARN, tel que TARN interfèrent (ARNi), ladite molécule ayant une activité inhibitrice à rencontre de l'expression d'un gène déterminé. Cette activité se traduit notamment par la dégradation rapide d'un ARN messager ciblé et conduit à l'extinction de la transcription du gène ciblé.
De manière préférée, on choisira une toxine présentant une stabilité moyenne. Par stabilité moyenne, on entend une toxine se dégradant en moins de 7 jours, en moins de un jour ou en moins de 7 heures.
Egalement de manière préférée, on choisira une toxine ne présentant pas d'activité toxique à l'égard des cellules dans lesquelles sont produites les particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives selon l'invention.
On entend par « liée de manière opérationnelle à un promoteur» le lien par lequel un promoteur est situé de manière contigue à une séquence nucléotidique d'intérêt pour contrôler l'expression de ladite séquence. En l'occurrence, le promoteur est ici lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la toxine pour en contrôler son expression.
A titre d'exemples de promoteurs permettant l'expression d'une toxine dans les cellules d'insectes, on peut utiliser des promoteurs ubiquitaires tel que le promoteur Actine A3 de Bombyx mori de séquence SEQ ID N° 6. ou encore des promoteurs spécifiques d'un tissu.
De manière préférée, le promoteur permettant l'expression d'une toxine du vecteur selon l'invention est un promoteur inductible de manière à pouvoir réguler l'expression de ladite toxine en administrant, simultanément ou non, le vecteur et l'inducteur dudit promoteur.
Le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITR selon (i) et (iii). Ce vecteur est en effet construit à partir d'un vecteur comprenant le génome complet du densovirus de Junonia coenia de séquence SEQ ID N°7. Ainsi, outre les séquences nucléotidiques des ITRs en 5' et 3', le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques de la séquence SEQ ID N°7.
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de production de particules du densovirus Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insecte avec :
a) Un vecteur tel que décrit ci-dessus ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1 (SEQ ID N°8), VP2 (SEQ ID N°9), VP3 (SEQ ID N°10) et VP4 (SEQ ID N°l 1) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et
(ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales NSI (SEQ ID N°13), NS2 (SEQ ID N°14) et NS3 (SEQ ID N°15) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV,
(iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et en 3' du vecteur tel que défini précédemment.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
Le second vecteur selon l'invention constitue un vecteur de complémentation, également connu sous le nom de vecteur « helper », c'est-à-dire un vecteur portant les diverses fonctions ou éléments manquants au vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine, telles que les séquences nucléotidiques codant pour les protéines nécessaires à l'encapsidation (NS) ou les protéines formant la capside (VP), nécessaires à la production d'une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif.
Les protéines structurales, aussi connues sous le nom de « viral proteins » (VP), constituent les protéines de la capside du densovirus. Elles sont au nombre de 4 : VP1 , VP2, VP3 et VP4, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N°8, SEQ ID N°9, SEQ ID N°10 et SEQ ID N°l l . De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression desdites protéines structurales VP est le promoteur P9 de densovirus de Junonia coenia de séquence SEQ ID N°12.
Les protéines non structurales, aussi connues sous le nom de « non structural proteins » (NS), participent à la réplication et à l'assemblage des protéines structurales VP pour la formation de la capside. Ces protéines non-structurales sont au nombre de trois : NSI, NS2 et NS3, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N°13, SEQ ID N°14 et SEQ ID N°15. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression desdites protéines non structurales NS est le promoteur P93 de JcDNV de séquence SEQ ID N°16.
On entend par « dérivé » une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 95 % avec la séquence polypeptidique d'une protéine structurale (VP) ou non structurale (NS) de densovirus de Junonia coenia telles que définies précédemment.
Par « pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques », on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.
Par « meilleur alignement possible ou alignement optimal », on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale développé par SMITH et WATERMAN {Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol. , vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN {Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Comme précisé ci-dessus, la séquence terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N°l, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
De la même manière, la séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en position 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N°3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation.
Deux vecteurs selon l'invention ne partagent pas de séquences de plus 100 paires de base, de plus de 50 paires de base ou de plus de 25 paires de base qui partagent plus de 50% d'identité, 30% d'identité ou 20% d'identité.
Selon un mode de réalisation préféré, les séquences nucléotidiques codant pour :
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et
(ii) les protéines non structurales NSI, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés
sont portées par au moins deux vecteurs distincts.
On entend par « transformation » toute méthode permettant le transfert d'un gène, de préférence, dans une cellule d'insecte. La transformation des cellules d'insectes peut être réalisée en utilisant les méthodes connues de l'Homme de l'art telles que l'utilisation de la transfection ou de la transduction.
De manière préférée, on utilise la transfection pour transférer les séquences nucléotidiques dans les cellules d'insectes. On entend par « transfection » l'introduction d'ADN dans une cellule eucaryote. La transfection des cellules peut être réalisée par l'utilisation de Phosphate de calcium, de liposomes ou vecteurs lipidiques tels que la Lipofectamine ® (INVITROGEN), d'agents polycationiques hautement branchés.
La récolte des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs peut être effectuée selon le protocole suivant, ledit protocole n'étant pas limitatif : quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à 5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175 000 g dans un rotor Beckman SW41ti pendant 2h à 4°C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Un troisième objet de l'invention concerne une cellule d'insecte comprenant :
a) un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que défini ci-dessus ;
b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis ci-dessus.
Ladite cellule d'insecte est notamment utilisée pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode décrite précédemment.
Une cellule d'insecte selon l'invention présente les caractéristiques d'être cultivable et transformable. Ladite cellule est également capable, après transformation avec les vecteurs selon l'invention, de répliquer le densovirus recombinant, mais aussi d'exprimer les protéines virales (VP) et non structurales (NS) pour produire des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
A titre d'exemples de cellules d'insectes, on peut utiliser les cellules suivantes :
Sf9 {Spodoptera frugiperda)
High5 {Trichoplusia ni)
Ld {Lymantria dispar)
A titre d'exemples de conditions de culture des cellules d'insecte, on peut utiliser les conditions suivantes :
- Sf9 {Spodoptera frugiperda) cultivées à 26°C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) + 10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques - High5 (Trichoplusia ni) cultivées à 26°C en milieu Grâce (INVITROGEN, USA) + 10 % SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
- Ld (Lymantria dispar) cultivées à 26°C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) + 10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
Un quatrième objet de l'invention concerne un kit pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode définie précédemment comprenant :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et
b) Au moins un vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, le kit de production de particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs de la présente invention comprend :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et
b) Au moins deux vecteurs de complémentation distincts tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs comprend en outre des cellules d'insectes telles que définies ci-dessus.
Un cinquième objet de l'invention concerne une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue selon la méthode définie précédemment et constituée d'une capside contenant une séquence nucléotidique qui comprend:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie précédemment ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie précédemment ;
et obtenue par la méthode de production décrite précédemment.
On entend par « particule de densovirus de Junonia coenia recombinant » une particule virale produite à partir d'un génome de densovirus modifié. En l'occurrence, le génome du densovirus de Junonia coenia recombinant selon l'invention a été modifié par la délétion partielle des séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' pour maintenir au minimum la fonction d'encapsidation de ces séquences, ainsi que par la suppression de la totalité des séquences virales de JcDNV comprises entre les deux séquences ITRs. Par ailleurs, une séquence nucléotidique codant pour une toxine a également été insérée entre les séquences ITRs partiellement délétées.
On entend par « particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif» une particule virale de densovirus de Junonia coenia recombinant ne possédant pas la capacité de répliquer son génome en vue d'une production de densovirus à partir de son seul matériel génétique ou de celui de la cellule hôte.
Les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs sont produites dans la méthode décrite précédemment à partir du vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine avec l'aide du (des) vecteur(s) de complémentation porteur(s) des séquences virales nécessaires à l'encapsidation et à la réplication virale. Ainsi, en l'absence de ces vecteurs de complémentation exprimant les protéines structurales et non structurales, les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants ne peuvent se répliquer.
Un sixième objet de l'invention concerne une utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatif tels que définies ci-dessus en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
Le génome des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs selon l'invention comprend une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine. Ladite toxine pourra être exprimée dans les cellules d'insectes infectées et constitue le moyen de lutte de ces particules de densovirus à l'encontre des lépidoptères ravageurs de culture.
Un septième objet de l'invention concerne une composition comprenant les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention comprend également un inducteur du promoteur lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour une toxine lorsque ledit promoteur est un promoteur inductible. Un huitième objet de l'invention concerne une utilisation d'une composition telle que décrite précédemment en tant que moyen de lutte contre les lépidoptères.
Un neuvième objet de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes, ledit procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment sur les cultures de plantes.
De préférence, les plantes traitées selon ledit procédé de traitement sont le riz, maïs, coton, soja, sorgho, canne à sucre, tomate, poivron, luzerne.
De manière préférée, la séquence codant pour la toxine est sous le contrôle d'un promoteur inductible et le procédé de traitement des plantes selon l'invention comprend une étape d'épandage du composé inducteur dudit promoteur simultanément, antérieurement ou postérieurement à l'étape d'épandage des particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives telle que décrite précédemment.
Exemple 1 Constructions
Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant la séquence complète infectieuse du densovirus de Junonia coenia (JcDNV) (SEQ ID N°7), à savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Figure 1) (Jourdan et al., 1990, Virology, vol.179, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université d'Aix- Marseille II, ppl53).
a) Constructions des plasmides de complémentation
Les vecteurs de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur et/ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le plasmide porteur des gènes NS et VP sans les séquences ITRs, nommé plasmide pJA, est dérivé du plasmide pBRJ-H par délétion des régions terminales répétées inversées (ITRs) au niveau du site Fspl (Li, 1993, Thèse de doctorat de l'Université Montpellier II. pp.124). Dans cette construction, les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) de JcDNV sont sous contrôle de leur propre promoteur, P9 et P93, respectivement.
Afin d'obtenir une construction portant uniquement les gènes non structuraux (NS), une délétion des gènes structuraux (VP) a été effectuée par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction BamKl et Hpal (position 38 pb à 2162 pb) puis par religation avec la T4 DNA ligase (INVITROGEN, USA), générant ainsi le plasmide pJAAVP (Figure 1.a).
De la même manière, un plasmide portant uniquement les gènes structuraux (VP) a été obtenu en effectuant une délétion des gènes non structuraux (NS) par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction Bsml et Kpnl (position 2732 pb à 521 1 pb) générant le plasmide pJAANS (Figure 1.b).
b) Constructions du vecteur d'encapsidation
Les régions terminales répétées inversées (ITRs) aux extrémités du génome viral sont vraisemblablement requises pour l'encapsidation. Différentes constructions portant un génome recombinant ont été développées afin de déterminer les séquences minimales ITRs nécessaires à l'encapsidation. Dans un premier temps, des constructions portant uniquement les ITRs, sont obtenues par digestion du plasmide pBRJ-H au niveau des sites BstEll (position 337 pb à 6028 pb) ou BamHI (position 446 pb à 5920 pb), délétant ainsi la partie du génome viral codant pour les NS et les VP.
Par la suite, un premier vecteur recombinant a été construit par clonage d'une cassette d'expression A3GFP contenant le gène codant pour la « Green Fluorescent Protein » (GFP) sous contrôle du promoteur Actine de Bombyx mori A3 (SEQ ID N°6) au niveau des sites de restriction des enzymes BstEII et BamHI du plasmide pBRJ-H dont le génome viral a été délété. La cassette d'expression A3GFP utilisée provient du plasmide pASA3-GFP, vecteur d'expression de lépidoptères (Bossin, 1998, Thèse de l'Université Montpellier II, pp. 240) (Figure 1.c). Le vecteur généré constitue ainsi un des génomes recombinant à encapsider. Les constructions correspondantes sont nommées pITR-A3GFP-2?stEII et pITR-A3GFP-5a/wHI.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la protéine fluorescente rouge, DsRed2, a été construit à partir du vecteur pITR-A3GFP-.Z¾tEII par délétion du gène rapporteur GFP au niveau des sites de restriction BamHI et Notl. Le gène DsRed2 a été amplifié, à partir du plasmide pDsRed2 (CLONTECH, USA), par PCR à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction BamHI et Notl puis inséré à la place du gène de la GFP. Cette construction a été nommée pITR-A3DsRed2-55tEII.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la neurotoxine du scorpion Androctonus australis (AaH-ITl) (SEQ ID N° 5) obtenu à partir du plasmide pcD- Tox (Bougis et al., 1989) a été construit selon la même méthode que pour le vecteur pITR- A3DsRed2-i?s EII. Le vecteur généré a été nommé pITR- A3 AaH-ITl -iîstEII.
Exemple 2 Lignée cellulaire et test de multi-transfection
Les particules de JcDNV recombinants ont été produites par multi-transfection en cellules d'insectes. La lignée cellulaire d'insecte Lymantria dispar, IPLB-Ld 652 (Ld), (Goodwin et al, 1978, In vitro Vol.14, n°6, p:485-94; 1985, Techniques in the life sciences, cell biology," Vol. Cl, "techniques in setting up and maintenance of tissue and cell cultures." Separate Cl 09, 28 pp., Elsevier, County Clare, Ireland ou Techniques in the Life Sciences, Setting Up and Maintenance of Tissue and Cell Cultures, Elsevier Scientific Publishers Ireland, Ltd., (1985) pp. Cl 09/1 -Cl 09/28), a été maintenue à 26°C en milieu de culture TC100 (Invitrogen, USA) complémenté avec 10% de sérum de veau f tal et 1% d'antibiotiques/antimycotiques (Sigma, USA). Les différentes réactions suivantes de co-transfection des cellules Ld ont été réalisées avec le réactif de transfection Fugene® HD (Roche Diagnostics, USA) selon les instructions du fournisseur :
Bi-transfection avec le vecteur de complémentation pJA portant les gènes NS et VP et un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-
A3AaH-ITl , selon un ratio de 1 :1 ou 1 :2;
- Tri-transfection avec les vecteurs de complémentation pJAANS porteur des gènes VP et pJAAVP porteur des gènes NS ainsi qu'avec un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-ITl, selon un ratio de 1 : 1 : 1 ou 1 :1 :2.
L'efficacité de transfection a été déterminée par observation au microscope à fluorescence des cellules Ld transfectées avec la construction pITR-A3GFP et a montré qu'elle est au maximum de 30%.
Exemple 3 Production des particules de JcDNV
Quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à 5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175000 g dans un rotor Beckman SW41ti pendant 2h à 4°C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Afin de vérifier la présence et la concentration de particules virales, une partie de la précédente suspension est déposée sur une grille porte-objet afin de réaliser des colorations négatives (acide phosphotungstique 2%, pH 7.0).
Une étape de visualisation en Microscopie Electronique à Transmission (MET) a permis de confirmer la production de particules virales par les cellules.
Exemple 4 Caractérisation des particules virales de J DNV
Afin de vérifier que l'ADN encapsidé correspond bien à la construction attendue (cassette d'expression A3GFP notamment), l'ADN viral a été extrait des particules virales puis digéré par Dpnl. Une étape d'amplification par PCR a par la suite été réalisée sur les ADN digérés en utilisant des amorces spécifiques de la cassette d'expression A3GFP, amorces sens : 5'- ATTTACTAAggTgTgCTCgAAC AgT-3 ' (SEQ ID N°17) et amorce antisens: 5'- TACTTgTAC AgCTCgTCCATgCCg-3 ' (SEQ ID N°18). Les résultats montrent une amplification spécifique à partir de l'ADN extrait des particules virales et aucune amplification dans le contrôle plasmidique (pASA3-GFP) digéré par Dpnl. Ces résultats confirment que le génome recombinant a bien été amplifié et encapsidé dans des cellules transfectées.
Exemple 5 Analyse des virus recombinants
Les suspensions de particules virales obtenues dans l'exemple 3 ont été utilisées pour infecter des cellules Ld. Ainsi, des cellules Ld, cultivées en milieu TC100 complet, ont été préparées en plaque 96 puits de manière à être à 80% de confluence à 24h de culture. Le lendemain, le milieu de culture des cellules a été retiré et 50 μΐ de particules virales purifiées ont été ajoutées. Les cellules sont incubées pendant lh à 26°C avec l'inoculum. Par la suite, du milieu TC100 complet a été ajouté et les cellules sont maintenues dans une étuve à 26°C jusqu'à observation.
Après infection, la fluorescence des cellules Ld a été contrôlée quotidiennement. Les résultats montrent que l'expression des gènes rapporteurs fluorescents (GFP et DsRed2) est détectée dès 4 jours post-infection dans environ 15% des cellules.
Exemple 6 Validation du caractère non réplicatif des particules virales
Afin de confirmer le caractère non réplicatif des particules virales isolées, le surnageant de culture des cellules infectées dans l'exemple 5 a été récolté et soumis au même protocole que celui de l'exemple 3 (clarification, ultracentrifugation et resuspension du culot dans du PBS). Un volume de cette suspension a été utilisé pour infecter de nouvelles cellules Ld avec un protocole identique à celui utilisé dans l'exemple 4. De la même manière, la fluorescence des cellules Ld a été suivie de manière régulière après l'infection.
Les résultats n'ont montré aucune trace de fluorescence permettant de confirmer le caractère non réplicatif des particules obtenues.
Exemple 7 Transfert de gènes à des insectes ravageurs
Pour confirmer l'efficacité des particules obtenues précédemment (cf exemple 3), celles-ci ont été injectées à des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion (début du 4ème stade de développement) à l'aide d'un micro-injecteur.
Plusieurs groupes de 10 à 15 larves, identifiés comme suit, ont été utilisés :
- Groupe GFP auquel a été injecté 10 μΐ de particules recombinantes codant pour la protéine GFP - Groupe DsRed auquel a été injecté 10 μΐ de particules recombinantes codant pour la protéine DsRed2
- Groupe AaH-ITl auquel a été injecté 10 μΐ de particules recombinantes codant pour la toxine de scorpion AaH-ITl
- Groupe contrôle positif auquel a été injecté 10 μΐ de particules de JcDNV sauvages purifiées, produites après transfection de cellules Ld avec le plasmide infectieux pBRJ-H
- Groupe contrôle négatif auquel a été injecté 10 μΐ de PBS.
Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26°C, pendant 6 jours. Un suivi du poids et de la mortalité a été réalisé quotidiennement. Les larves mortes au cours de l'expérience ont été stockées à -20°C pour des analyses ultérieures.
A 6 jours post-infection (PI), les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte à l'aide d'une aiguille de diamètre 0,2 mm. L'hémolymphe de chaque larve a été récupérée et mise en culture en plaque 96 puits avec 100 μΐ de milieu de culture TClOO, 1 % antibiotiques et 0,03 μΜ PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence. a) Déliyrance dans l'insecte des particules recombinantes GFP et DsRed
Les hémocytes des larves des groupes GFP, DsRed, contrôle positif et négatif ont été observés au microscope à fluorescence dès 4h après la mise en culture (6 jours PI). Un signal fluorescent vert et rouge a été observé dans certains hémocytes des larves injectées avec les particules codant la GFP et la DsRed, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée chez les contrôles positif et négatif.
Après dissection, les tissus ont été montés sur lames et observés au microscope à fluorescence. Une fluorescence spécifique verte et rouge est observée dans les trachées des larves infectées respectivement par les particules recombinantes GFP et DsRed. Aucune fluorescence spécifique n'est observée dans les trachées des larves des groupes contrôles positif et négatif.
b) Effet pathogène des particules recombinantes AaH-ITl Les larves du groupe contrôle positif, auxquelles ont été injecté le JcDNV natif, sont mortes dès J+3 et jusqu'à J+6 PI (98 % de mortalité). Peu de mortalité (15 %) a été observée chez les larves du groupe AaH-ITl auxquelles ont injectées des particules recombinantes codant pour la toxine de scorpion. Le développement des larves a été altéré (mues et prise de poids). En effet, nous avons observé une différence significative (test t student, p < 0,005) entre le poids des larves du groupe contrôle négatif 'et celui des larves du groupe AaH-ITl. Aucune mortalité n'a par ailleurs été observée dans le groupe contrôle négatif.
Exemple 8 Vérification du caractère non réplicatif in vivo
Les larves infectées avec les particules recombinantes ont été sacrifiées à 6 jours post- infection. La partie restante des larves, stockée à -20°C, a été broyée dans du PBS. Les surnageants ont été clarifiés 10 minutes à 5000 g puis injectés à raison de 10 μΐ dans des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion à l'aide d'un micro- injecteur. Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26°C, pendant 6 jours.
A 6 jours post-infection, les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte et l'hémolymphe de chaque larve a été mise en culture en plaque 96 puits avec 100 μΐ de milieu de culture TClOO, 1 % antibiotiques et 0,03 μΜ PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence.
Aucune fluorescence n'a été observée dans les hémocytes et les trachées des larves injectées avec les broyats clarifiés de larves positives en primo-infection.
Exemple 9 Production de particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus
Le système d'expression Baculovirus est communément employé pour la production de grandes quantités de protéines recombinantes en raison de sa facilité d'utilisation et de son haut niveau d'expression. Le principe de production des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus repose sur :
i) le clonage des séquences d'intérêts du Densovirus dans un vecteur d'expression commercialement disponible, pFastBacTMl ,
ii) la production de Baculovirus recombinants en utilisant le système Bac-to-Bac® (Baculovirus Expression System, INVITROGEN, USA) et enfin iii) la purification des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs néoformées.
Selon le même principe que développé initialement, à savoir la multi-transfection de cellules d'insectes par trois plasmides portant les gènes structuraux, non structuraux et le génome recombinant, trois Baculovirus recombinants seront produits et serviront à la multi- infection de cellules d'insectes.
1) Constructions
Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant la séquence complète infectieuse du Densovirus de Junonia coenia (JcDNV), à savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Jourdan et al., 1990, Virology, vol.179, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université d'Aix-Marseille II, ppl53
a- Constructions des vecteurs d'expression portant les séquences de complémentation
Les vecteurs d'expression dit de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le vecteur d'expression porteur des gènes NS sans les séquences ITRs, nommé pFastBac-NS, est obtenu après amplification par PCR des séquences NS incluant le promoteur homologue P93, à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction Notl et Xhol (séquences soulignées) :
P93_NS_pFastBAC_F = 5 ' - AT AAgCggCCgTT ATTgTgACCTCgTTTgA-3 ' (SEQ ID N°19) et
NS_pBAC_R = 5 ' -CCgCTCgAgTT AA A ATgT AAT ATT ATATTT ACTC AAT AAA-
3'(SEQ ID N°20).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites Notl-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBac™l . L'expression des gènes non structuraux (NS) est faite sous contrôle du promoteur homologue P93.
Le vecteur d'expression porteur des gènes VP sans les séquences ITRs, nommé pFastBac-VP, a été obtenu après amplification par PCR des séquences VP, à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction Notl et Xhol (séquences soulignées) :
VP_pFastBAC_F = 5'- ATAAgCggCCgCATgTCTTTCTACACggCCgggT -3' (SEQ ID N°21) et VP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAgTTAAACgTTACCAATAgTAgCTCCA -3'(SEQ ID N°22).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites Notl-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBac™l .
L'expression des gènes structuraux (VP) a été faite sous contrôle du promoteur hétérologue fort polyhédrine (ΡΡΗ)·
b- Constructions du vecteur d'expression portant le génome à encapsider
Le vecteur d'expression, nommé pFastBac-ITR-A3GFP, porte les régions ITRs de JcDNV encadrant la cassette d'expression A3-GFP. Cette construction dérive du plasmide pITR-A3GFP-i¾tEIi déjà décrit. Ainsi la séquence incluant les régions ITRs et la cassette d'expression a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces intégrant les sites EcoRI et Xhol (séquences soulignées) :
A3GFP_pFastBAC_F = 5'- CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC -3' (SEQ ID N°23) et
A3 GFP_pFastB AC_R = 5'- CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg -3' (SEQ ID N°24).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites EcoRl-Xhol du site de multi- clonage du vecteur d'expression pFastBac™l.
Les vecteurs d'expression pFastBac-NS, pFastBac- VP et pFastBac-ITR-A3GFP ont été transformées en cellules compétentes DHlOBac afin de générer les Bacmides recombinants (BAC-NS, BAC-VP et BAC-ITRA3GFP).
2) Production des Baculovirus recombinants
Des premiers stocks viraux à faible titre sont générés par transfection de cellules d'insectes, Sf9, avec l'ADN des bacmides recombinants. L'expression des protéines NS, VP et GFP est évaluée par Western-Blot.
L'amplification des Baculovirus recombinants et la génération de stocks viraux à haut titre sont effectuées à partir des stocks à faible titre par passage en séries en cellules d'insectes. Le titre viral de chaque Baculovirus recombinant est également estimé par PCR quantitative puis confirmer par dosage en plaque. 3) Production des Densovirus recombinants non réplicatifs par multi-infection de cellules d'insectes, Sf9, avec les trois Baculovirus recombinants
Les stocks de Baculovirus recombinants à haut titre sont utilisés pour multi-infectées des cellules d'insectes Sf9. Des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs ainsi que des Baculovirus sont produits lors de cette infection.
La purification des particules de DNVs est effectuée par la chaleur. En effet, les Baculovirus sont des virus enveloppés et donc peu résistant à la chaleur contrairement aux Densovirus qui sont des virus non enveloppées. Ce procédé de purification est utilisé en routine par les équipes du GENETHON. Une fois la purification effectuée les particules produites sont caractérisées et validées selon le même procédé qu'utilisé précédemment.

Claims

Un vecteur comprenant :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N°l , la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et
(iii) En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N°3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides;
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
Le vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que la toxine est choisie parmi des polypeptides toxiques ou des molécules d'acide nucléique telles que les siRNA ou miRNA.
Une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insectes avec :
a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et
(ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales NSI, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV,
(iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5 'et en 3' du vecteur selon l'une des revendications 1 ou 2.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
4. La méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques codant pour :
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et
(ii) les protéines non structurales NSI , NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés,
sont portées par au moins deux vecteurs de complémentation distincts.
5. Une cellule transformée par :
a) un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2,
b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis dans l'une des revendications 3 ou 4.
6. Un kit pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs par la méthode selon l'une des revendications 3 ou 4 comprenant : a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation tel que défini dans la revendication 3.
7. Une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue par la méthode de production selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 et constituée d'une capside qui contient une séquence nucléotidique comprenant:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie dans la revendication 1 ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, telle que définie dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
(iii) En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie dans la revendication 1.
8. Une utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7 en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
9. Une composition comprenant les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7.
10. Une utilisation de la composition telle que définie dans la revendication 9 en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
1 1. Un procédé de traitement des plantes, ledit procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7 ou tels qu'obtenues par la méthode selon l'une des revendications 3 ou 4.
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