CA2818080A1 - Vecteurs derives de densovirus pour le transfert de gene chez l'insecte - Google Patents
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Abstract
La présente invention porte sur un vecteur comprenant (i) en position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR), (ii) en position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine; et (iii) en position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR), ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii). La présente invention porte également sur une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs utilisant un tel vecteur. Finalement, la présente invention porte sur l'utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que produites selon la méthode précédemment définie en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
Description
VECTEURS DERIVES DE DENSOVIRUS POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ
L'INSECTE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes de production de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs permettant le transfert d'un gène codant pour une toxine dans un insecte et leur utilisation dans la lutte contre les insectes ravageurs de culture.
ART ANTERIEUR
Les densovirus (DNV) sont des virus pathogènes capable de se répliquer de manière autonome et appartenant à la famille des parvovirus. Le génome des densovirus, encapsidé
dans une capside icosahédrale non enveloppée, consiste en un ADN simple brin linéaire d'environ 6 kilobases de longueur et comprenant deux régions de séquences codantes. L'une de ces régions codantes comprend un cadre de lecture ouvert (ORF1) en 5' codant pour les quatre protéines de la capside (VP) sur un brin. L'autre région codante comprend trois cadres de lecture ouverts ORF2, ORF3 et ORF4 en 5' sur le brin complémentaire et codant pour les protéines non structurales (NS) du densovirus. Ces deux régions codantes sont délimitées aux extrémités 5' et 3' par des séquences terminales répétées inversées (ITRs) avec une structure en épingles à cheveux d'une longueur supérieure à 500 nucléotides et incluant les promoteurs responsables de l'expression des protéines VP et NS.
Les densovirus présentent la particularité intéressante de n'être pathogènes qu'à
l'égard des invertébrés et notamment des insectes et crustacés. Il n'a en effet pas été établi de pathogénicité chez les mammifères et plus particulièrement les humains.
L'utilisation de tels densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture présente donc un grand intérêt.
Cet intérêt s'est vu confirmé par la possibilité d'insérer le génome de densovirus dans des plasmides bactériens, du fait de leur petite taille, favorisant de ce fait les manipulations génétiques ainsi que la production de densovirus recombinants.
Toutefois, la capacité des densovirus à se répliquer et se multiplier dans l'environnement présente un inconvénient dans l'utilisation de densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture.
Dans le but de pallier à cet inconvénient, les inventeurs ont mis au point une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants dénuées de toute capacité de réplication et exprimant en outre une toxine dans les cellules d'insectes infectées.
COPIE DE CONFIRMATION
L'INSECTE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des méthodes de production de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs permettant le transfert d'un gène codant pour une toxine dans un insecte et leur utilisation dans la lutte contre les insectes ravageurs de culture.
ART ANTERIEUR
Les densovirus (DNV) sont des virus pathogènes capable de se répliquer de manière autonome et appartenant à la famille des parvovirus. Le génome des densovirus, encapsidé
dans une capside icosahédrale non enveloppée, consiste en un ADN simple brin linéaire d'environ 6 kilobases de longueur et comprenant deux régions de séquences codantes. L'une de ces régions codantes comprend un cadre de lecture ouvert (ORF1) en 5' codant pour les quatre protéines de la capside (VP) sur un brin. L'autre région codante comprend trois cadres de lecture ouverts ORF2, ORF3 et ORF4 en 5' sur le brin complémentaire et codant pour les protéines non structurales (NS) du densovirus. Ces deux régions codantes sont délimitées aux extrémités 5' et 3' par des séquences terminales répétées inversées (ITRs) avec une structure en épingles à cheveux d'une longueur supérieure à 500 nucléotides et incluant les promoteurs responsables de l'expression des protéines VP et NS.
Les densovirus présentent la particularité intéressante de n'être pathogènes qu'à
l'égard des invertébrés et notamment des insectes et crustacés. Il n'a en effet pas été établi de pathogénicité chez les mammifères et plus particulièrement les humains.
L'utilisation de tels densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture présente donc un grand intérêt.
Cet intérêt s'est vu confirmé par la possibilité d'insérer le génome de densovirus dans des plasmides bactériens, du fait de leur petite taille, favorisant de ce fait les manipulations génétiques ainsi que la production de densovirus recombinants.
Toutefois, la capacité des densovirus à se répliquer et se multiplier dans l'environnement présente un inconvénient dans l'utilisation de densovirus pour lutter contre les insectes ravageurs de culture.
Dans le but de pallier à cet inconvénient, les inventeurs ont mis au point une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants dénuées de toute capacité de réplication et exprimant en outre une toxine dans les cellules d'insectes infectées.
COPIE DE CONFIRMATION
2 Les densovirus de Junonia coenia (JcDNV) présentent la particularité de bénéficier d'un spectre d'hôte étendu à plusieurs espèces de lépidoptères, notamment Aglaïs urticae L.
(Nymphalidae), Lymantria dispar L. (Lymantriidae), Bombyx mon i L.
(Bombycoïdae), Mamestraoleracea, M brassicae L. (Noctuidae), Spodoptera exigua, S. littoralis , S.
frugiperda (Noctuidae).
Les particules de JcDNV recombinants selon l'invention ne peuvent se répliquer dans l'environnement mais permettent de lutter contre les insectes ravageurs de culture, et notamment les lépidoptères, par l'expression d'une toxine dans les cellules desdits insectes après infection.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1. Constructions pour la production de particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un vecteur, lequel vecteur est dérivé
du génome du densovirus Junonia Coenia, comprenant une séquence nucléotidique se décomposant comme suit :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N 3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, de préférence ladite séquence nucléotidique ITR en 3' est complémentaire à la séquence nucléotidique ITR en 5';
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
On entend par vecteur tout véhicule capable de faciliter le transfert d'une séquence nucléotidique dans une cellule, de préférence une cellule d'insecte. De manière générale, les vecteurs selon l'invention incluent, sans limitation, les plasmides, cosmides, phagemides ou
(Nymphalidae), Lymantria dispar L. (Lymantriidae), Bombyx mon i L.
(Bombycoïdae), Mamestraoleracea, M brassicae L. (Noctuidae), Spodoptera exigua, S. littoralis , S.
frugiperda (Noctuidae).
Les particules de JcDNV recombinants selon l'invention ne peuvent se répliquer dans l'environnement mais permettent de lutter contre les insectes ravageurs de culture, et notamment les lépidoptères, par l'expression d'une toxine dans les cellules desdits insectes après infection.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1. Constructions pour la production de particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un vecteur, lequel vecteur est dérivé
du génome du densovirus Junonia Coenia, comprenant une séquence nucléotidique se décomposant comme suit :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N 3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, de préférence ladite séquence nucléotidique ITR en 3' est complémentaire à la séquence nucléotidique ITR en 5';
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
On entend par vecteur tout véhicule capable de faciliter le transfert d'une séquence nucléotidique dans une cellule, de préférence une cellule d'insecte. De manière générale, les vecteurs selon l'invention incluent, sans limitation, les plasmides, cosmides, phagemides ou
3 tout autre véhicule dérivé de sources virales ou bactériennes qui ont été
manipulées pour l'insertion ou incorporation d'une séquence nucléotidique, par exemple, et sans limitation, des vecteurs de type baculovirus.
Par ailleurs, les vecteurs peuvent inclure des marqueurs de sélection de manière à
permettre l'identification des cellules ayant bien intégré lesdits vecteurs.
De manière préférée, les vecteurs selon l'invention sont des vecteurs plasmidiques, également appelés plasmides. Les plasmides ont été largement décrits dans l'art antérieur et sont bien connus de l'Homme du métier (voir par exemple SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A titre d'exemples, on peut citer les plasmides les plus communément utilisés tels que pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, et pBlueScript. Les plasmides peuvent être conçus par l'utilisation d'enzymes de restriction et de réactions de ligation pour éliminer ou ajouter des fragments d'ADN spécifiques. Les plasmides dans lesquels sont insérées les séquences nucléotidiques sont sous forme d'un ADN simple ou double brin, linéaire ou circulaire.
Les plasmides peuvent être délivrés aux cellules par transformation, selon la méthode décrite ci-dessous.
Le vecteur dérivé du densovirus de Junonia coenia peut être appelé vecteur toxique en ce qu'il porte une séquence nucléotidique qui code pour une toxine exprimée à
terme dans la cellule d'insecte infectée.
Le terme séquence nucléotidique se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un cDNA ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire.
On entend par séquences terminales répétées inversées , plus connues sous le nom d' Inverted Terminal Repeats ou ITRs, les séquences avec une structure en épingle à
cheveux situées aux extrémités 5' et 3' du génome du densovirus de Junonia coenia (respectivement SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3). Ces séquences ITRs d'une longueur de 518
manipulées pour l'insertion ou incorporation d'une séquence nucléotidique, par exemple, et sans limitation, des vecteurs de type baculovirus.
Par ailleurs, les vecteurs peuvent inclure des marqueurs de sélection de manière à
permettre l'identification des cellules ayant bien intégré lesdits vecteurs.
De manière préférée, les vecteurs selon l'invention sont des vecteurs plasmidiques, également appelés plasmides. Les plasmides ont été largement décrits dans l'art antérieur et sont bien connus de l'Homme du métier (voir par exemple SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A titre d'exemples, on peut citer les plasmides les plus communément utilisés tels que pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, et pBlueScript. Les plasmides peuvent être conçus par l'utilisation d'enzymes de restriction et de réactions de ligation pour éliminer ou ajouter des fragments d'ADN spécifiques. Les plasmides dans lesquels sont insérées les séquences nucléotidiques sont sous forme d'un ADN simple ou double brin, linéaire ou circulaire.
Les plasmides peuvent être délivrés aux cellules par transformation, selon la méthode décrite ci-dessous.
Le vecteur dérivé du densovirus de Junonia coenia peut être appelé vecteur toxique en ce qu'il porte une séquence nucléotidique qui code pour une toxine exprimée à
terme dans la cellule d'insecte infectée.
Le terme séquence nucléotidique se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un cDNA ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire.
On entend par séquences terminales répétées inversées , plus connues sous le nom d' Inverted Terminal Repeats ou ITRs, les séquences avec une structure en épingle à
cheveux situées aux extrémités 5' et 3' du génome du densovirus de Junonia coenia (respectivement SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3). Ces séquences ITRs d'une longueur de 518
4 nucléotides sont connues pour leur implication dans le phénomène d'encapsidation du génome viral ainsi que pour leur rôle dans la réplication du génome viral.
Les séquences ITRs selon l'invention présentent la particularité d'avoir été
partiellement délétées. Les séquences minimales d'ITRs du vecteur selon l'invention conservent ainsi leur fonction d'encapsidation du génome dans les protéines structurales de la capside. L'absence de toutes autres séquences d'origine virale sur le vecteur empêche la réplication du vecteur de manière autonome.
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 1, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID
N 1.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 5' consiste en les nucléotides 1 à
149 de la séquence SEQ ID N 1 (SEQ ID N 2).
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 3, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID
N 3.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 3'consiste en les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N 3 (SEQ ID N 4).
On entend par toxine une molécule présentant une activité toxique sur une cellule, laquelle activité toxique peut entraîner une mort cellulaire mais également une perturbation d'une ou plusieurs fonctions cellulaires, lesquelles perturbations cellulaires sont susceptibles d'entraîner chez un organisme des retards de croissance ou la mort dudit organisme.
Le terme organisme désigne tout insecte infecté par les particules de JcDNV
recombinantes et non réplicatives.
Selon un mode de réalisation particulier, une toxine selon l'invention peut être un polypeptide vecteur d'une toxicité dans la cellule dans laquelle il est exprimé. Cette toxicité
provoque notamment des effets néfastes tels qu'une destruction de la cellule, de ses composants ou de ses fonctions. Ainsi, on pourra utiliser des polypeptides connus pour leur activité toxique vis-à-vis des insectes, et notamment les lépidoptères, tels que des polypeptides toxiques provenant du venin de divers animaux (neurotoxine de venin de
Les séquences ITRs selon l'invention présentent la particularité d'avoir été
partiellement délétées. Les séquences minimales d'ITRs du vecteur selon l'invention conservent ainsi leur fonction d'encapsidation du génome dans les protéines structurales de la capside. L'absence de toutes autres séquences d'origine virale sur le vecteur empêche la réplication du vecteur de manière autonome.
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 1, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID
N 1.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 5' consiste en les nucléotides 1 à
149 de la séquence SEQ ID N 1 (SEQ ID N 2).
De manière préférée, la séquence nucléotidique ITR en 5' ne comprend pas plus de 225 nucléotides de la séquence SEQ ID N 3, à titre d'exemples pas plus de 200 ou 175 nucléotides, et de manière plus préférée pas plus de 160 nucléotides de la séquence SEQ ID
N 3.
De manière encore plus préférée, la séquence ITR en 3'consiste en les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N 3 (SEQ ID N 4).
On entend par toxine une molécule présentant une activité toxique sur une cellule, laquelle activité toxique peut entraîner une mort cellulaire mais également une perturbation d'une ou plusieurs fonctions cellulaires, lesquelles perturbations cellulaires sont susceptibles d'entraîner chez un organisme des retards de croissance ou la mort dudit organisme.
Le terme organisme désigne tout insecte infecté par les particules de JcDNV
recombinantes et non réplicatives.
Selon un mode de réalisation particulier, une toxine selon l'invention peut être un polypeptide vecteur d'une toxicité dans la cellule dans laquelle il est exprimé. Cette toxicité
provoque notamment des effets néfastes tels qu'une destruction de la cellule, de ses composants ou de ses fonctions. Ainsi, on pourra utiliser des polypeptides connus pour leur activité toxique vis-à-vis des insectes, et notamment les lépidoptères, tels que des polypeptides toxiques provenant du venin de divers animaux (neurotoxine de venin de
5 scorpion AaH-IT1, toxines des glandes de venin de guêpes parasitoïdes, etc), ou encore des polypeptides toxiques produits par des plantes ou microorganismes telles que la ricine ou les toxines Cry de Bacillus thuringiensis (Bt Kurstaki 1970, Bt aizawai 1989).
De manière préférée, on utilisera la neurotoxine de venin de scorpion AaH-IT1 de séquence protéique SEQ ID N 5.
Selon un autre mode de réalisation, une toxine selon l'invention peut être une molécule d'acide nucléique ADN ou ARN, tel que l'ARN interférent (ARNi), ladite molécule ayant une activité inhibitrice à l'encontre de l'expression d'un gène déterminé. Cette activité
se traduit notamment par la dégradation rapide d'un ARN messager ciblé et conduit à
l'extinction de la transcription du gène ciblé.
De manière préférée, on choisira une toxine présentant une stabilité moyenne.
Par stabilité moyenne, on entend une toxine se dégradant en moins de 7 jours, en moins de un jour ou en moins de 7 heures.
Egalement de manière préférée, on choisira une toxine ne présentant pas d'activité
toxique à l'égard des cellules dans lesquelles sont produites les particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives selon l'invention.
On entend par liée de manière opérationnelle à un promoteur le lien par lequel un promoteur est situé de manière contigüe à une séquence nucléotidique d'intérêt pour contrôler l'expression de ladite séquence. En l'occurrence, le promoteur est ici lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la toxine pour en contrôler son expression.
A titre d'exemples de promoteurs permettant l'expression d'une toxine dans les cellules d'insectes, on peut utiliser des promoteurs ubiquitaires tel que le promoteur Actine A3 de Bombyx mon i de séquence SEQ ID N 6.ou encore des promoteurs spécifiques d'un tissu.
De manière préférée, le promoteur permettant l'expression d'une toxine du vecteur selon l'invention est un promoteur inductible de manière à pouvoir réguler l'expression de ladite toxine en administrant, simultanément ou non, le vecteur et l'inducteur dudit promoteur.
Le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITR selon (i) et (iii). Ce vecteur est en effet construit à partir d'un vecteur comprenant le génome complet du densovirus de
De manière préférée, on utilisera la neurotoxine de venin de scorpion AaH-IT1 de séquence protéique SEQ ID N 5.
Selon un autre mode de réalisation, une toxine selon l'invention peut être une molécule d'acide nucléique ADN ou ARN, tel que l'ARN interférent (ARNi), ladite molécule ayant une activité inhibitrice à l'encontre de l'expression d'un gène déterminé. Cette activité
se traduit notamment par la dégradation rapide d'un ARN messager ciblé et conduit à
l'extinction de la transcription du gène ciblé.
De manière préférée, on choisira une toxine présentant une stabilité moyenne.
Par stabilité moyenne, on entend une toxine se dégradant en moins de 7 jours, en moins de un jour ou en moins de 7 heures.
Egalement de manière préférée, on choisira une toxine ne présentant pas d'activité
toxique à l'égard des cellules dans lesquelles sont produites les particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives selon l'invention.
On entend par liée de manière opérationnelle à un promoteur le lien par lequel un promoteur est situé de manière contigüe à une séquence nucléotidique d'intérêt pour contrôler l'expression de ladite séquence. En l'occurrence, le promoteur est ici lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la toxine pour en contrôler son expression.
A titre d'exemples de promoteurs permettant l'expression d'une toxine dans les cellules d'insectes, on peut utiliser des promoteurs ubiquitaires tel que le promoteur Actine A3 de Bombyx mon i de séquence SEQ ID N 6.ou encore des promoteurs spécifiques d'un tissu.
De manière préférée, le promoteur permettant l'expression d'une toxine du vecteur selon l'invention est un promoteur inductible de manière à pouvoir réguler l'expression de ladite toxine en administrant, simultanément ou non, le vecteur et l'inducteur dudit promoteur.
Le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITR selon (i) et (iii). Ce vecteur est en effet construit à partir d'un vecteur comprenant le génome complet du densovirus de
6 Junonia coenia de séquence SEQ ID N 7. Ainsi, outre les séquences nucléotidiques des ITRs en 5' et 3', le vecteur selon l'invention ne comprend pas d'autres séquences nucléotidiques de la séquence SEQ ID N 7.
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de production de particules du densovirus Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insecte avec :
a) Un vecteur tel que décrit ci-dessus ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1 (SEQ
ID N 8), VP2 (SEQ ID N 9), VP3 (SEQ ID N 10) et VP4 (SEQ ID N 11) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et (ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales (SEQ ID N 13), NS2 (SEQ ID N 14) et NS3 (SEQ ID N 15) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV, (iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et en 3' du vecteur tel que défini précédemment.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
Le second vecteur selon l'invention constitue un vecteur de complémentation, également connu sous le nom de vecteur helper , c'est-à-dire un vecteur portant les diverses fonctions ou éléments manquants au vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine, telles que les séquences nucléotidiques codant pour les protéines nécessaires à l'encapsidation (NS) ou les protéines formant la capside (VP), nécessaires à la production d'une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif.
Les protéines structurales, aussi connues sous le nom de viral proteins (VP), constituent les protéines de la capside du densovirus. Elles sont au nombre de 4 : VP1, VP2, VP3 et VP4, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
8, SEQ ID
N 9, SEQ ID N 10 et SEQ ID N 11. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de production de particules du densovirus Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insecte avec :
a) Un vecteur tel que décrit ci-dessus ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1 (SEQ
ID N 8), VP2 (SEQ ID N 9), VP3 (SEQ ID N 10) et VP4 (SEQ ID N 11) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et (ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales (SEQ ID N 13), NS2 (SEQ ID N 14) et NS3 (SEQ ID N 15) du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV, (iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et en 3' du vecteur tel que défini précédemment.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
Le second vecteur selon l'invention constitue un vecteur de complémentation, également connu sous le nom de vecteur helper , c'est-à-dire un vecteur portant les diverses fonctions ou éléments manquants au vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine, telles que les séquences nucléotidiques codant pour les protéines nécessaires à l'encapsidation (NS) ou les protéines formant la capside (VP), nécessaires à la production d'une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif.
Les protéines structurales, aussi connues sous le nom de viral proteins (VP), constituent les protéines de la capside du densovirus. Elles sont au nombre de 4 : VP1, VP2, VP3 et VP4, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
8, SEQ ID
N 9, SEQ ID N 10 et SEQ ID N 11. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression
7 desdites protéines structurales VP est le promoteur P9 de densovirus de Junonia coenia de séquence SEQ ID N 12.
Les protéines non structurales, aussi connues sous le nom de non structural proteins (NS), participent à la réplication et à l'assemblage des protéines structurales VP
pour la formation de la capside. Ces protéines non-structurales sont au nombre de trois : NS1, NS2 et NS3, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
13, SEQ
ID N 14 et SEQ ID N 15. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression desdites protéines non structurales NS est le promoteur P93 de JcDNV de séquence SEQ ID
N 16.
On entend par dérivé une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 95 % avec la séquence polypeptidique d'une protéine structurale (VP) ou non structurale (NS) de densovirus de Junonia coenia telles que définies précédemment.
Par pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques , on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.
Par meilleur alignement possible ou alignement optimal , on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à
identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN
(Proc.
Nad. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.
32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est
Les protéines non structurales, aussi connues sous le nom de non structural proteins (NS), participent à la réplication et à l'assemblage des protéines structurales VP
pour la formation de la capside. Ces protéines non-structurales sont au nombre de trois : NS1, NS2 et NS3, ayant respectivement les séquences protéiques suivantes : SEQ ID N
13, SEQ
ID N 14 et SEQ ID N 15. De préférence, le promoteur utilisé pour l'expression desdites protéines non structurales NS est le promoteur P93 de JcDNV de séquence SEQ ID
N 16.
On entend par dérivé une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 95 % avec la séquence polypeptidique d'une protéine structurale (VP) ou non structurale (NS) de densovirus de Junonia coenia telles que définies précédemment.
Par pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques , on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.
Par meilleur alignement possible ou alignement optimal , on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à
identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN
(Proc.
Nad. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.
32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est
8 déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité
entre ces deux séquences.
Comme précisé ci-dessus, la séquence terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
De la même manière, la séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en position 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ
ID N 3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation.
Deux vecteurs selon l'invention ne partagent pas de séquences de plus 100 paires de base, de plus de 50 paires de base ou de plus de 25 paires de base qui partagent plus de 50%
d'identité, 30% d'identité ou 20% d'identité.
Selon un mode de réalisation préféré, les séquences nucléotidiques codant pour :
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et (ii) les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés sont portées par au moins deux vecteurs distincts.
On entend par transformation toute méthode permettant le transfert d'un gène, de préférence, dans une cellule d'insecte. La transformation des cellules d'insectes peut être réalisée en utilisant les méthodes connues de l'Homme de l'art telles que l'utilisation de la transfection ou de la transduction.
De manière préférée, on utilise la transfection pour transférer les séquences nucléotidiques dans les cellules d'insectes. On entend par transfection l'introduction d'ADN dans une cellule eucaryote. La transfection des cellules peut être réalisée par
entre ces deux séquences.
Comme précisé ci-dessus, la séquence terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N 1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
De la même manière, la séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en position 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ
ID N 3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides, n'est comprise dans aucun vecteur de complémentation.
Deux vecteurs selon l'invention ne partagent pas de séquences de plus 100 paires de base, de plus de 50 paires de base ou de plus de 25 paires de base qui partagent plus de 50%
d'identité, 30% d'identité ou 20% d'identité.
Selon un mode de réalisation préféré, les séquences nucléotidiques codant pour :
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et (ii) les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés sont portées par au moins deux vecteurs distincts.
On entend par transformation toute méthode permettant le transfert d'un gène, de préférence, dans une cellule d'insecte. La transformation des cellules d'insectes peut être réalisée en utilisant les méthodes connues de l'Homme de l'art telles que l'utilisation de la transfection ou de la transduction.
De manière préférée, on utilise la transfection pour transférer les séquences nucléotidiques dans les cellules d'insectes. On entend par transfection l'introduction d'ADN dans une cellule eucaryote. La transfection des cellules peut être réalisée par
9 l'utilisation de Phosphate de calcium, de liposomes ou vecteurs lipidiques tels que la Lipofectamine (INVITROGEN), d'agents polycationiques hautement branchés.
La récolte des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs peut être effectuée selon le protocole suivant, ledit protocole n'étant pas limitatif : quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à 5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175 000 g dans un rotor Beckman SW4lti pendant 2h à
4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Un troisième objet de l'invention concerne une cellule d'insecte comprenant :
a) un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que défini ci-dessus ;
b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis ci-dessus.
Ladite cellule d'insecte est notamment utilisée pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode décrite précédemment.
Une cellule d'insecte selon l'invention présente les caractéristiques d'être cultivable et transformable. Ladite cellule est également capable, après transformation avec les vecteurs selon l'invention, de répliquer le densovirus recombinant, mais aussi d'exprimer les protéines virales (VP) et non structurales (NS) pour produire des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
A titre d'exemples de cellules d'insectes, on peut utiliser les cellules suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda) - High5 (Trichoplusia ni) - Ld (Lymantria dispar) A titre d'exemples de conditions de culture des cellules d'insecte, on peut utiliser les conditions suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda) cultivées à 26 C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) + 10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques
La récolte des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs peut être effectuée selon le protocole suivant, ledit protocole n'étant pas limitatif : quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à 5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175 000 g dans un rotor Beckman SW4lti pendant 2h à
4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Un troisième objet de l'invention concerne une cellule d'insecte comprenant :
a) un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que défini ci-dessus ;
b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis ci-dessus.
Ladite cellule d'insecte est notamment utilisée pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode décrite précédemment.
Une cellule d'insecte selon l'invention présente les caractéristiques d'être cultivable et transformable. Ladite cellule est également capable, après transformation avec les vecteurs selon l'invention, de répliquer le densovirus recombinant, mais aussi d'exprimer les protéines virales (VP) et non structurales (NS) pour produire des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
A titre d'exemples de cellules d'insectes, on peut utiliser les cellules suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda) - High5 (Trichoplusia ni) - Ld (Lymantria dispar) A titre d'exemples de conditions de culture des cellules d'insecte, on peut utiliser les conditions suivantes :
- Sf9 (Spodoptera frugiperda) cultivées à 26 C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) + 10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques
10 - High5 (Trichoplusia ni) cultivées à 26 C en milieu Grace (INVITROGEN, USA) + 10 % SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
- Ld (Lymantria dispar) cultivées à 26 C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) +
10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
Un quatrième objet de l'invention concerne un kit pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode définie précédemment comprenant :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et b) Au moins un vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, le kit de production de particules de JcDNV
recombinants et non réplicatifs de la présente invention comprend :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et b) Au moins deux vecteurs de complémentation distincts tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs comprend en outre des cellules d'insectes telles que définies ci-dessus.
Un cinquième objet de l'invention concerne une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue selon la méthode définie précédemment et constituée d'une capside contenant une séquence nucléotidique qui comprend:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie précédemment ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie précédemment ;
et obtenue par la méthode de production décrite précédemment.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant une particule virale produite à partir d'un génome de densovirus modifié. En l'occurrence, le
- Ld (Lymantria dispar) cultivées à 26 C en milieu TC100 (INVITROGEN, USA) +
10% SVF + 1% antibiotiques/antimycotiques.
Un quatrième objet de l'invention concerne un kit pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs selon la méthode définie précédemment comprenant :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et b) Au moins un vecteur de complémentation tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, le kit de production de particules de JcDNV
recombinants et non réplicatifs de la présente invention comprend :
a) Un vecteur porteur d'une séquence nucléotidique codant pour une toxine tel que décrit ci-dessus ; et b) Au moins deux vecteurs de complémentation distincts tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit de production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs comprend en outre des cellules d'insectes telles que définies ci-dessus.
Un cinquième objet de l'invention concerne une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue selon la méthode définie précédemment et constituée d'une capside contenant une séquence nucléotidique qui comprend:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie précédemment ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie précédemment ;
et obtenue par la méthode de production décrite précédemment.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant une particule virale produite à partir d'un génome de densovirus modifié. En l'occurrence, le
11 génome du densovirus de Junonia coenia recombinant selon l'invention a été
modifié par la délétion partielle des séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' pour maintenir au minimum la fonction d'encapsidation de ces séquences, ainsi que par la suppression de la totalité des séquences virales de JcDNV comprises entre les deux séquences ITRs. Par ailleurs, une séquence nucléotidique codant pour une toxine a également été insérée entre les séquences ITRs partiellement délétées.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif une particule virale de densovirus de Junonia coenia recombinant ne possédant pas la capacité de répliquer son génome en vue d'une production de densovirus à
partir de son seul matériel génétique ou de celui de la cellule hôte.
Les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs sont produites dans la méthode décrite précédemment à partir du vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine avec l'aide du (des) vecteur(s) de complémentation porteur(s) des séquences virales nécessaires à l'encapsidation et à la réplication virale. Ainsi, en l'absence de ces vecteurs de complémentation exprimant les protéines structurales et non structurales, les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants ne peuvent se répliquer.
Un sixième objet de l'invention concerne une utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatif tels que définies ci-dessus en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
Le génome des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs selon l'invention comprend une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine. Ladite toxine pourra être exprimée dans les cellules d'insectes infectées et constitue le moyen de lutte de ces particules de densovirus à
l'encontre des lépidoptères ravageurs de culture.
Un septième objet de l'invention concerne une composition comprenant les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention comprend également un inducteur du promoteur lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour une toxine lorsque ledit promoteur est un promoteur inductible.
modifié par la délétion partielle des séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' pour maintenir au minimum la fonction d'encapsidation de ces séquences, ainsi que par la suppression de la totalité des séquences virales de JcDNV comprises entre les deux séquences ITRs. Par ailleurs, une séquence nucléotidique codant pour une toxine a également été insérée entre les séquences ITRs partiellement délétées.
On entend par particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif une particule virale de densovirus de Junonia coenia recombinant ne possédant pas la capacité de répliquer son génome en vue d'une production de densovirus à
partir de son seul matériel génétique ou de celui de la cellule hôte.
Les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs sont produites dans la méthode décrite précédemment à partir du vecteur porteur de la séquence nucléotidique codant pour une toxine avec l'aide du (des) vecteur(s) de complémentation porteur(s) des séquences virales nécessaires à l'encapsidation et à la réplication virale. Ainsi, en l'absence de ces vecteurs de complémentation exprimant les protéines structurales et non structurales, les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants ne peuvent se répliquer.
Un sixième objet de l'invention concerne une utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatif tels que définies ci-dessus en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
Le génome des particules de JcDNV recombinants et non réplicatifs selon l'invention comprend une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine. Ladite toxine pourra être exprimée dans les cellules d'insectes infectées et constitue le moyen de lutte de ces particules de densovirus à
l'encontre des lépidoptères ravageurs de culture.
Un septième objet de l'invention concerne une composition comprenant les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention comprend également un inducteur du promoteur lié de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour une toxine lorsque ledit promoteur est un promoteur inductible.
12 Un huitième objet de l'invention concerne une utilisation d'une composition telle que décrite précédemment en tant que moyen de lutte contre les lépidoptères.
Un neuvième objet de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes, ledit procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment sur les cultures de plantes.
De préférence, les plantes traitées selon ledit procédé de traitement sont le riz, maïs, coton, soja, sorgho, canne à sucre, tomate, poivron, luzerne.
De manière préférée, la séquence codant pour la toxine est sous le contrôle d'un promoteur inductible et le procédé de traitement des plantes selon l'invention comprend une étape d'épandage du composé inducteur dudit promoteur simultanément, antérieurement ou postérieurement à l'étape d'épandage des particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives telle que décrite précédemment.
Un neuvième objet de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes, ledit procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que décrites précédemment sur les cultures de plantes.
De préférence, les plantes traitées selon ledit procédé de traitement sont le riz, maïs, coton, soja, sorgho, canne à sucre, tomate, poivron, luzerne.
De manière préférée, la séquence codant pour la toxine est sous le contrôle d'un promoteur inductible et le procédé de traitement des plantes selon l'invention comprend une étape d'épandage du composé inducteur dudit promoteur simultanément, antérieurement ou postérieurement à l'étape d'épandage des particules de densovirus de Junonia coenia recombinantes et non réplicatives telle que décrite précédemment.
13 Exemple 1 Constructions Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant la séquence complète infectieuse du densovirus de Junonia coenia (JcDNV) (SEQ ID
N 7), à
savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Figure 1) (Jourdan et al., 1990, Virology, von 79, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université
d'Aix-Marseille II, pp153).
a) Constructions des plasmides de complémentation Les vecteurs de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur et/ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le plasmide porteur des gènes NS et VP sans les séquences ITRs, nommé plasmide pJA, est dérivé du plasmide pBRJ-H par délétion des régions terminales répétées inversées (ITRs) au niveau du site FspI (Li, 1993, Thèse de doctorat de l'Université
Montpellier II.
pp.124). Dans cette construction, les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) de JcDNV sont sous contrôle de leur propre promoteur, P9 et P93, respectivement.
Afin d'obtenir une construction portant uniquement les gènes non structuraux (NS), une délétion des gènes structuraux (VP) a été effectuée par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction BamHI et HpaI (position 38 pb à 2162 pb) puis par religation avec la T4 DNA ligase (INVITROGEN, USA), générant ainsi le plasmide pJAAVP (Figure 1.a).
De la même manière, un plasmide portant uniquement les gènes structuraux (VP) a été
obtenu en effectuant une délétion des gènes non structuraux (NS) par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction BsmI et KpnI (position 2732 pb à 5211 pb) générant le plasmide pJAANS (Figure 1.b).
b) Constructions du vecteur d'encapsidation Les régions terminales répétées inversées (ITRs) aux extrémités du génome viral sont vraisemblablement requises pour l'encapsidation. Différentes constructions portant un génome recombinant ont été développées afin de déterminer les séquences minimales ITRs nécessaires à l'encapsidation. Dans un premier temps, des constructions portant uniquement les ITRs, sont obtenues par digestion du plasmide pBRJ-H au niveau des sites BstEII
N 7), à
savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Figure 1) (Jourdan et al., 1990, Virology, von 79, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université
d'Aix-Marseille II, pp153).
a) Constructions des plasmides de complémentation Les vecteurs de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur et/ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le plasmide porteur des gènes NS et VP sans les séquences ITRs, nommé plasmide pJA, est dérivé du plasmide pBRJ-H par délétion des régions terminales répétées inversées (ITRs) au niveau du site FspI (Li, 1993, Thèse de doctorat de l'Université
Montpellier II.
pp.124). Dans cette construction, les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) de JcDNV sont sous contrôle de leur propre promoteur, P9 et P93, respectivement.
Afin d'obtenir une construction portant uniquement les gènes non structuraux (NS), une délétion des gènes structuraux (VP) a été effectuée par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction BamHI et HpaI (position 38 pb à 2162 pb) puis par religation avec la T4 DNA ligase (INVITROGEN, USA), générant ainsi le plasmide pJAAVP (Figure 1.a).
De la même manière, un plasmide portant uniquement les gènes structuraux (VP) a été
obtenu en effectuant une délétion des gènes non structuraux (NS) par digestion du plasmide pJA par les enzymes de restriction BsmI et KpnI (position 2732 pb à 5211 pb) générant le plasmide pJAANS (Figure 1.b).
b) Constructions du vecteur d'encapsidation Les régions terminales répétées inversées (ITRs) aux extrémités du génome viral sont vraisemblablement requises pour l'encapsidation. Différentes constructions portant un génome recombinant ont été développées afin de déterminer les séquences minimales ITRs nécessaires à l'encapsidation. Dans un premier temps, des constructions portant uniquement les ITRs, sont obtenues par digestion du plasmide pBRJ-H au niveau des sites BstEII
14 (position 337 pb à 6028 pb) ou BamHI (position 446 pb à 5920 pb), délétant ainsi la partie du génome viral codant pour les NS et les VP.
Par la suite, un premier vecteur recombinant a été construit par clonage d'une cassette d'expression A3GFP contenant le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) sous contrôle du promoteur Actine de Bombyx mon i A3 (SEQ ID N 6) au niveau des sites de restriction des enzymes BstEII et BamHI du plasmide pBRJ-H dont le génome viral a été
délété. La cassette d'expression A3GFP utilisée provient du plasmide pASA3-GFP, vecteur d'expression de lépidoptères (Bossin, 1998, Thèse de l'Université Montpellier II, pp. 240) (Figure 1.c). Le vecteur généré constitue ainsi un des génomes recombinant à
encapsider. Les constructions correspondantes sont nommées pITR-A3GFP-BstEII et pITR-A3GFP-BamHI.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la protéine fluorescente rouge, DsRed2, a été construit à partir du vecteur pITR-A3GFP-BstEII par délétion du gène rapporteur GFP au niveau des sites de restriction BamHI et Notl. Le gène DsRed2 a été amplifié, à partir du plasmide pDsRed2 (CLONTECH, USA), par PCR à
l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction BamHI et Notl puis inséré à la place du gène de la GFP. Cette construction a été nommée pITR-A3DsRed2-BstEII.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la neurotoxine du scorpion Androctonus australis (AaH-IT1) (SEQ ID N 5) obtenu à partir du plasmide pcD-Tox (Bougis et al., 1989) a été construit selon la même méthode que pour le vecteur pITR-A3DsRed2-BstEII. Le vecteur généré a été nommé pITR-A3AaH-IT1-BstEII.
Exemple 2 Lignée cellulaire et test de multi-transfection Les particules de JcDNV recombinants ont été produites par multi-transfection en cellules d'insectes. La lignée cellulaire d'insecte Lymantria dispar, IPLB-Ld 652 (Ld), (Goodwin et al., 1978, In vitro Vol.14, n 6, p:485-94; 1985, Techniques in the life sciences, cell biology," Vol. Cl, "techniques in setting up and maintenance of tissue and cell cultures."
Separate C109, 28 pp., Elsevier, County Clare, Ireland ou Techniques in the Life Sciences, Setting Up and Maintenance of Tissue and Cell Cultures, Elsevier Scientific Publishers Ireland, Ltd., (1985) pp. C109/1-C109/28), a été maintenue à 26 C en milieu de culture TC100 (Invitrogen, USA) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 1%
d'antibiotiques/antimycotiques (Sigma, USA).
Par la suite, un premier vecteur recombinant a été construit par clonage d'une cassette d'expression A3GFP contenant le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP) sous contrôle du promoteur Actine de Bombyx mon i A3 (SEQ ID N 6) au niveau des sites de restriction des enzymes BstEII et BamHI du plasmide pBRJ-H dont le génome viral a été
délété. La cassette d'expression A3GFP utilisée provient du plasmide pASA3-GFP, vecteur d'expression de lépidoptères (Bossin, 1998, Thèse de l'Université Montpellier II, pp. 240) (Figure 1.c). Le vecteur généré constitue ainsi un des génomes recombinant à
encapsider. Les constructions correspondantes sont nommées pITR-A3GFP-BstEII et pITR-A3GFP-BamHI.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la protéine fluorescente rouge, DsRed2, a été construit à partir du vecteur pITR-A3GFP-BstEII par délétion du gène rapporteur GFP au niveau des sites de restriction BamHI et Notl. Le gène DsRed2 a été amplifié, à partir du plasmide pDsRed2 (CLONTECH, USA), par PCR à
l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction BamHI et Notl puis inséré à la place du gène de la GFP. Cette construction a été nommée pITR-A3DsRed2-BstEII.
Le vecteur plasmidique recombinant contenant le gène codant pour la neurotoxine du scorpion Androctonus australis (AaH-IT1) (SEQ ID N 5) obtenu à partir du plasmide pcD-Tox (Bougis et al., 1989) a été construit selon la même méthode que pour le vecteur pITR-A3DsRed2-BstEII. Le vecteur généré a été nommé pITR-A3AaH-IT1-BstEII.
Exemple 2 Lignée cellulaire et test de multi-transfection Les particules de JcDNV recombinants ont été produites par multi-transfection en cellules d'insectes. La lignée cellulaire d'insecte Lymantria dispar, IPLB-Ld 652 (Ld), (Goodwin et al., 1978, In vitro Vol.14, n 6, p:485-94; 1985, Techniques in the life sciences, cell biology," Vol. Cl, "techniques in setting up and maintenance of tissue and cell cultures."
Separate C109, 28 pp., Elsevier, County Clare, Ireland ou Techniques in the Life Sciences, Setting Up and Maintenance of Tissue and Cell Cultures, Elsevier Scientific Publishers Ireland, Ltd., (1985) pp. C109/1-C109/28), a été maintenue à 26 C en milieu de culture TC100 (Invitrogen, USA) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 1%
d'antibiotiques/antimycotiques (Sigma, USA).
15 Les différentes réactions suivantes de co-transfection des cellules Ld ont été
réalisées avec le réactif de transfection Fugene HD (Roche Diagnostics, USA) selon les instructions du fournisseur :
- Bi-transfection avec le vecteur de complémentation pJA portant les gènes NS et VP et un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-IT1, selon un ratio de 1:1 ou 1:2;
- Tri-transfection avec les vecteurs de complémentation pJAANS porteur des gènes VP
et pJAAVP porteur des gènes NS ainsi qu'avec un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-IT1, selon un ratio de 1:1:1 ou 1:1:2.
L'efficacité de transfection a été déterminée par observation au microscope à
fluorescence des cellules Ld transfectées avec la construction pITR-A3GFP et a montré
qu'elle est au maximum de 30%.
Exemple 3 Production des particules de JcDNV
Quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à
5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175000 g dans un rotor Beckman SW4lti pendant 2h à 4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Afin de vérifier la présence et la concentration de particules virales, une partie de la précédente suspension est déposée sur une grille porte-objet afin de réaliser des colorations négatives (acide phosphotungstique 2%, pH 7.0).
Une étape de visualisation en Microscopie Electronique à Transmission (MET) a permis de confirmer la production de particules virales par les cellules.
Exemple 4 Caractérisation des particules virales de JcDNV
Afin de vérifier que l'ADN encapsidé correspond bien à la construction attendue (cassette d'expression A3GFP notamment), l'ADN viral a été extrait des particules virales puis digéré
par DpnI. Une étape d'amplification par PCR a par la suite été réalisée sur les ADN digérés en utilisant des amorces spécifiques de la cassette d'expression A3GFP, amorces sens : 5'-ATTTACTAAggTgTgCTCgAACAgT-3' (SEQ ID N 17) et amorce antisens: 5'-TACTTgTACAgCTCgTCCATgCCg-3' (SEQ ID N 18). Les résultats montrent une
réalisées avec le réactif de transfection Fugene HD (Roche Diagnostics, USA) selon les instructions du fournisseur :
- Bi-transfection avec le vecteur de complémentation pJA portant les gènes NS et VP et un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-IT1, selon un ratio de 1:1 ou 1:2;
- Tri-transfection avec les vecteurs de complémentation pJAANS porteur des gènes VP
et pJAAVP porteur des gènes NS ainsi qu'avec un vecteur recombinant d'encapsidation pITR-A3GFP ou pITR-A3DsRed2 ou pITR-A3AaH-IT1, selon un ratio de 1:1:1 ou 1:1:2.
L'efficacité de transfection a été déterminée par observation au microscope à
fluorescence des cellules Ld transfectées avec la construction pITR-A3GFP et a montré
qu'elle est au maximum de 30%.
Exemple 3 Production des particules de JcDNV
Quatre jours post-transfection, les cellules et les surnageants de culture ont été récoltés pour subir trois cycles de congélation/décongélation suivi d'un traitement ménager aux ultrasons. Par la suite, les surnageants sont clarifiés pendant 10 minutes à
5000 g, puis les particules virales sont concentrées par ultracentrifugation à 175000 g dans un rotor Beckman SW4lti pendant 2h à 4 C. Les particules virales sont resuspendues dans du PBS.
Afin de vérifier la présence et la concentration de particules virales, une partie de la précédente suspension est déposée sur une grille porte-objet afin de réaliser des colorations négatives (acide phosphotungstique 2%, pH 7.0).
Une étape de visualisation en Microscopie Electronique à Transmission (MET) a permis de confirmer la production de particules virales par les cellules.
Exemple 4 Caractérisation des particules virales de JcDNV
Afin de vérifier que l'ADN encapsidé correspond bien à la construction attendue (cassette d'expression A3GFP notamment), l'ADN viral a été extrait des particules virales puis digéré
par DpnI. Une étape d'amplification par PCR a par la suite été réalisée sur les ADN digérés en utilisant des amorces spécifiques de la cassette d'expression A3GFP, amorces sens : 5'-ATTTACTAAggTgTgCTCgAACAgT-3' (SEQ ID N 17) et amorce antisens: 5'-TACTTgTACAgCTCgTCCATgCCg-3' (SEQ ID N 18). Les résultats montrent une
16 amplification spécifique à partir de l'ADN extrait des particules virales et aucune amplification dans le contrôle plasmidique (pASA3-GFP) digéré par Dpnl. Ces résultats confirment que le génome recombinant a bien été amplifié et encapsidé dans des cellules transfectées.
Exemple 5 Analyse des virus recombinants Les suspensions de particules virales obtenues dans l'exemple 3 ont été
utilisées pour infecter des cellules Ld. Ainsi, des cellules Ld, cultivées en milieu TC100 complet, ont été préparées en plaque 96 puits de manière à être à 80% de confluence à 24h de culture. Le lendemain, le milieu de culture des cellules a été retiré et 50 1 de particules virales purifiées ont été
ajoutées. Les cellules sont incubées pendant 1h à 26 C avec l'inoculum. Par la suite, du milieu TC100 complet a été ajouté et les cellules sont maintenues dans une étuve à 26 C
jusqu'à observation.
Après infection, la fluorescence des cellules Ld a été contrôlée quotidiennement. Les résultats montrent que l'expression des gènes rapporteurs fluorescents (GFP et DsRed2) est détectée dès 4 jours post-infection dans environ 15% des cellules.
Exemple 6 Validation du caractère non réplicatif des particules virales Afin de confirmer le caractère non réplicatif des particules virales isolées, le surnageant de culture des cellules infectées dans l'exemple 5 a été récolté et soumis au même protocole que celui de l'exemple 3 (clarification, ultracentrifugation et resuspension du culot dans du PBS). Un volume de cette suspension a été utilisé pour infecter de nouvelles cellules Ld avec un protocole identique à celui utilisé dans l'exemple 4. De la même manière, la fluorescence des cellules Ld a été suivie de manière régulière après l'infection.
Les résultats n'ont montré aucune trace de fluorescence permettant de confirmer le caractère non réplicatif des particules obtenues.
Exemple 7 Transfert de gènes à des insectes ravageurs Pour confirmer l'efficacité des particules obtenues précédemment (cf exemple 3), celles-ci ont été injectées à des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion (début du 4ème stade de développement) à l'aide d'un micro-injecteur.
Plusieurs groupes de 10 à 15 larves, identifiés comme suit, ont été utilisés :
- Groupe GFP auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes codant pour la protéine GFP
Exemple 5 Analyse des virus recombinants Les suspensions de particules virales obtenues dans l'exemple 3 ont été
utilisées pour infecter des cellules Ld. Ainsi, des cellules Ld, cultivées en milieu TC100 complet, ont été préparées en plaque 96 puits de manière à être à 80% de confluence à 24h de culture. Le lendemain, le milieu de culture des cellules a été retiré et 50 1 de particules virales purifiées ont été
ajoutées. Les cellules sont incubées pendant 1h à 26 C avec l'inoculum. Par la suite, du milieu TC100 complet a été ajouté et les cellules sont maintenues dans une étuve à 26 C
jusqu'à observation.
Après infection, la fluorescence des cellules Ld a été contrôlée quotidiennement. Les résultats montrent que l'expression des gènes rapporteurs fluorescents (GFP et DsRed2) est détectée dès 4 jours post-infection dans environ 15% des cellules.
Exemple 6 Validation du caractère non réplicatif des particules virales Afin de confirmer le caractère non réplicatif des particules virales isolées, le surnageant de culture des cellules infectées dans l'exemple 5 a été récolté et soumis au même protocole que celui de l'exemple 3 (clarification, ultracentrifugation et resuspension du culot dans du PBS). Un volume de cette suspension a été utilisé pour infecter de nouvelles cellules Ld avec un protocole identique à celui utilisé dans l'exemple 4. De la même manière, la fluorescence des cellules Ld a été suivie de manière régulière après l'infection.
Les résultats n'ont montré aucune trace de fluorescence permettant de confirmer le caractère non réplicatif des particules obtenues.
Exemple 7 Transfert de gènes à des insectes ravageurs Pour confirmer l'efficacité des particules obtenues précédemment (cf exemple 3), celles-ci ont été injectées à des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion (début du 4ème stade de développement) à l'aide d'un micro-injecteur.
Plusieurs groupes de 10 à 15 larves, identifiés comme suit, ont été utilisés :
- Groupe GFP auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes codant pour la protéine GFP
17 - Groupe DsRed auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes codant pour la protéine DsRed2 - Groupe AaH-IT1 auquel a été injecté 10 I de particules recombinantes codant pour la toxine de scorpion AaH-IT1 - Groupe contrôle positif auquel a été injecté 10 1 de particules de JcDNV
sauvages purifiées, produites après transfection de cellules Ld avec le plasmide infectieux pBRJ-H
- Groupe contrôle négatifauquel a été injecté 10 1 de PBS.
Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26 C, pendant 6 jours. Un suivi du poids et de la mortalité a été
réalisé
quotidiennement. Les larves mortes au cours de l'expérience ont été stockées à
-20 C pour des analyses ultérieures.
A 6 jours post-infection (PI), les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte à l'aide d'une aiguille de diamètre 0,2 mm. L'hémolymphe de chaque larve a été
récupérée et mise en culture en plaque 96 puits avec 100 1 de milieu de culture TC100, 1 %
antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été
observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence.
a) Délivrance dans l'insecte des particules recombinantes GFP et DsRed Les hémocytes des larves des groupes GFP, DsRed, contrôle positif et négatif ont été
observés au microscope à fluorescence dès 4h après la mise en culture (6 jours PI). Un signal fluorescent vert et rouge a été observé dans certains hémocytes des larves injectées avec les particules codant la GFP et la DsRed, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée chez les contrôles positif et négatif Après dissection, les tissus ont été montés sur lames et observés au microscope à
fluorescence. Une fluorescence spécifique verte et rouge est observée dans les trachées des larves infectées respectivement par les particules recombinantes GFP et DsRed.
Aucune fluorescence spécifique n'est observée dans les trachées des larves des groupes contrôles positif et négatif b) Effet pathogène des particules recombinantes AaH-IT1
sauvages purifiées, produites après transfection de cellules Ld avec le plasmide infectieux pBRJ-H
- Groupe contrôle négatifauquel a été injecté 10 1 de PBS.
Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26 C, pendant 6 jours. Un suivi du poids et de la mortalité a été
réalisé
quotidiennement. Les larves mortes au cours de l'expérience ont été stockées à
-20 C pour des analyses ultérieures.
A 6 jours post-infection (PI), les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte à l'aide d'une aiguille de diamètre 0,2 mm. L'hémolymphe de chaque larve a été
récupérée et mise en culture en plaque 96 puits avec 100 1 de milieu de culture TC100, 1 %
antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été
observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence.
a) Délivrance dans l'insecte des particules recombinantes GFP et DsRed Les hémocytes des larves des groupes GFP, DsRed, contrôle positif et négatif ont été
observés au microscope à fluorescence dès 4h après la mise en culture (6 jours PI). Un signal fluorescent vert et rouge a été observé dans certains hémocytes des larves injectées avec les particules codant la GFP et la DsRed, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée chez les contrôles positif et négatif Après dissection, les tissus ont été montés sur lames et observés au microscope à
fluorescence. Une fluorescence spécifique verte et rouge est observée dans les trachées des larves infectées respectivement par les particules recombinantes GFP et DsRed.
Aucune fluorescence spécifique n'est observée dans les trachées des larves des groupes contrôles positif et négatif b) Effet pathogène des particules recombinantes AaH-IT1
18 Les larves du groupe contrôle positif, auxquelles ont été injecté le JcDNV
natif, sont mortes dès J+3 et jusqu'à J+6 PI (98 % de mortalité). Peu de mortalité (15 %) a été observée chez les larves du groupe AaH-IT1 auxquelles ont injectées des particules recombinantes codant pour la toxine de scorpion. Le développement des larves a été altéré
(mues et prise de poids). En effet, nous avons observé une différence significative (test t student, p < 0,005) entre le poids des larves du groupe contrôle négatif et celui des larves du groupe AaH-IT1.
Aucune mortalité n'a par ailleurs été observée dans le groupe contrôle négatif Exemple 8 Vérification du caractère non réplicatif in vivo Les larves infectées avec les particules recombinantes ont été sacrifiées à 6 jours post-infection. La partie restante des larves, stockée à -20 C, a été broyée dans du PBS. Les surnageants ont été clarifiés 10 minutes à 5000 g puis injectés à raison de 10 tl dans des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion à
l'aide d'un micro-injecteur. Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26 C, pendant 6 jours.
A 6 jours post-infection, les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte et l'hémolymphe de chaque larve a été mise en culture en plaque 96 puits avec 100 I de milieu de culture TC100, 1 % antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence.
Aucune fluorescence n'a été observée dans les hémocytes et les trachées des larves injectées avec les broyats clarifiés de larves positives en primo-infection.
Exemple 9 Production de particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus Le système d'expression Baculovirus est communément employé pour la production de grandes quantités de protéines recombinantes en raison de sa facilité
d'utilisation et de son haut niveau d'expression. Le principe de production des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus repose sur:
i) le clonage des séquences d'intérêts du Densovirus dans un vecteur d'expression commercialement disponible, pFastBacTM1, ii) la production de Baculovirus recombinants en utilisant le système Bac-to-Bac (Baculovirus Expression System, INVITROGEN, USA) et enfin
natif, sont mortes dès J+3 et jusqu'à J+6 PI (98 % de mortalité). Peu de mortalité (15 %) a été observée chez les larves du groupe AaH-IT1 auxquelles ont injectées des particules recombinantes codant pour la toxine de scorpion. Le développement des larves a été altéré
(mues et prise de poids). En effet, nous avons observé une différence significative (test t student, p < 0,005) entre le poids des larves du groupe contrôle négatif et celui des larves du groupe AaH-IT1.
Aucune mortalité n'a par ailleurs été observée dans le groupe contrôle négatif Exemple 8 Vérification du caractère non réplicatif in vivo Les larves infectées avec les particules recombinantes ont été sacrifiées à 6 jours post-infection. La partie restante des larves, stockée à -20 C, a été broyée dans du PBS. Les surnageants ont été clarifiés 10 minutes à 5000 g puis injectés à raison de 10 tl dans des larves de noctuelle Spodoptera frugiperda âgées de 7 jours après éclosion à
l'aide d'un micro-injecteur. Après injection, les larves ont été nourries sur milieu artificiel et maintenues dans une étuve à 26 C, pendant 6 jours.
A 6 jours post-infection, les hémocytes ont été prélevés au niveau d'une fausse patte et l'hémolymphe de chaque larve a été mise en culture en plaque 96 puits avec 100 I de milieu de culture TC100, 1 % antibiotiques et 0,03 M PTU (N-phenylthiourea). Les hémocytes ont été observés dès 4h post-culture au microscope à fluorescence.
Après récupération des hémocytes, les larves ont été en partie disséquées de manière à
isoler les différents tissus suivants : l'intestin, les trachées, les ganglions nerveux et l'épiderme. Les différents organes ont été observés directement au microscope à fluorescence.
Aucune fluorescence n'a été observée dans les hémocytes et les trachées des larves injectées avec les broyats clarifiés de larves positives en primo-infection.
Exemple 9 Production de particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus Le système d'expression Baculovirus est communément employé pour la production de grandes quantités de protéines recombinantes en raison de sa facilité
d'utilisation et de son haut niveau d'expression. Le principe de production des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs en système d'expression Baculovirus repose sur:
i) le clonage des séquences d'intérêts du Densovirus dans un vecteur d'expression commercialement disponible, pFastBacTM1, ii) la production de Baculovirus recombinants en utilisant le système Bac-to-Bac (Baculovirus Expression System, INVITROGEN, USA) et enfin
19 iii) la purification des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs néoformées.
Selon le même principe que développé initialement, à savoir la multi-transfection de cellules d'insectes par trois plasmides portant les gènes structuraux, non structuraux et le génome recombinant, trois Baculovirus recombinants seront produits et serviront à la multi-infection de cellules d'insectes.
1) Constructions Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant la séquence complète infectieuse du Densovirus de Junonia coenia (JcDNV), à
savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Jourdan et al., 1990, Virology, vol.179, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université d'Aix-Marseille II, pp153 a- Constructions des vecteurs d'expression portant les séquences de complémentation Les vecteurs d'expression dit de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le vecteur d'expression porteur des gènes NS sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-NS, est obtenu après amplification par PCR des séquences NS incluant le promoteur homologue P93, à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction NotI et XhoI (séquences soulignées) :
P93 NS_pFastBAC F = 5'-ATAAgCggCCgTTATTgTgACCTCgTTTgA-3' (SEQ ID
N 19) et NS_pBAC_R = 5'-CCgCTCgAgTTAAAATgTAATATTATATTTACTCAATAAA-3'(SEQ ID N 20).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites NotI-XhoI du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTm 1 . L'expression des gènes non structuraux (NS) est faite sous contrôle du promoteur homologue P93.
Le vecteur d'expression porteur des gènes VP sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-VP, a été obtenu après amplification par PCR des séquences VP, à
l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction Notl et Xhol (séquences soulignées) :
VP_pFastBAC_F = 5'- ATAAgCggCCgCATgTCTTTCTACACggCCgggT -3' (SEQ ID
N 21) et
Selon le même principe que développé initialement, à savoir la multi-transfection de cellules d'insectes par trois plasmides portant les gènes structuraux, non structuraux et le génome recombinant, trois Baculovirus recombinants seront produits et serviront à la multi-infection de cellules d'insectes.
1) Constructions Toutes les constructions réalisées sont dérivées du plasmide pBRJ-H contenant la séquence complète infectieuse du Densovirus de Junonia coenia (JcDNV), à
savoir les gènes structuraux (VP) et non structuraux (NS) délimités de part et d'autre par les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en 5' et 3' (Jourdan et al., 1990, Virology, vol.179, p:403-409; Rolling, 1992, Thèse de doctorat de l'université d'Aix-Marseille II, pp153 a- Constructions des vecteurs d'expression portant les séquences de complémentation Les vecteurs d'expression dit de complémentation portent les gènes structuraux (VP) sous le contrôle d'un promoteur ou les gènes non structuraux (NS) également sous le contrôle d'un promoteur sans toutefois porter les séquences ITRs.
Le vecteur d'expression porteur des gènes NS sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-NS, est obtenu après amplification par PCR des séquences NS incluant le promoteur homologue P93, à l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction NotI et XhoI (séquences soulignées) :
P93 NS_pFastBAC F = 5'-ATAAgCggCCgTTATTgTgACCTCgTTTgA-3' (SEQ ID
N 19) et NS_pBAC_R = 5'-CCgCTCgAgTTAAAATgTAATATTATATTTACTCAATAAA-3'(SEQ ID N 20).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites NotI-XhoI du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTm 1 . L'expression des gènes non structuraux (NS) est faite sous contrôle du promoteur homologue P93.
Le vecteur d'expression porteur des gènes VP sans les séquences ITRs, nommé
pFastBac-VP, a été obtenu après amplification par PCR des séquences VP, à
l'aide d'amorces intégrant les sites de restriction Notl et Xhol (séquences soulignées) :
VP_pFastBAC_F = 5'- ATAAgCggCCgCATgTCTTTCTACACggCCgggT -3' (SEQ ID
N 21) et
20 VP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAgTTAAACgTTACCAATAgTAgCTCCA -3'(SEQ ID
N 22).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites Notl-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTml.
L'expression des gènes structuraux (VP) a été faite sous contrôle du promoteur hétérologue fort polyhédrine (pin-i).
b- Constructions du vecteur d'expression portant le génome à encapsider Le vecteur d'expression, nommé pFastBac-ITR-A3GFP, porte les régions ITRs de JcDNV encadrant la cassette d'expression A3-GFP. Cette construction dérive du plasmide pITR-A3GFP-BstEII déjà décrit. Ainsi la séquence incluant les régions ITRs et la cassette d'expression a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces intégrant les sites EcoRI et Xhol (séquences soulignées) :
A3GFP_pFastBAC_F = 5'- CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC -3' (SEQ ID N 23) et A3GFP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg -3' (SEQ ID
N 24).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites EcoR1-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTml.
Les vecteurs d'expression pFastBac-NS, pFastBac- VP et pFastBac-ITR-A3GFP ont été transformées en cellules compétentes DH10Bac afin de générer les Bacmides recombinants (BAC-NS, BAC-VP et BAC-ITRA3GFP).
2) Production des Baculovirus recombinants Des premiers stocks viraux à faible titre sont générés par transfection de cellules d'insectes, Sf9, avec l'ADN des bacmides recombinants. L'expression des protéines NS, VP
et GFP est évaluée par Western-Blot.
L'amplification des Baculovirus recombinants et la génération de stocks viraux à haut titre sont effectuées à partir des stocks à faible titre par passage en séries en cellules d'insectes. Le titre viral de chaque Baculovirus recombinant est également estimé par PCR
quantitative puis confirmer par dosage en plaque.
N 22).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites Notl-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTml.
L'expression des gènes structuraux (VP) a été faite sous contrôle du promoteur hétérologue fort polyhédrine (pin-i).
b- Constructions du vecteur d'expression portant le génome à encapsider Le vecteur d'expression, nommé pFastBac-ITR-A3GFP, porte les régions ITRs de JcDNV encadrant la cassette d'expression A3-GFP. Cette construction dérive du plasmide pITR-A3GFP-BstEII déjà décrit. Ainsi la séquence incluant les régions ITRs et la cassette d'expression a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces intégrant les sites EcoRI et Xhol (séquences soulignées) :
A3GFP_pFastBAC_F = 5'- CCgGAATTCCgTgTATgAAATCTAACAATgCgCTC -3' (SEQ ID N 23) et A3GFP_pFastBAC_R = 5'- CCgCTCgAggTACTgCCgggCCTCTTgCgggATg -3' (SEQ ID
N 24).
Le fragment obtenu a été inséré au niveau des sites EcoR1-Xhol du site de multi-clonage du vecteur d'expression pFastBacTml.
Les vecteurs d'expression pFastBac-NS, pFastBac- VP et pFastBac-ITR-A3GFP ont été transformées en cellules compétentes DH10Bac afin de générer les Bacmides recombinants (BAC-NS, BAC-VP et BAC-ITRA3GFP).
2) Production des Baculovirus recombinants Des premiers stocks viraux à faible titre sont générés par transfection de cellules d'insectes, Sf9, avec l'ADN des bacmides recombinants. L'expression des protéines NS, VP
et GFP est évaluée par Western-Blot.
L'amplification des Baculovirus recombinants et la génération de stocks viraux à haut titre sont effectuées à partir des stocks à faible titre par passage en séries en cellules d'insectes. Le titre viral de chaque Baculovirus recombinant est également estimé par PCR
quantitative puis confirmer par dosage en plaque.
21 3) Production des Densovirus recombinants non réplicatifs par multi-infection de cellules d'insectes, Sf9, avec les trois Baculovirus recombinants Les stocks de Baculovirus recombinants à haut titre sont utilisés pour multi-infectées des cellules d'insectes Sf9. Des particules de Densovirus recombinants non réplicatifs ainsi que des Baculovirus sont produits lors de cette infection.
La purification des particules de DNVs est effectuée par la chaleur. En effet, les Baculovirus sont des virus enveloppés et donc peu résistant à la chaleur contrairement aux Densovirus qui sont des virus non enveloppées. Ce procédé de purification est utilisé en routine par les équipes du GENETHON. Une fois la purification effectuée les particules produites sont caractérisées et validées selon le même procédé qu'utilisé
précédemment.
La purification des particules de DNVs est effectuée par la chaleur. En effet, les Baculovirus sont des virus enveloppés et donc peu résistant à la chaleur contrairement aux Densovirus qui sont des virus non enveloppées. Ce procédé de purification est utilisé en routine par les équipes du GENETHON. Une fois la purification effectuée les particules produites sont caractérisées et validées selon le même procédé qu'utilisé
précédemment.
Claims (11)
1. Un vecteur comprenant :
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N o1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N o3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides;
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' comprenant au moins les nucléotides 1 à 149 de la séquence SEQ ID N o1, la longueur de ladite séquence ITR en 5' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à
un promoteur, ladite séquence nucléotidique codant pour une toxine ; et (iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' comprenant au moins les nucléotides 369 à 518 de la séquence SEQ ID N o3, la longueur de ladite séquence ITR en 3' étant inférieure ou égale à 259 nucléotides;
Ledit vecteur ne comprenant pas d'autres séquences nucléotidiques virales de densovirus de Junonia coenia que les séquences ITRs selon (i) et (iii).
2. Le vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que la toxine est choisie parmi des polypeptides toxiques ou des molécules d'acide nucléique telles que les siRNA ou miRNA.
3. Une méthode de production de particules de densovirus de Junonia coenia (JcDNV) recombinants et non réplicatifs, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
1) transformation d'au moins une cellule d'insectes avec :
a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à
un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et (ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à
un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV, (iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en S'et en 3' du vecteur selon l'une des revendications 1 ou 2.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
1) transformation d'au moins une cellule d'insectes avec :
a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à
un promoteur, de préférence le promoteur P9 de JcDNV, et (ii) les séquences nucléotidiques codant pour les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, lesdites séquences nucléotidiques étant liées de manière opérationnelle à
un promoteur, de préférence le promoteur P93 de JcDNV, (iii) Ledit au moins second vecteur ne comprenant pas les séquences terminales répétées inversées (ITRs) en S'et en 3' du vecteur selon l'une des revendications 1 ou 2.
2) récolte des particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs.
4. La méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques codant pour :
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et (ii) les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, sont portées par au moins deux vecteurs de complémentation distincts.
(i) les protéines structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, et (ii) les protéines non structurales NS1, NS2 et NS3 du densovirus de Junonia coenia ou leurs dérivés, sont portées par au moins deux vecteurs de complémentation distincts.
5. Une cellule transformée par :
a) un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis dans l'une des revendications 3 ou 4.
a) un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, b) un ou plusieurs vecteurs de complémentation tels que définis dans l'une des revendications 3 ou 4.
6. Un kit pour la production de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs par la méthode selon l'une des revendications 3 ou 4 comprenant :
a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation tel que défini dans la revendication 3.
a) Un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
b) Au moins un second vecteur de complémentation tel que défini dans la revendication 3.
7. Une particule de densovirus de Junonia coenia recombinant et non réplicatif susceptible d'être obtenue par la méthode de production selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 et constituée d'une capside qui contient une séquence nucléotidique comprenant:
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie dans la revendication 1 ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, telle que définie dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
(iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie dans la revendication 1.
(i) En position 5', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 5' telle que définie dans la revendication 1 ;
(ii) En position centrale, une séquence nucléotidique liée de manière opérationnelle à un promoteur, telle que définie dans l'une des revendications 1 ou 2 ;
(iii)En position 3', une séquence nucléotidique terminale répétée inversée (ITR) en 3' telle que définie dans la revendication 1.
8. Une utilisation de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants et non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7 en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
9. Une composition comprenant les particules de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7.
10. Une utilisation de la composition telle que définie dans la revendication 9 en tant qu'agent de lutte contre les lépidoptères.
11. Un procédé de traitement des plantes, ledit procédé comprenant une étape d'épandage de particules de densovirus de Junonia coenia recombinants non réplicatifs tels que définies dans la revendication 7 ou tels qu'obtenues par la méthode selon l'une des revendications 3 ou 4.
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| FR2678948B1 (fr) * | 1991-07-11 | 1994-09-09 | Agronomique Inst Nat Rech | Nouveaux vecteurs d'expression et d'integration derives des densovirus, et leurs applications. |
| CN1172435A (zh) * | 1994-09-23 | 1998-02-04 | 综合医院公司 | 使用非哺乳动物dna病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20151103 |