JPH10509596A

JPH10509596A - 組み換えバキュロウイルス殺虫剤

Info

Publication number: JPH10509596A
Application number: JP8535027A
Authority: JP
Inventors: マツカツチエン，ビリー・フレツド
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1995-05-17
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 1998-09-22
Anticipated expiration: 2016-05-16
Also published as: CN1102659C; JP3252854B2; NZ308772A; AU723612B2; WO1996036712A1; TR199701366T1; MX9708798A; US6096304A; EP0826047B1; AU5865196A; CN1184504A; EP0826047A1; BR9608741A

Abstract

(57)【要約】本発明は昆虫選択的神経毒をコードする遺伝子の至適な発現を提供するよう操作されている組み換えバキュロウイルスに関する。より特定しては、本発明は、レイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquestriatus hebraeus)由来のサソリ毒ＬｑｈＩＴ２をコードする単離された核酸配列に関する。ここで前述の配列は核多核体ウイルスに感染した細胞での遺伝子発現のために至適化されている。本発明はまた、コドンを至適化されたＬｑｈＩＴ２ヌクレオチド配列を含むキメラ遺伝子、コドンを至適化された昆虫選択的神経毒（例えばＬｑｈＩＴ２毒素遺伝子）を発現する組み換えバキュロウイルスを含む殺虫組成物、および、ＬｑｈＩＴ２毒素のような昆虫選択的神経毒をコードするコドンを至適化された核酸配列を含有する昆虫バキュロウイルスの適用を含む作物学的および非作物学的の双方の環境での昆虫の制御方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えバキュロウイルス殺虫剤発明の背景化学的殺虫剤は現代の農業の絶対不可欠な構成要素であり、また、害虫を制御することにより作物の損傷を減少させるための有効な手段を提供している。しかしながら、化学的作用物質は、環境の汚染、作物の害虫の抵抗性の集団の選択、および、益虫、水棲生物体、動物およびヒトのような非標的生物体に対する毒性の可能性により、継続的に検査されている。結果として、有効かつその上、非標的集団および環境に対し温和である、昆虫制御のための代替の戦略が探し求められている。これらの戦略のひとつは、標的昆虫集団の天然に存在する病原体である微生物の使用を含む。しかしながら、有望な昆虫制御剤とみられる多くの候補の昆虫病原体は、農民および農業関連産業のその他の者が慣れ親しんできた古典的な化学的殺虫剤の特性を欠く。例えば、バキュロウイルス科からの昆虫特異的なウイルスは、宿主特異性および不活性の環境的特性を包含するいくつかの好都合な属性を保有するが、しかし、作物の重大な損傷が起こる前に標的集団を迅速に制御する能力を欠く。幸運なことに、現代の分子生物学は、現代の農業の必要性を満足するためにこれらの特性の多くを都合よく改変するのに必要な手段を提供する。バキュロウイルスは無脊椎動物に対し病原性のウイルスであり、また、80から 200キロ塩基までの大きさにわたる二本鎖の環状ＤＮＡゲノムの保有により特徴づけられる。バキュロウイルスは、非閉塞バキュロウイルス（ＮＯＶ）、グラニュロ−シスウイルス（ＧＶ）および核多角体ウイルス（ＮＰＶ）を包含する３個の亜科に分けられる。ＮＯＶの例は、オルシテスリノセロス(Orcytes rhinoceros)ＮＯＶおよびヘリコヴェルパゼア(Helicoverpa zea)ＮＯＶである。ＧＶの例は、コナガ(Plutella xylostella) ＧＶ、シディアポモネラ(Cydia pomonella)ＧＶ、ピエリスブラッシケ(Pier is brassicae)ＧＶ、およびイラクサキンウワバ(Trichoplusia ni)ＧＶを包含する。ＮＰＶの例は、アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica) ＮＰＶ、シロイチモンジヨトウ(Spodoptera exigua)ＮＰＶ、ヘリオティスアルミゲラ(Helithis armigera)ＮＰＶ、ヘリコヴェルパゼア(Helicoverpa zea) ＮＰＶ、シロイチモンジヨトウ(Spodoptera frugiperda)ＮＰＶ、トリコプルシア属(Trichoplusia)のＮＰＶ、ヨトウガ(Mamestra brassicae)ＮＰＶ、リマントリアディスパー(Lymantria dispar)ＮＰＶ、ハスモンヨトウ(Spodoptera litt uralis)ＮＰＶ、シングラファファシフェラ(Syngrapha facifera)ＮＰＶ、コリストネウラフミフェラナ(Choristoneura fumiferana)ＮＰＶ、アンティカルシアゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)ＮＰＶ、およびヘリオティスヴィレセンス(Heliothis virescens)ＮＰＶを包含する。ある種ＧＶ類およびＮＯＶ類は注意深く研究されているとは言え、ＮＰＶ類はバキュロウイルス亜科のうち最も入念に特徴づけられる。ＮＰＶの感染サイクルは２種のビリオンを伴う。昆虫細胞の感染の後、出芽されたビリオン（ＢＶもしくは細胞外性ウイルス、ＥＣＶ）が、ヌクレオキャプシドの原形質膜への動きに際して産生される。これらのビリオンはそれらの核由来のコートを細胞質に脱ぎ捨て、そして原形質膜を通って昆虫宿主の血体腔中に出芽する。この過程は宿主昆虫の全身性の感染症につながる。感染過程のより後で、ビリオンは、本質的にポリヘドリンタンパク質から成るタンパク質マトリックス内に閉塞され（閉塞ビリオン）、かようにポリヘドリン封入体（ＰＩＢもしくは閉塞体、ＯＢ）を形成する。これらの封入体は経口で感染するウイルスの形態であり、また、昆虫宿主間のウイルスの水平伝播を提供する(1,2)。感染していない幼虫はウイルスに汚染された基質を常食としそしてＰＩＢを摂取する。タンパク質性マトリックスは、多くの鱗翅目の幼虫で見出される昆虫の中腸の塩基性のｐＨの作用により可溶化される。ウイルスＤＮＡゲノムを含有する、遊離されたビリオンのヌクレオキャプシドは、幼虫の中腸の上皮細胞に付着しかつ感染させる。典型的には、感染した昆虫は発達し続けかつ植物材料を消費し続けるであろう一方、ウイルスは宿主内で指数的に増殖する。徐々に、しばしば数週間もしくはより長く経過した後に、感染した幼虫は完全に混乱したようになりそして死ぬであろう。バキュロウイルスの魅力的な属性はそれらの狭い宿主特異性である。これらのウイルスは節足動物にのみ感染し、そして特定の昆虫目内でさえ比較的狭い宿主範囲を保有する。宿主特異性は、電子顕微鏡、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび組み換えＤＮＡ技術により検査されている(3-5)。これらの研究は、狭い宿主範囲は、少なくとも部分的には、ウイルスＤＮＡを哺乳動物細胞核内に移送するバキュロウイルスの無能力によることを指摘する。部分的に、有効な細胞培養系および容易なクローニングベクターの入手可能性により、ＮＰＶは所望の異種性タンパク質の合成のための真核生物発現ベクターとして利用されている(6,7)。とりわけひとつのウイルス、アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）は、バキュロウイルス発現系での異種性遺伝子の導入および発現に利用される、許容されたモデルウイルスである。このウイルスは、真核生物の発現系での組み換えタンパク質の高収量を提供する重要なインビトロの手段としてルーチンで使用され、かように、発現されたタンパク質の適切な翻訳後改変を提供するとは言え、ＡｃＮＰＶは、重要な経済上の(economic)害虫となる鱗翅目の昆虫の多くの科を感染させることが可能である。バキュロウイルスに基づく害虫制御剤の潜在的な実用上の利点にもかかわらず、多様な欠点が現代の農業でのそれらの使用を奪っている。条植え作物の農業でのこれらのウイルスのより広まった使用に対する最も大きな障壁は、それらの適用と宿主昆虫により引き起こされる作物損傷の有効な制御との間の大きな時間的遅延である。古典的な化学的殺虫剤の適用に際して観察される迅速な効果と異なり、有効な野生型バキュロウイルス媒介性の昆虫制御は、インビボのウイルス集団が宿主活動性を危険に曝すのに十分高いレベルに到達した後にのみ起こる。しかしながら、組み換えＤＮＡ技術の使用により、ＮＰＶは、殺虫性タンパク質の発現を支配する遺伝子の導入もしくはウイルスゲノムからの遺伝子の欠失のいずれかにより、昆虫を殺すそれらの速度を増加させるよう、遺伝子的に操作されている(8-10)。最も有効な組み換えＮＰＶは昆虫選択的神経毒を発現するよう操作されている(11-18)。これらの組み換えウイルスは、野生型ＮＰＶより20〜30％少ない時間でそれらの宿主を殺す。今や、以前に構築された組み換えＮＰＶより有意により大きな能力を有する組み換えＮＰＶが構築されている。これらの組み換えＮＰＶは、サソリレイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus qui nquestriatus hebraeus)の昆虫選択的毒素ＬｑｈＩＴ２をコードする異種性遺伝子を発現するよう操作されている(19,20)。本研究に基づき、この合成遺伝子をもつ組み換えＮＰＶは、当該ウイルスの殺虫特性での大きな増大を提供する。発明の要約本発明は、昆虫選択的神経毒をコードする遺伝子の至適な発現を提供するよう操作されている組み換えバキュロウイルスに関する。より特定しては、本発明は、レイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquestriatus h ebraeus)由来のサソリ毒ＬｑｈＩＴ２をコードする単離された核酸配列に関する。この中で、前述の配列は核多角体ウイルスが感染した細胞での遺伝子発現のために至適化されている。本発明はまた、コドンが至適化されたＬｑｈＩＴ２ヌクレオチド配列を含むキメラ遺伝子、コドンが至適化された、ＬｑｈＩＴ２毒素遺伝子のような昆虫選択的神経毒を発現する組み換えバキュロウイルスを含む殺虫組成物、ならびに、コドンが至適化された、ＬｑｈＩＴ２毒素遺伝子のような昆虫選択的神経毒を含有する昆虫のバキュロウイルスの応用を含む作物学的および非作物学的双方の環境での昆虫の制御方法にも関する。本発明の昆虫のバキュロウイルスは、核多角体ウイルス、一個でもしくは多数で閉塞された核多角体ウイルスおよびグラニュロ−シスウイルスの群から選択される。好ましいバキュロウイルスは多ヌクレオキャプシド核多角体ウイルス群から選択される。アウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)多ヌクレオキャプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）がとりわけ好ましい。本発明はＬｑｈＩＴ２タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。この中で、コドンの選択は、十分に特徴づけられた核多角体ウイルスタンパク質、ポリヘドリンおよびいくつかの鱗翅目のタンパク質をコードする遺伝子でのコドン利用の観察結果により決定されるように、核多角体ウイルスおよびそれらの複製を支持する細胞により好まれるコドンに偏らされる。生じる遺伝子構築物は、合成ＬｑｈＩＴ２遺伝子をもつ組み換えバキュロウイルスに感染した細胞でのＬｑｈＩＴ２の有効な発現を提供する。これらの組み換えウイルスのヘリオティスヴィレセンス(Heliothis virescens)への適用は、処理された幼虫の迅速な麻痺をもたらす。さらに、コドンを偏らせた遺伝子を含有するウイルスは、ＬｑｈＩＴ２遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のコピーを含有するウイルスより迅速にそれらの昆虫宿主を殺す。図面の簡単な説明、生物学的寄託および配列表第１図。レイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquest riatus hebraeus)からのＬｑｈＩＴ２遺伝子のｃＤＮＡ配列（ＬｑｈＩＴｃＤＮＡ）、およびＬｑｈＩＴ２をコードするコドンを偏らせた合成構造遺伝子（ＬｑｈＩＴＮＰＶ）の整列。太字は遺伝子発現を容易にするために導入された、ｃＤＮＡ配列への不活動のヌクレオチド変化を示す。第２図。ＬｑｈＩＴ２遺伝子のコドンを偏らせた形態を構築するのに使用された合成オリゴヌクレオチドの配列。オリゴヌクレオチドＬｑ１はボンビキシンのシグナルペプチドをコードする。オリゴヌクレチドＬｑ１およびＬｑ１０は合成遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーとして使用された。第３図。ＬｑｈＩＴ２遺伝子のコドンを偏らせた形態の調製に採用された戦略の図解的表示。オリゴヌクレチドＬｑ１およびＬｑ１０（「Ｘ」で印をつけられた）はＰＣＲ反応の増幅プライマーとしてはたらいた。唯一の制限酵素切断部位が示されている。第４図。コドンを偏らせたＬｑｈＩＴ２遺伝子のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の配列。ヌクレオチド配列の下の一対の文字（アミノ酸１−19をコードするヌクレオチド１−57）はボンビキシンのシグナルペプチドをコードするヌクレオチドを示す。第５図。ｐＴＺ１８Ｒ．ＬｑｈＩＴ２（コドンを偏らせた合成ＬｑｈＩＴ２遺伝子を含む中間クローニングベクター）、ｐＡｃＵＷ２１（バキュロウイルス伝達ベクター）、および、コドンを偏らせた合成ＬｑｈＩＴ２遺伝子を含むバキュロウイルス伝達ベクターである、プラスミドｐＡｃＵＷ２１．ＬｑｈＩＴ２の派生物のプラスミド地図。第６図。ＡｃＬｑｈＩＴ２およびコントロールのウイルスで処理されたＨ．ヴィレセンス(H．virescens)の３齢の幼虫の死亡率に対する時間（致死時間）のグラフの表示。第７図。野生型および組み換えバキュロウイルスで処理されたＨ．ヴィレセンス(H．virescens)の幼虫による植物破壊の阻害（すなわち植物保護）のグラフの表示。データはコントロール（荒らされない）植物に関しての残存する葉材料のパーセントとして報告される。本発明はさらに、ブダペスト条約の条件のもと、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ）、12301 パークローンドライヴ(Parklawn Drive)、メリーランド州ロックヴィル、20 852、に寄託され、そして以下の受託番号をもつ、組み換えバキュロウイルスをさらに含む：出願人は、「特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸の配列標準的表示規則(Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Amino Acid sequences in Patent Applications)」（ＥＰＯ会長の決定への付属書類ＩおよびII(Annexes I and II to the Decisio n of the President of the EPO)、ＯＪＥＰＯに対する補遺No.２に発表された、1992年12月）、ならびに、Ｃ．Ｆ．Ｒ．1.821-1.825ならびに付録ＡおよびＢ（「ヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸の配列を含有する出願開示のための必要事項(Requirements for Application Disclosures Containing Nucleotid es and/or Amino Acid Sequences)」）に従って、13個の配列表を提供している。発明の詳細な説明本開示の文脈において多数の用語および略語が使用される。「ＮＰＶ」は核多角体ウイルスを表す。「ＰＩＢ」はポリヘドリン封入体である。「ＡｃＮＰＶ」は野生型のアウトグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体ウイルスを表す。「ＬｑｈＩＴ２」は、レイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquestriatus hebraeus)由来の昆虫選択的神経毒を表す。「ＡａＩＴ」はアンドロクトヌスアウストラリス(Androctonus australis)由来の昆虫選択的神経毒を表す。「ＡｃＬｑｈＩＴ２」は、バキュロウイルス後期Ｐ１０プロモーターの転写制御下にＬｑｈＩＴ２をコードする遺伝子を含有するよう遺伝子的に改変されているＡｃＮＰＶを表す略した形態である。「ＡｃＡａＩＴ」は、ＡａＩＴをコードする遺伝子を持つよう遺伝子的に改変されているＡｃＮＰＶを表す略した形態である。「発現」は、コードされたタンパク質を生じるための構造遺伝子の転写および翻訳をさす。当業者により認識されるであろうように、構造遺伝子の発現レベルは、採用された調節配列（プロモーター、ポリアデニル酸化部位、エンハンサー、など）により、および構造遺伝子が発現される宿主細胞により影響される。本明細書で使用されるように、適する「調節配列」は、構造遺伝子の上流（５ ’）、中、および／もしくは下流（３’）に配置されるヌクレオチド配列を指し、これは、細胞のタンパク質生合成装置と潜在的に組合わさってコード配列の転写および／もしくは発現を制御する。これらの調節配列は、プロモーター、エンハンサー要素、転写終止配列、およびポリアデニル酸化配列を包含する。「プロモーター」は、転写の開始を支配する、構造遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列を指す。プロモーター配列は下流の遺伝子の発現をさせるのに必要であるがしかし常に十分なわけではない。通常、プロモーターは、下流の方向に優先的に転写をさせるが、とは言え促進活性は遺伝子がプロモーターの上流に置かれる場合に（低下された発現レベルで）示され得る。転写レベルはプロモーター配列により調節される。かように、異種性のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築では、構造遺伝子は、その遺伝子の発現がプロモーター配列により制御されるようにプロモーターの調節制御下に置かれる。プロモーターは優先的に、構造遺伝子の上流、かつ、プロモーターと、それがその本来の設定で制御する遺伝子との間の距離に近似する転写開始部位からの距離に配置される。当該技術分野で既知のように、この距離での若干の変動はプロモーター機能の喪失なしに耐えられ得る。「３’非コーディング配列」は、ポリアデニル酸化シグナルおよびｍＲＮＡのプロセシングもしくは遺伝子発現に影響することの可能ないずれかの他の調節シグナルを含有する、遺伝子のＤＮＡ配列の一部を指す。ポリアデニル酸化シグナルは通常、ポリアデニル酸領域(tract)のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響することにより特徴づけられる。本明細書で使用されるように、「遺伝子」はタンパク質の合成に関与するＤＮＡ配列部分全体を指す。遺伝子は、５’末端で翻訳開始コドン（通常ＡＴＧ）から始まりかつ３’末端の終止（ＴＡＧ、ＴＧＡもしくはＴＡＡ）コドンまで伸長するＤＮＡの構造的もしくはコーディング部分を具現する。それはまた、通常は構造遺伝子の５’すなわち上流に配置されるプロモーター領域も含有し、構造遺伝子の発現を開始しかつ調節する。３’非コーディング配列もまた遺伝子に包含される。「キメラ遺伝子」は異種性の調節配列およびコーディング配列を含む遺伝子を指す。「異種性遺伝子」は通常宿主生物体で見出されないがしかし遺伝子伝達により導入される遺伝子を指す。「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチドもしくはそれらの部分をコードするＤＮＡ区分を含み、かつ、遺伝子発現の調節制御に関与する５’および３’ 配列を除外する、遺伝子の部分である。構造遺伝子は細胞で通常見出されるものもしくはそれが導入される細胞の場所で通常見出されないものでありうる。導入される場合は異種性遺伝子と称される。異種性遺伝子は、当該技術分野に知られたいずれかの起源から全部もしくは一部得られることができ、細菌のゲノムもしくはエピソーム、真核生物、核もしくはプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを包含する。構造遺伝子は、生物学的活性に影響を与え得るとみられるコーディング領域もしくは非コーディング領域、または、発現産物の化学的構造、発現の速度もしくは発現の制御の様式のいずれかにおいて、ひとつもしくはそれ以上の改変を含有しうる。そうした改変は、突然変異、挿入、欠失およびひとつもしくはそれ以上のヌクレオチドの置換を包含するがしかしこれらに制限されない。構造遺伝子はとぎれないコーディング配列を構成しうるか、または、それは適切なスプライス接合点により境界を示されたひとつもしくはそれ以上のイントロンを包含しうる。構造遺伝子は、天然に存在するもしくは合成の起源の複数性状態に由来する区分の複合物でありうる。構造遺伝子はまた融合タンパク質もコードしうる。「合成遺伝子」は、全体としてもしくはコーディング領域のより大きな部分について化学的に合成される構造遺伝子のＤＮＡ配列を指す。本明細書に例示されるように、オリゴヌクレオチドの基礎単位が当業者に既知の処置を使用して合成され、そして連結されかつアニーリングされて、その後完全な遺伝子を構築するように酵素的に組み立てられる遺伝子区分を形成する。当業者に認識されるように、本明細書に記述される合成遺伝子に機能的にかつ構造的に同等の遺伝子は、部位特異的突然変異誘発もしくは当該技術分野で使用される他の関連する方法により調製されうる。「操作可能に連結された」という用語は、あるものの機能が他者により影響されるように結合された単一の核酸分子上の核酸配列を指す。例えば、プロモーターは、それがその構造遺伝子の発現に影響することが可能である（すなわち当該構造遺伝子がプロモーターの転写制御下にある）場合、その構造遺伝子と操作可能に連結される。「トランスフェクション」は、以前にある機能遺伝子を含有していなかった生物体中にその遺伝子をもつＤＮＡ区分を安定に導入することを指す。「コトランスフェクション」は一生物体への１種以上のＤＮＡ区分の同時導入を指す。「コドンの偏り」は、与えられたアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用頻度において特定の宿主細胞により表される好みを指す。宿主細胞での向上された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドンの使用頻度が当該宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。「コドンの偏りのない」は、偏りのない、天然の、本来のもしくは野生型を指す。ＤＮＡの配列に関するような「化学的に合成された」は、成分のヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。人手によるＤＮＡの化学合成は十分に確立された手順(21)を使用して完遂されうるか、もしくは、自動化学合成が多数の商業的に入手可能な機械のひとつを使用して実行され得る。本発明は昆虫選択的神経毒を発現するよう操作された組み換えバキュロウイルス殺虫剤の構築および利用に関する。真正のＬｑｈＩＴ２毒素をコードする合成遺伝子が開示され、この中でコドンの使用頻度は鱗翅目昆虫で高度に発現されるバキュロウイルス遺伝子で高頻度で採用されるコドンに偏らされている。この合成遺伝子のＤＮＡ配列は本来のＬｑｈＩＴ２コード配列と異なるとは言え、コードされたアミノ酸配列は本来の毒素のアミノ酸配列と同一である。バキュロウイルスプロモーター、発現された毒素の分泌を助長するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド断片、および、当該毒素をコードする合成核酸断片を含むキメラ遺伝子を、核多角体ウイルスのゲノム中に挿入した。このキメラ遺伝子の発現は、有効な毒素発現、および、非組み換えバキュロウイルスに関しての組み換えウイルスの殺虫特性の強化をもたらした。この向上された活性は、標的昆虫集団のより迅速な制御により明示され、そして、これらの昆虫により引き起こされる作物に対する摂食の損傷でのかなりの低下をもたらす。驚くことに、今回の組み換えバキュロウイルスはまた、別の昆虫選択的毒素ＡａＩＴを発現するよう操作された組み換えバキュロウイルスより迅速な昆虫制御も表した。バキュロウイルス殺虫剤は農業の害虫制御のための環境に温和な方法を提供する大きな能力を有する。しかしながら、有効性に対する改善が、これらの作用物質を現行の化学的害虫制御剤と競争できるようにするために必要とされる。そうした改善をするためのひとつのアプローチはウイルスの遺伝子的変化による。例えば、ウイルスゲノムを、ウイルスの宿主範囲を改善するため、ウイルスの環境での安全性および持続性を増大させるため、もしくはウイルスの感染性および伝播を向上させるために改変することが可能でありうる。加えて、ウイルスが、感染した昆虫を危険に曝すように作用する速度を改善することは、化学的害虫制御剤の添加物もしくは置き換え物としてのバキュロウイルス殺虫剤の魅力を大きく高めるとみられる。ウイルスがその昆虫宿主に影響する速度を増大させるひとつの方法は、当該昆虫に毒性であるタンパク質をコードする外来遺伝子を導入することであり、ここで当該昆虫の死もしくは無能力化はもはや単にウイルス感染の進行に依存せず、しかし代わりに外来タンパク質の毒性のレベルの蓄積により促進される。多くの節足動物は毒液と称される物質の混合物を産生する。これらの物質は分化した腺組織で合成され、刺すもしくは刺し通す装置により注がれた場合に節足動物の餌食を麻痺させることが可能である。ゆっくり動くもしくは静止の節足動物は、非常に低い濃度で毒液の神経毒性成分を利用することにより、それらの餌食を即座に麻痺させる戦略を適合させている。これらの成分すなわち神経毒は、あるレセプター部位に関する有効な競合により昆虫の神経組織の機能を妨害する。これらの神経毒の多くはポリペプチドであり、これらはそれらの宿主特異性および作用様式に基づき多様なクラスに分割されている(22)。例えば、多数の種のサソリから単離された神経毒性ペプチドは、節足動物に影響するクラスおよび哺乳動物に影響するクラスに分割されている。節足動物特異的な毒素のいくつかは昆虫選択的ペプチドと同定されている。例えば、ブチナエ属(Buthinae)のサソリは標的昆虫へのそれらの生物学的影響でよい対照をなす２種の昆虫選択的神経毒を発現する。マクロバエ科のハエでは、興奮性毒素に分類されるものは、運動神経の末端側枝の誘導および反復性発射により引き起こされる即時の急速かつ可逆的な収縮性麻痺を引き起こす(23-25)。これらの毒素はおよそ70アミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、かつ、４個のジスルフィド橋により架橋される。興奮性の効果は増大したナトリウム伝導性およびチャンネル閉鎖の電位依存性の遅延に帰され、影響されたニューロンでの負の放電をもたらす。サソリアンドロクトヌスアウストラリス(Androctonus austr alis)の毒液から産生された毒素ＡａＩＴ(26)は、この興奮性作用を表すこれらの生物体から単離された最初の昆虫毒素であった。昆虫選択的神経毒の第二のクラスは、ＢｊＩＴ２(27)、ＬｑｑＩＴ２(28)およびＬｑｈＩＴ２(19)を包含する抑制性毒素である。これらの毒素は、興奮性毒素と異なる独特かつ類似の一次アミノ酸配列を保有する60ないし65アミノ酸のポリペプチドである。これらの毒素は昆虫の筋肉組織のゆっくりした進行性の麻痺および完全な弛緩を誘発する。この活性は喚起された活動電位の妨害の結果であり (28,29)、また、ナトリウムチャンネルの伝導性の抑制および軸索膜の脱分極に帰することができる。異種性遺伝子を発現する組み換えバキュロウイルスの調製に使用される方法および戦略は当該技術分野で十分に知られている(6,7,30)。遺伝子発現のこれらの方法は、真核生物の発現ベクター系での哺乳動物タンパク質の実利的な調製法を提供しており、多くの例でそれらの適当な三次的配座を達成しかつ活性に必要な適当なジスルフィド橋を形成しているタンパク質をもたらす。バキュロウイルスゲノム中への異種性遺伝子の導入の一方法は、ウイルスゲノムＤＮＡと目的の異種性遺伝子を含有する適する「伝達ベクター」との間の相同的組み換えによる。これらの伝達ベクターは、一般に、細菌宿主での自律的複製が可能であるプラスミドＤＮＡであり、容易な遺伝子操作を提供する。バキュロウイルス伝達ベクターもまた、以下の特徴、すなわち（５’から３’の方向で列挙される）１）本質的でないゲノム領域の５’領域を含むウイルスＤＮＡ、２）ウイルスプロモーター、３）異種性ＤＮＡ配列の挿入を促進する制限酵素切断部位をコードするひとつもしくはそれ以上のＤＮＡ配列、４）転写終止配列、および５）本質的でないゲノム領域の３’領域を含むウイルスＤＮＡ、を包含するよう改変されているウイルスゲノムの一領域を含む遺伝子カセットも含有する。目的の異種性遺伝子はウイルスプロモーターの下流の制限酵素切断部位で伝達ベクター中に挿入される。生じるカセットはキメラ遺伝子を含み、そこでは異種性遺伝子はウイルスプロモーターの転写制御下にありかつ転写終止配列が伝達ベクター上に存在する。さらに、このキメラ遺伝子は、ウイルスゲノムの本質的でない領域での相同的組み換えを促進するウイルスＤＮＡ配列により隣接される。組み換えウイルスは、ウイルスゲノムＤＮＡおよび組み換え伝達ベクターで（ウイルスの複製を支持することが可能な）昆虫細胞をコトランスフェクションすることにより創製される。伝達ベクター上に存在する隣接するウイルスＤＮＡ配列と、ウイルスゲノムＤＮＡ上の相同的配列との間の相同的組み換えが起こり、そして本質的なウイルス機能を混乱させないウイルスゲノムの領域へのキメラ遺伝子の挿入をもたらす。この組み換えられたゲノムＤＮＡは、徐々に、感染性の組み換えビリオン中にパッケージングされる。好ましい態様においては、伝達ベクター上に存在する、ウイルスゲノムの本質的でない領域は、ポリヘドリン産生をつかさどるウイルスＤＮＡの領域を含む。相同的組み換えに関与する隣接する配列の間にポリヘドリン遺伝子全体を含有する伝達ベクターが最も好ましい。（ポリヘドリン遺伝子のゲノムのコピーの欠損により）ポリヘドリン産生の欠けたウイルスからのゲノムＤＮＡでの組み換えは、ポリヘドリン陽性の表現型の復活をもたらすであろう。この戦略は組み換えウイルスの同定および選択を容易にする。別の態様においては、バキュロウイルスのゲノムＤＮＡが、ウイルスゲノムの本質的でない領域への唯一の制限酵素認識配列の導入により直接改変され得る。バキュロウイルスに感染した昆虫細胞での遺伝子発現を支配することが可能な調節配列に操作可能に連結された組み換えウイルスにより発現されるべき異種性遺伝子を含むキメラ遺伝子が構築され得、そして、唯一の制限酵素切断部位でウイルスゲノム中に直接挿入され得る。この戦略は伝達ベクターの構築の必要および組み換えウイルスの産出のための相同的組み換えへの信頼を排除する。この技術はエルンスト(Ernst)ら(31)によりおよびWO94／28114(32)に記述される。遺伝子的にコードされる昆虫特異的神経毒の送達に適する組み換えバキュロウイルスベクターは、最大の効率のために毒素遺伝子の至適な発現を必要とする。多数の戦略が、組み換えバキュロウイルスを設計しかつ調製するために当業者により採用され得る。この中で、毒素遺伝子の発現は、機能性の形態で感染の間の適切な時点で産生される毒素の十分な量をもたらし、かつ、昆虫宿主内の標的細胞への結合に利用可能である。至適な遺伝子発現へのひとつの要所は遺伝子の転写を支配する適切なプロモーター要素の選択である。多様な段階でおよびウイルスの生活環の間の多様な時点で遺伝子発現を媒介するいくつかのバキュロウイルスプロモーターが記述されている。例えば、ポリヘドリンプロモーターは、ウイルスのヌクレオキャプシドを含む主要なタンパク質であるポリヘドリンタンパク質の産生を支配する非常に強力なバキュロウイルスプロモーターである。この遺伝子はウイルスの生活環の間の後期に発現され、また、この遺伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡは感染した細胞のポリアデニル酸化されたメッセージ全体の20％もしくはそれ以上を占め得る。Ｐ１０および塩基性プロモーターを包含する、類似の強さのかつウイルスの生活環の後期に発現される他のプロモーターが選ばれ得る。さらに、前初期プロモーターＩＥ１およびＩＥＮ、後初期プロモーター３９ＫもしくはＡｃＮＰＶのゲノムのHindIII-Ｋ断片で見出されるプロモーターのひとつを包含する (49)、ウイルスの生活環の間の初期に転写因子により誘導されるバキュロウイルスプロモーターが記述されている(33-36)。これらのプロモーターはバキュロウイルス殺虫剤の害虫制御能力を増進するための付加的手段を供給しうる。組み換えバキュロウイルスに感染した細胞からの合成された毒素の分泌は、非組み換えウイルスにより誘導された効果に関して感染した昆虫での殺虫効果のより迅速な開始に前もって必要である(16,18)。細胞からの細胞外性分泌を予定されている真核生物のタンパク質は、しばしば、タンパク質を小胞体に向かわせるための短いシグナルペプチドを採用する。当該シグナルペプチドはその後、小胞体膜の内腔側でシグナルペプチダーゼにより切断され、そして成熟タンパク質、この場合は昆虫毒素、が細胞からの分泌のためパッケージングされる。オライリー(O'Reilly)ら(6)は、シグナル配列がバキュロウイルス発現系で機能性であることを示している。適切なシグナル配列は、ショウジョウバエ(Drosophila mela nogaster)のクチクラシグナル配列、カイコ(Bombyx mori)のコリオンシグナル配列、マンデュカセクスタ(Manduca sexta)のアポリポフォリンシグナル配列、カイコ(Bombyx mori)の性特異的シグナル配列、マンデュカセクスタ(Manduca sexta)の脂質動員ホルモンシグナル配列、カイコ(Bombyx mori)のｐＢＭＨＰＣ −１２シグナル配列、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のエステラーゼ−６シグナル配列およびウイルスのエクジソングルコシルトランスフェラーゼタンパク質のシグナル配列から成る群から選択され得る。加えて、異種の真核生物タンパク質に存在する、天然に存在する多くのシグナル配列が、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞で機能して、細胞外性分泌を媒介するであろう。シグナルペプチドおよび毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、産生される毒素の量に強い影響を与えることがあり、そしてそれによって、感染した昆虫が操作されたウイルスでの処理に圧倒される効率および速度に影響する。伸長する毒素ポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列での偏向は、当該遺伝子をコードする配列での変化を可能にする(37)。各コドンは３個のヌクレオチドから成り、また、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４種の特定の塩基に制限されるため、64個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうち61個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする）。結果として、多くのアミノ酸が１個より多いコドンにより指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４個のトリプレットにより、セリンおよびアルギニンは６個によりコードされる一方、トリプトファンおよびメチオニンはただ１個のトリプレットによりコードされる。この退縮は、ＤＮＡの塩基組成が、そのＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく幅広い範囲にわたり変動することを可能にする。この退縮の進化の発展および維持に関するひとつの仮説は、いくつかのコドンが単一のアミノ酸をコードする能力から生じる柔軟性が、ヌクレオチド配列での点突然変異の潜在的な欠失の影響を最小限にするということである。従って、全ての点突然変異が、予期しないアミノ酸の取り込みを支配しそしてかようにミスセンスタンパク質の合成をもたらすコドンを、もしくは翻訳終止コドンの挿入をもたらし、翻訳の未熟な終止および短くされたタンパク質の産生をもたらすわけではないであろう。多くの生物体が、伸長するペプチド鎖での特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用に関し偏りを表す。コドンの好みもしくはコドンの偏りすなわち生物体間でのコドンの使用頻度の差異は、遺伝子コードの退縮により提供され、かつ多くの生物体で十分に文書で報告される(38-43)。コドンの偏りはしばしばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、これは順に、とりわけ翻訳されているコドンの特性および特定の伝達ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。選択されたｔＲＮＡの細胞での優位は、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、これらの翻訳因子の至適化に基づくバキュロウイルス発現系での至適な遺伝子発現のために調整され得る。合成遺伝子は、かように、ウイルスゲノムにより表されるコドンの偏りを利用するために構築され得る。当業者は、コドンの使用頻度がウイルスもしくは当該ウイルスが複製する細胞により好まれるそれらのコドンに偏らされる場合に、成功する遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能であるウイルスおよび昆虫遺伝子の網羅的な検分に基づき得る。しかしながら、この情報は、配列情報がウイルスの本来の宿主に離れて進化的にのみ関連する昆虫由来である場合に疑わしい価値のものである。例えば、ＡｃＮＰＶでの異種性遺伝子の発現のためのショウジョウバエ(Dro sophila melanogaster)のゲノムで偏らせたコドンの使用は合理的でない。なぜなら、ハエ（例えばドロソフィラ属(Drosophila)）およびガ（例えば鱗翅目）の最後の共通の祖先はおよそ２億５千万年前に遡る(44,45)からである。ＮＰＶでの遺伝子発現の利益となる、基礎を形成するコドンの選択のためのより有用かつ強い興味をそそる情報は、ウイルスの本来の宿主（すなわち鱗翅目昆虫）からの遺伝子および高度に発現されるウイルスタンパク質をコードする遺伝子でのコドンの偏りを単に調査することにより得られ得る。ＮＰＶのポリヘドリンおよびＰ１０タンパク質の発現を支配するプロモーターは非常に後期のかつ強力なプロモーターであることが知られ、また、従ってバキュロウイルス発現系での異種性遺伝子の発現を支配するためにルーチンで選ばれる。実際、ＡｃＮＰＶによる昆虫宿主細胞の感染後27ないし48時間に、昆虫細胞中のポリアデニル酸化されたＲＮＡ全体のおよそ20％はポリヘドリンｍＲＮＡである(46,47)。順に、ポリヘドリンｍＲＮＡは効率的に翻訳され、豊富なポリヘドリンタンパク質につながる。ＮＰＶの生活環でのポリヘドリンタンパク質のプロモーターの強さおよび重要性のため、ＡｃＮＰＶ、カイコ(Bombyx mori)ＮＰＶ、シロイチモンジヨトウ(Spodoptera frugiperda)ＮＰＶ、ハスモンヨトウ(Sp odoptera litturalis)ＮＰＶおよびオルギイアプソイドツガタ(Orgyia pseudo tsugata)ＮＰＶのものを包含するＮＰＶポリヘドリン遺伝子に見出されるコドン頻度に基づき、ＬｑｈＩＴ２遺伝子の合成バージョンが構築されている。コドンはこれらの５種のＮＰＶ遺伝子での出現頻度に基づき選択された。好ましいコドンは、ポリヘドリンタンパク質を含む20種のアミノ酸および停止シグナルをコードするコドンが検分される場合に容易に検出される。例えば、アミノ酸グリシンの場合は、ＧＧＣが、それぞれ14および４％の頻度のＧＣＡおよびＧＧＧに比較して60％の頻度で優勢に使用されるコドンである。アスパラギン酸、ＧＡＣ（74％）対ＧＡＴ（26％）；アルギニン、ＣＧＣ（ 37％）もしくはＣＧＴ（33％）対ＣＣＧ（１％）もしくはＣＧＡ（１％）；アスパラギン、ＡＡＣ（86％）対ＡＡＴ（14％）；イソロイシン、ＡＴＣ（69％）対ＡＴＡ（６％）；スレオニン、ＡＣＣ（53％）対ＡＣＡ（４％）もしくはＡＣＧ（13％）；シスチン、ＴＧＣ（73％）対ＴＧＴ（27％）；チロシン、ＴＡＣ（81 ％）対ＴＡＴ（19％）、フェニルアラニン、ＴＴＣ（65％）対ＴＴＴ（35％）；グルタミン、ＣＡＡ（94％）対ＣＡＧ（６％）；ヒスチジン、ＣＡＣ（83％）対ＣＡＴ（17％）；およびプロリン、ＣＣＣ（58％）対ＣＣＡ（10％）を包含する、他の好ましいコドンが容易に同定される。コドンの使用頻度におけるこれらの優勢かつ明確な不一致に基づき、われわれはＬｑｈＩＴ２の合成遺伝子を設計しかつ合成した。実際、ＮＰＶポリヘドリン遺伝子で観察されたコドンの使用頻度における差異はまた、宿主細胞および当該ウイルスが感染する生物体によっても共有される。以下の鱗翅目の遺伝子が考慮された。多くの例で、類似のコドンの好みがポリヘドリン遺伝子と鱗翅目の遺伝子との間で検出された。例えば、アスパラギン酸の場合は、コドンＧＡＣがポリヘドリン（ｐｏｌｈ）および鱗翅目（ｌｅｐ）遺伝子についてそれぞれ74％および64％の頻度で使用される。他の好ましいコドン頻度は、イソロイシン、ＡＴＣ−ｐｏｌｈ 69％およびＡＴＣ−ｌｅｐ52％；スレオニン、ＡＣＣ−ｐｏｌｈ 53％およびＡＣＣ−ｌｅｐ 36％；シスチン、ＴＧＣ−ｐｏｌｈ 73％およびＴＧＣ− ｌｅｐ 57％；チロシン、ＴＡＣ−ｐｏｌｈ 81％およびＴＡＣ−ｌｅｐ 73％；ならびにフェニルアラニン、ＴＴＣ−ｐｏｌｈ 65％およびＴＴＣ−ｌｅｐ 73％を包含する。この観察可能な平行に加え、いずれの場合も、ポリヘドリンおよび鱗翅目のコドン頻度の比較において、特定のコドンの使用は２種の遺伝子群の間で明確に対照させない。第１表は、核多角体ウイルスの５種のポリヘドリン遺伝子および15種の鱗翅目の遺伝子の観察結果から推定されるコドン利用の頻度を要約する。いくつかの場合には、代替のコドンが遺伝子操作を容易にするために選ばれた。ＬｑｈＩＴ２毒素をコードする遺伝子のコドンを偏らせたバージョン（配列番号１２）は、ＬｑｈＩＴ２の本来のコード領域（配列番号１１）のｃＤＮＡコピーに存在するものからの186ヌクレオチドのうち41個の転換をもたらした。バキュロウイルスベクターへの挿入のためのコドンが至適化されたＬｑｈＩＴ２遺伝子を調製するため、５組の相補オリゴヌクレオチド（第２図；配列番号１ −１０）を設計し、そして標準的合成方法により合成した。それぞれは毒素タンパク質の特定領域をコードした。各組のオリゴヌクレオチドは、アニーリングされた場合に、唯一の一本鎖の伸長を保有する二本鎖の核酸断片を形成した。この伸長は、連結する酵素の存在する適切な条件下でのインキュベーションに際して断片類が指向されたランダムでない様式で一緒に結合されそして真正のＬｑｈＩＴ２毒素ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードする単一の核酸断片をもたらすように設計された。加えて、生じた５’および３’末端は、適切な酵素での切断に際し、以前に調製されたクローニングベクターの挿入部位中に容易に挿入され得る１個のＤＮＡ断片をもたらす制限酵素認識部位をコードした。連結された断片をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、増幅されたＤＮＡを単離しそして適切な制限酵素で切断し、そして切断された断片を中間のプラスミドベクター中にクローニングした。この中間ベクターは挿入された毒素遺伝子の操作および配列決定を容易にし、かように、挿入された断片の同一性の確認、および適切なバキュロウイルス伝達ベクターへのその後のサブクローニングのために準備することを容易にした。確認された、毒素をコードする断片を中間クローニングベクターから削り取り、そして、標準的な分子クローニング技術によりバキュロウイルス伝達ベクター中にサブクローニングした。ひとつの態様において、伝達ベクターへの挿入はバキュロウイルスの強力かつ後期のＰ１０プロモーターの下流の位置で生じた。このＰ１０−ＬｑｈＩＴ２キメラ遺伝子は、５’および３’末端で、内因性ポリヘドリン遺伝子をコードするバキュロウイルスゲノムの領域に相同のＤＮＡ配列により隣接された。適する細菌宿主の形質転換に際し、形質転換体を、挿入されたＤＮＡを非対称的に切断する制限エンドヌクレアーゼでの切断後のＤＮＡの電気泳動的移動の観察により、挿入された断片の適当な方向についてスクリーニングした。正しい方向で挿入物を含有する１個のクローンを選び、そしてこの組み換え伝達ベクターのプラスミドＤＮＡを調製した。別の態様においては、ＬｑｈＩＴ２毒素をコードする合成構造遺伝子を、初期ＩＥ１プロモーターおよびｈｒ５エンハンサー領域の下流の位置でバキュロウイルス伝達ベクター中に挿入した。毒素構造遺伝子が当該プロモーターおよびエンハンサー要素に関して正しい方向で初期プロモーター伝達ベクター中に挿入された、適切な遺伝子構築物の同定を、Ｐ１０−ＬｑｈＩＴ２伝達ベクターについて記述されたように実施した。合成ＬｑｈＩＴ２遺伝子のバキュロウイルスゲノム中への導入は、とりわけ、Ｐ１０もしくはＩＥ１のいずれかのプロモーターの転写制御下のキメラのシグナルペプチド−毒素遺伝子、ポリヘドリンプロモーターの転写制御下のポリヘドリン遺伝子、および隣接するバキュロウイルスＤＮＡを含有する伝達ベクターのコトランスフェクションにより完遂し、そして、精製し、ポリヘドリン陰性のバキュロウイルスからゲノムＤＮＡを直鎖化した。これらのＤＮＡを当該技術分野で十分に既知の技術によりトランスフェクションの許容される昆虫細胞中に導入した。トランスフェクションされた細胞の単層をプラーク形成について観察し、そしてプラークをポリヘドリン封入体の存在について観察した。封入体の存在は、ポリヘドリン遺伝子およびポリヘドリン陰性のバキュロウイルスＤＮＡとともにＬｑｈＩＴ２をコードするキメラ遺伝子を含有する伝達ベクターの領域の成功した組み換えを指摘した。伝達ベクター上のポリヘドリン遺伝子の存在はバキュロウイルスＤＮＡ上の機能的ポリヘドリン遺伝子の欠乏を贈呈し(compliments)、組み換えウイルスのスクリーニングの手軽な方法をもたらす。組み換えバキュロウイルスをもたらすバキュロウイルスゲノムへのＬｑｈＩＴ２遺伝子の挿入は、ＬｑｈＩＴ２毒素に特異的なウサギポリクローナル抗体でのウエスタン分析により確認した。感染した細胞の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、そしてその後イムノブロット分析による検出に適する媒体に移した。驚くことに、また、他者により報告されたデータと対照的に、感染した細胞の抽出物は、精製されたＬｑｈＩＴ２毒素に対し出現した抗体によりとりわけ認識された、期待されたＬｑｈＩＴ２の分子量に類似の分子量のポリペプチドを含有した。これは、ＬｑｈＩＴ２タンパク質をコードする遺伝子の成功した発現の最初の報告である。ＬｑｈＩＴ２を発現する組み換えバキュロウイルスを、組み換えのおよび野生型のＡｃＮＰＶでの経口感染後のＨ．ヴィレセンス(H．virescens)の１齢もしくは３齢の幼虫の生存を測定することにより、標的昆虫集団を制御するそれらの能力について評価した。昆虫の幼虫に、ＬｑｈＩＴ２毒素を発現する組み換えウイルスを接種された食餌を給餌した。加えて、コントロールの昆虫は、接種されていない食餌または１）野生型の非組み換えウイルスもしくは２）広く採用された昆虫特異的サソリ毒素ＡａＩＴを発現する組み換えウイルス、を含有する食餌を摂食させた。幼虫は挙動の変化および究極的には死亡についてモニターした。ＡｃＬｑｈＩＴ２もしくはＣＧ２０１−３−１を含有する食餌を摂食する昆虫は野生型ウイルスを摂食したものより迅速に死亡した。驚くことに、後期Ｐ１０プロモーターもしくは初期ＩＥ１プロモーターのいずれかの転写制御下にＬｑｈＩＴ２を発現する組み換えウイルスは、ＡａＩＴを発現する組み換え体より迅速な殺虫効果を示した。ＡｃＬｑｈＩＴ２の昆虫制御効率もまた植物保護実験で示した。昆虫の幼虫に、多様なウイルスを組み込む食餌を給餌することにより試験ウイルスおよびコントロールウイルスを接種した。感染した幼虫をダイズ植物上に置き、そして、適するインキュベーション期間の後、植物材料の破壊を定量化した。この実験の結果は、ＡｃＬｑｈＩＴ２処理が、野生型ウイルスおよびＡａＩＴを発現する組み換えウイルスに関して有意により小さい植物破壊をもたらすことを指摘した。本発明の組成物は、一般に、液体もしくは固体の希釈剤を含む農業的に適する担体を含む製剤で使用されるであろう。有用な製剤は、主薬の物理的特性に矛盾せず、かつ、当該ウイルス、適用の様式、ならびに土壌のタイプ、水分および温度のような環境的因子と適合する、粉剤、顆粒剤、餌、ペレット、懸濁剤、乳剤、可溶化粉末、乾燥流動可能物(dry flowables)などを包含する。噴霧可能な製剤が適する媒体中に広げられ得、そしてヘクタールあたり約１から数100リットルまでの噴霧量で使用され得る。高濃度組成物は主にさらなる製剤の中間体として使用される。当該製剤は、典型的には、合計100重量％となる以下の近似の範囲内に有効量の主薬、希釈剤および界面活性剤を含有するであろう。典型的な固形の希釈剤は、ワトキンス(Watkins)ら、ハンドブックオブインセクティサイドダストダイリューエンツアンドキャリアーズ(Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers)、第２版、ドーランドブックス (Dorland Books)、コードウェル(Caldwell)、ニュージャージー州、に記述される。典型的な液体の希釈剤および溶媒は、マルスデン(Marsden)、ソルベンツガイド(Solvents Guide)、第２版、インターサイエンス(Interscience)、ニューヨーク(1950)、に記述される。マッカチョンズディタージェンツアンドエマルシファイヤーズアニュアル(McCutcheon's Detergents and Emulsifiers A nnual)、アルーアドパブリシングコープ(Allured Publ．Corp.)、リッヂウッド(Ridgewood)、ニュージャージー州、ならびに、サイスリー(Sisely)とウッド(Wood)、エンサイクロペディアオブサーフェスアクティブエージュンツ(Encyclopedia of Surface Active Agents)、ケミカルパブリシングコーインク(Chemical Publ．Co.，Inc.)、ニューヨーク、(1964)は、界面活性剤および推奨される使用を列挙する。全ての製剤は、泡、ケーキング、腐食、望まれない微生物の増殖、などを減少させる少ない量の添加物を含有し得る。組成物の全ての材料が相互に適合しかつウイルスの感染性の損失に寄与しないことを確実にするよう注意が払われなくてはならない。微細な固形の組成物は、混和しかつ通常はハンマーミルもしくは流動エネルギーミルでのようにすりつぶすことにより作成される。水に分散可能な顆粒は微細な粉末組成物を凝集させることにより産生され得る。例えば、クロス(Cross)ら、ペスティサイドフォーミュレーションズ(Pesticide Formulations)、ワシントンＤ．Ｃ．、(1988)、pp251-259を参照。懸濁液は湿式磨砕により調製される。例えば米国特許第 3,060,084号を参照。顆粒剤およびペレットは、予め形成された顆粒状の担体上に主薬を噴霧することにより、もしくは凝集技術により作成され得る。ブラウニング(Browning)、「アグロメレーション(Agglomeration)」、ケミカルエンジニアリング(Chemical Engineering)、1967年12月4日、pp147 -148、ペリーズケミカルエンジニアズハンドブック(Perry's Chemical En gineer's Handbook)、第４版、マグロウ−ヒル(McGraw-Hill)、ニューヨーク、( 1963)、8-57ページおよび以下、ならびにWO 91／13546を参照。製剤の技術に関するさらなる情報については、米国特許第 3,235,361号６欄16 行から７欄19行および実施例10−41；同第 3,309,192号５欄43行から７欄62行ならびに実施例８、12、15、39、41、52、53、58、132、138−140、162−164、166 、167および169−182；同第 2,891,855号３欄66行から５欄17行および実施例１ −４；クリングマン(Klingman)、ウィードコントロールアズアサイエンス(Weed Control as a Science)、ジョンウィレイアンドサンズインク( John Wiley and Son s，Inc.)、ニューヨーク、(1961)、pp 81-96；ならびにハンス(Hance)ら、ウィードコントロールハンドブック(Weed Control Handbook)、第８版、ブラックウェルサイエンティフィックパブリケーションズ(Blackwell Scientific Publications)、オックスフォード、(1989)を参照。以下の実施例において、全てのパーセントは重量パーセントであり、また、全ての製剤は慣習的方法で調製される。実施例Ａ可溶化粉末バキュロウイルス 65.0％ドデシルフェノールポリエチレングリコールエーテル 2.0％リグニンスルホン酸ナトリウム 4.0％ケイ素アルミン酸ナトリウム 6.0％モントモリロナイト（焼成） 23.0％実施例Ｂ顆粒剤バキュロウイルス 10.0％アッタプルガイト顆粒（低揮発性物質、 0.71／0.30mm；U.S.S.No.25-50篩） 90.0％実施例Ｃ押出ペレットバキュロウイルス 25.0％無水硫酸ナトリウム 10.0％粗リグニンスルホン酸カルシウム 5.0％アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム 1.0％カルシウム／マグネシウムベントナイト 59.01% 本発明の組成物は、農業、林業、温室作物、観賞植物、苗床の作物および繊維製品で重要な、葉を摂食する、果実を摂食する、幹を摂食するおよび種子を摂食する鱗翅目害虫の幅広いスペクトルに対する活性を表す。当業者は、全ての組成物が全ての害虫の全ての成長段階に対し均等に有効であるわけではないことを認識するであろう。にもかかわらず、本発明の組成物の全ては鱗翅目の幼虫に対し活性を表す。とりわけ、当該組成物は、フォールアーミーウァーム(Spodoptera frugiperda)、タバコバッドウァーム(Heliothis virescens)、コーンイヤーウァーム(Helicoverpa zea)、アメリカンボールウァーム(Heliothis armigera)、シロイチモンジヨトウ(Spodoptera exigua)、コナガ(Plutella xylostella)およびイラクサキンウワバ(Trichoplusia ni)に対し活性である。本発明の組成物はまた、１種もしくはそれ以上の他の殺虫剤、殺真菌剤、ダニ駆除剤、もしくは他の生物学的に活性の化合物とも混合され得、より幅広いスペクトルの農業的保護さえ与える多成分農薬を形成する。本発明の組み換えバキュロウイルスがともに処方され得る他の農業保護剤の例は、ナトリウムチャンネルアゴニスト（すなわちピレスロイド類）、ナトリウムチャンネル遮断剤（すなわちピラゾリン類）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（すなわち有機リン類およびカルバメート類）、ニコチン様アセチルコリン結合剤、γ-アミノ酪酸様結合剤、オクタピンのアゴニストもしくはアンタゴニスト（すなわちホルムアミジン類）ならびにオキシリン脱結合剤(uncoupler)（すなわちピロール殺虫剤）である殺虫剤である。本発明の組み換えバキュロウイルスと混合され得る殺虫剤の特定の例は、アベルメクチンＢ、モノクロトフォス、テトラクロロビンフォス、マラチオン、パラチオンメチル、ダイアジノン、プロフェンフォス、スルプロフォス、トリフルムロン、ジフルベンズロン、メトプレン、ブプロフェジン、チオジカルブ、アセフェート、アジノフォスメチル、クロロピリフォス、ジメトエート、フィプロニル、フルフェンプロックス、フォノフォス、イソフェンフォス、メチダチオン、メタミドフォス、フォスメット、フォスファミドン、フォサロン、ピリミカルブ、フォレート、テルブフォス、トリクロルフォン、メトキシクロル、ビフェントリン、ビフェネート、テフルトリン、フェンプロパトリン、フルバリネート、イミダクロプリド、メトアルデヒドおよびロテノンである。加えて、カルベンダジム、チウラム、ドダイン、メナブ、クロロネブ、ベノミル、シモキサニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、トリアジメフォン、カプタン、チオファネートメチル、チアベンダゾール、フォスエチルアルミニウム、クロロタロニル、ジクロラン、メタラキシル、カプタフォル、イプロジオン、オキサジキシル、ビンクロゾリン、カスガマイシン、マイクロブタニル、テブコナゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、フルキンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ペンコナゾール、プロピコナゾール、ユニコンゾール、フルトリアフォル、プロクロルアズ、ピリフェノックス、フェナリモル、トリアジメノル、ジクロブトラゾル、オキシ塩化銅、フラルアキシル、フォルペット、フルシラゾル、ブラスチシジンＳ、ジクロメジン、エジフェンフォス、イソプロチオラン、イプロベンフォス、メプロニル、ネオアソジン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、バリダマイシンおよびフルトラニルのような殺真菌剤もまた、本発明の組み換えバキュロウイルスと混合され得る。ある例においては、異なる作用様式を除いては類似の制御スペクトルを有する他の殺虫剤との組み合わせ剤が抵抗性の管理にとりわけ有利であろう。本発明の組成物の１種もしくはそれ以上を、有効量で、作物学的および／もしくは非作物学的な蔓延の場所を包含する害虫の環境に、保護されるべき領域に、または制御されるべき害虫に直接適用することにより、鱗翅目害虫が制御され、また、作物学の、園芸学の、および特別の(specialty)作物の保護、動物およびヒトの健康が達成される。好ましい適用方法は噴霧による。あるいは、これらの化合物の顆粒の製剤が植物の群葉もしくは土壌に適用され得る。他の適用方法は、直接のおよび残留性の噴霧、空中噴霧、種子の被覆、微小被包化、浸透性の取り込み、噴霧器、エアゾル、粉末および多くの他者を包含する。当該組成物は、昆虫により消費される餌中にもしくはわななどのような装置に組み込まれ得る。本発明の組成物はそれらの純粋な状態で適用され得るが、しかし、適用は、最もしばしば、適する担体、希釈剤および界面活性剤とともに、また、おそらく、企図された最終的使用に依存して食物（餌）と組み合わせて本発明のバキュロウイルスを含む製剤のものとなるであろう。好ましい適用方法は、殺節足動物剤の水分散剤もしくは精製された油懸濁剤を噴霧することを必要とする。噴霧油、噴霧油濃縮物、展着剤(spreader sticker)、補助剤、溶媒、および共同薬との組み合わせ剤はしばしば殺節足動物効率を高める。効果的な制御に必要とされる適用の割合は、制御されるべき昆虫の種、害虫の生活環、生活段階、その大きさ、場所、１年のうちの時期、宿主の作物もしくは動物、摂食行動、交配挙動、周囲の湿度、温度などのような因子に依存するであろう。通常の環境下では、ヘクタールあたり主薬約0.01ないし0.05kgの適用割合が、作物学的生態系の害虫を制御するのに十分であるが、しかし、0.001k g／ヘクタール程度の少量が十分でありうるか、もしくは１kg／ヘクタール程度の大量が必要とされうる。非作物学的適用については、有効な使用割合は約1.0 から50mg／平方メートルまでの範囲にわたるであろうが、しかし、0.1mg／平方メートル程度の少量が十分でありうるか、もしくは150mg／平方メートル程度の大量が必要とされうる。実施例１合成ＬｑｈＩＴ２構造遺伝子の構築ＬｑｈＩＴ２遺伝子のＮＰＶに偏らせた形態を調製するため、10種のオリゴヌクレオチドを設計し（第２図；配列番号１−１０）そして標準的なphosphoramad iteの化学により合成した。これらのオリゴヌクレオチドはギブコ(Gibco)／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイタースバーグ）キナーゼを使用してリン酸化し、アニーリングし、そして第３図に描かれた略図に従いかつ製造元の推奨されたプロトコールを採用して、ギブコ／ＢＲＬリガーゼを使用して連結した。連結された断片をその後、製造元のプロトコールおよび下に記述される改変に従い、パーキン− エルマーシータス(Perkin-Elmer Cetus) アンプリタック［AmpliTaq］（商標）ポリメラーゼ（コネチカット州ノーウォーク）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用することにより増幅した。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号１）を前向きプライマーとして使用し、また、オリゴヌクレオチドＬｑ１０（配列番号１０）は逆向きプライマーとしてはたらいた。これらのプロトコールの記述を下により詳細に述べる。 10個の別個のリン酸化反応（各オリゴヌクレオチドにつき１回）を実施した。各オリゴヌクレオチド（配列番号１−１０）250pmolを1.5mLミクロ遠心チューブに置いた。10×キナーゼ緩衝液５μL、１mMＡＴＰ１μL、キナーゼ（ギブコ／ＢＲＬ、10単位／μL）６μLおよび十分量の水を、総反応体積を50μLにするために各チューブに添加した。この10本のチューブを37℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、リン酸化された各オリゴヌクレオチド５μL（2 5pmol）をただ１本のミクロ遠心チューブに入れ、そしてこのチューブを95℃のドライヒートブロックセット中においた。ヒートブロックをその後止め、そして室温に冷却させ、リン酸化されたオリゴヌクレオチドのアニーリングを促進にした。リン酸化されアニーリングされたオリゴヌクレオチドの混合物50μLを、５ ×リガーゼ緩衝液15μL、10mMＡＴＰ３μL、リガーゼ酵素（ギブコ／ＢＲＬ、５単位／μL）４μLおよび脱イオン水３μLとともに別個のミクロ遠心チューブに入れた。このチューブを37℃で30分間インキュベーションし、そしてその後室温で一夜保存した。アニーリングされかつ連結されたオリゴヌクレオチドを含む合成核酸断片をＰＣＲにより増幅した。３回のＰＣＲ反応を、テンプレートＤＮＡ（リン酸化されアニーリングされそして連結されたオリゴヌクレオチドを含む）の変化する希釈で実行した。以下の反応混合物をＰＣＲ反応に採用した：脱イオン水61.5μL 10×ＰＣＲ緩衝液（パーキン−エルマーシータス）10μL ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２μL（それぞれ200μM）アンプリタック［AmpliTaq］（商標）ポリメラーゼ0.5μL（2.5単位／100μL ）テンプレートＤＮＡを脱イオン水で100倍、1,000倍および10,000倍（ｖ／ｖ）に希釈した。反応混合物80μLを３個の0.5mLミクロ遠心チューブそれぞれに入れた。オリゴヌクレオチドＬｑ１（配列番号１）５μL（100pmol）およびオリゴヌクレオチドＬｑ１０（配列番号１０）５μL（100pmol）（前向きプライマーおよび逆向きプライマーとしてはたらく）それぞれを各チューブに添加した。適切に希釈されたテンプレート10μLを各チューブに添加した。ＰＣＲ反応を、以下の増幅プロトコール、段階１ 96℃ ３分１サイクル 75℃ ３分段階２ 95℃ 30秒 25サイクル 75℃ ２分段階３ 95℃ 30秒１サイクル 75℃ ５分に従って実施するようプログラムされたパーキン−エルマーＤＮＡサーモサイクラー［Thermocycler］（登録商標）を使用して実施した。増幅で生じた生成物を２％アガロースゲルによる電気泳動により分析した。およそ300塩基対の増幅された断片が各反応について観察された。ＬｑｈＩＴ２遺伝子および隣接する領域のＰＣＲ増幅の後、300bpのバンドを1 .2％アガロースゲルから単離し、そして、製造元のプロトコールに従ってスピンバインド(SpinBind) ＤＮＡ回収システム（ＦＭＣ、メーン州ロックランド）を使用して精製した。単離された断片を、ＬｑｈＩＴ２遺伝子およびシグナル配列を含有する合成オリゴヌクレオチドの付着５’および３’末端を創製するため、BamHIで切断した。切断された断片をその後、標準的分子クローニング技術を使用し、BamHIクローニング部位でｐＴＺ−１８Ｒプラスミド（ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州ピスカタウェイ）中に挿入した。大腸菌(E．coli)ＸＬ１ブルー（ストラタジーン(Stratagene)、ウィスコンシン州メナシャ）へのｐＴＺ−１８Ｒの形質転換後、単離されたコロニーを選び、そしてプラスミドＤＮＡを調製した。８個の陽性のクローンを同定し、そして、ｐＴＺ−１８Ｒの商業的に入手可能な前向きおよび逆向きのプライマー（ファルマシア）で配列決定した。１個のクローン（No.16）が、合成遺伝子およびシグナル配列をコードする正しい配列を含有することが見出された。生じたプラスミドは２個のBamHI制限酵素切断部位を含有した。すなわち、毒素遺伝子の５’末端近くの一方の部位および終止コドンに続く他方の部位である。プラスミドＤＮＡを標準的プロトコールに従い調製し、そしてBamHIで切断して、ＬｑｈＩＴ２遺伝子およびシグナル配列を含有する挿入された300塩基対の断片を遊離させた。この断片を、1.6％アガロースゲルによる電気泳動、この断片に対応するバンドの切り出しおよびスピンバインド［SpinBind］（商標）ＤＮＡ回収法（ＦＭＣ）による精製によりベクター配列から分離した。実施例２バキュロウイルス後期プロモーターの転写制御下に合成ＬｑｈＩＴ２構造遺伝子を含む組み換えＡｃＮＰＶの構築および試験精製されたＬｑｈＩＴ２遺伝子断片を、標準的分子クローニング技術によりバキュロウイルス伝達ベクターｐＡｃＵＷ２１（ファーミンゲン(Pharmin gen)、カリフォルニア州サンジエゴ）のBglIIクローニング部位に挿入した。このサブクローニングは、ベクターがもつＰ１０プロモーターの３’側、および伝達ベクターに内在する非機能的ｌａｃＺ断片の５’側での合成遺伝子の挿入をもたらした。連結後、ＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＸＬ１ブルー（ストラタジーン）中に形質転換した。連結の結果としてBglIIおよびBamHIの双方の切断部位が破壊され、そして、生じたプラスミドを、ＬｑｈＩＴ２遺伝子の３’末端に配置された唯一の非対称のSphI切断部位についてスクリーニングした。３個の陽性クローンが、23個の形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの電気泳動分析から同定された。挿入の方向を、SphI（ＬｑｈＩＴ２遺伝子の３’末端で切断する）およびBamHI（伝達ベクター上に存在するポリヘドリン遺伝子のコード配列内で切断する）で同時に切断されたプラスミドの分析により確認した。１個のクローンがＬｑｈＩＴ２遺伝子を正しい方向でもつと同定された。この構築物は、Ｐ１０プロモーターの下流かつポリヘドリン遺伝子の上流に挿入されたＬｑｈＩＴ２合成構造遺伝子をもたらした（ｐＡｃＵＷ２１．ＬｑｈＩＴ２；第５図参照）。スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞（Ｓｆ−９）を、3 .0％ウシ胎児血清を補充されたエクセル［ExCell］（商標）４０１培地（ＪＲＨバイオサイエンシーズ(JRH Biosciences)、カンサス州レネクサ）中で増殖させた。リポフェクチン［Lipofectin］（商標）（0.1mg／mlで50μL、ギブコ／ＢＲＬ）を、ｐＡｃＵＷ２１．ＬｑｈＩＴ２（500ng）および直鎖状にされたポリヘドリン陰性のＡｃＮＰＶ（2.5μg、バキュロゴールド［Baculogold］（商標）ウイルスＤＮＡ、ファーミンゲン）の50μLのアリコートに添加した。Ｓｆ−９細胞（およそ50％単層）を、ウイルスＤＮＡ／伝達ベクター溶液でコトランスフェクションした。コトランスフェクション実験の上清液をトランスフェクション後５日に収集し、そして組み換えウイルスを標準的なプラーク精製プロトコールを採用して単離した。ここではポリヘドリン陽性プラークのみを選択した(12)。全体で７個のプラークを単離し、それぞれを2.5％ウシ胎児血清で補充されたエクセル［ExCell］（商標）培地500μL中に懸濁した。35mmペトリシャーレ中のＳｆ−９細胞（50％単層）にウイルス懸濁液100μLを接種し、そして上清液を感染後５日に収集した。特徴づけのためにより大量のウイルスを調製するため、これらの上清液を、組み換えウイルスの大スケールの増殖のためのより大きな組織培養系を接種するのに使用した。バキュロウイルスゲノムへのＬｑｈＩＴ２遺伝子の挿入をイムノブロット分析およびバイオアッセイにより確認した。Ｓｆ−９細胞（50mL）を、野生型ＡｃＮＰＶ（コントロール）もしくはＡｃＬｑｈＩＴ２（５個の別個の単離物）に感染させた。感染後３日に、感染した細胞を収集し、そして増殖培地を細胞懸濁液の遠心分離により除去した。消費された培養培地をデカンテーションし、そして残存する細胞をブランソン(Branson) ソニファイヤー［Sonifier］（商標）（モデル４５０）で設定２で30秒間溶解した。細胞片をその後、冷却微小遠心分離器（４℃）中15,000rpmで10分間の遠心分離により除去した。感染した細胞の超音波処理物のタンパク質濃度を、製造元の指示に従い、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース(Pierce)、イリノイ州ロックフォード）を使用して定量化した。標準曲線をウシ血清アルブミンの既知濃度に基づき調製した。サンプルおよび標準品を37℃で30分間インキュベーションし、そして562nmでの吸光度を分光光度計で測定した。タンパク質濃度を直線回帰分析により各サンプルについて決定した。定量化されたサンプル中の個々のタンパク質をタンパク質電気泳動により分離した。サンプルを脱イオン水で３−４mg／mLタンパク質に希釈した。各サンプル 25μLを電気泳動サンプル緩衝液（3.8mLの脱イオン水、1.0mLの0.5Mトリス塩酸、ｐＨ6.8、0.8mLのグリセロール、1.6mLの10％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、0.4mLのβ- メルカプトエタノール、0.4mLの0.5％ブロモフェノールブルー）75μLに添加した。分子量標準品は、ビオチニル化タンパク質分子量標準品（ギブコ）１μLをサンプル緩衝液100μLで希釈することにより調製した。サンプルおよび標準品をその後95℃で２分間加熱した。サンプルを、15％ミニプロテアンIIトリス塩酸レディゲル(Mini-Protean II Tris-HCl Ready Gel)（バイオラド(Bio-Rad)、ニューヨーク州メルヴィル）上に負荷した（20μL／穴）。電気泳動用泳動緩衝液（脱イオン水１L中３gのトリス塩基、14.4gのグリシン、1.0gのＳＤＳ）を組み立てられた電気泳動ゲル装置に添加し、そしてサンプルをおよそ1.5時間、40mAで電気泳動した。電気泳動後、分離されたタンパク質をウエスタンブロッティングにより電気泳動ゲルからニトロセルロースフィルターに転写した。ブロッター紙（３ＭＭ、シュライヒャーアンドシュエル(Schleicher and Schuell)、ニューハンプシャー州キーン）およびニトロセルロース（ＢＡ−ＳＮＣ；シュライヒャーアンドシュエル）をゲルの近似の寸法に切り、そしてウエスタン転写緩衝液（11.6 gのトリス塩基、ｐＨ8.3、 5.8gのグリシン、0.74gのＳＤＳ、400mLのメタノール、1.6Lの脱イオン水）に浸した。ブロッター紙、ニトロセルロースおよびゲルを以下の順序、すなわちブロッター紙３枚、ゲル、ニトロセルロース、そしてブロッター紙３枚、に集合した。この「サンドイッチ」を、ゲルが陽極に向かいかつニトロセルロース膜が陰極に向かうよう転写装置に置いた。タンパク質を、電流を60mAで４時間転写装置に適用することにより転写した。転写後、装置を分解しそしてニトロセルロースフィルターを風乾させた。転写されたタンパク質のイムノブロット分析を以下の段階により進行し、その全ては室温で回転振とう器上で実行した。転写されたタンパク質により占有されていないニトロセルロース膜上の部位を、ＴＴＢＳ（20mMトリス、500mM塩化ナトリウム、ｐＨ7.5、0.05％トゥイーン−20）に溶解された３％（ｗ／ｖ）ゼラチンでの30分間のインキュベーションによりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、そして膜を100mLのＴＴＢＳ中で５分間洗い流した。ＬｑｈＩＴ２特異的なウサギポリクローナル抗体（カリフォルニア州デービス、カリフォルニア大学デービス校のブルース・ハンモック(Bruce Hammock)博士より得た）を、1 0μLのウサギ抗体を10mLのＴＴＢＳに添加することにより調製した。この一次抗体溶液をブロッキングされたニトロセルロースフィルターに適用しそして１時間インキュベーションした。このインキュベーションの後、ニトロセルロースフィルターを、100mLのＴＴＢＳを３回替えて洗浄し、各洗浄は10分間持続した。二次抗体を、10μLのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス）および10μLのペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを20mLのＴＴＢＳに添加することにより調製した。ニトロセルロースフィルターをこの溶液と１時間インキュベーションした。このインキュベーションの後、フィルターを、100mLのＴＴＢＳを３回替えて洗浄し、各洗浄は10分間持続した。検出試薬(ＥＣＬ検出キット、アマーシャム(Amersham)、イリノイ州アーリングハイツ)をニトロセルロースに適用し、そして60秒間インキュベーションした。検出試薬をフィルターから排出し、そしてフィルターをサランラップで覆った。ニトロセルロースフィルターからのシグナルを、処理された膜をＸ線フィルム（コダック(Kodak) Ｘ−ＯＭＡＴＡＲ、ニューヨーク州ロチェスター）に２−10秒間曝すことにより検出した。全５個のＡｃＬｑｈＩＴ２単離物が7,000Ｍr付近に陽性のイムノブロット応答を提供したが、一方シグナルはＡｃＡａＩＴについては検出されなかった。５個の独立のＡｃＬｑｈＩＴ２単離物を生物学的活性についてスクリーニングした。このアッセイは、ＡｃＬｑｈＩＴ２組み換えウイルスの生物学的活性の野生型ＡｃＮＰＶ（コントロール）およびＡａＩＴ毒素を発現する組み換えＡｃＮＰＶとの比較を伴った。Ｈ．ヴィレセンス(H. virescens)の３齢の幼虫を、試験ウイルスおよびコントロールウイルスを含有する食餌の消費により経口で感染させ、そして挙動の変化および死亡についてモニターした。ＡｃＬｑｈＩＴ２、ＡｃＮＰＶおよびＡｃＡａＩＴに感染した細胞を採集し、そしてＰＩＢを、0.5％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、５M塩化ナトリウムおよび最後に脱イオン水での連続的洗浄により遊離させた。水洗後、遊離されたＰＩＢを少量の脱イオン水に懸濁し、そして血球計算器で計測することにより数え上げた。野生型のＡｃＮＰＶおよびＡｃＡａＩＴに感染した細胞からより有意に少ないＰＩＢおよび細胞片が、感染後３ないし４日のＡｃＬｑｈＩＴ２に感染させたＳｆ−９細胞から産生されたことが示された。昆虫の標準的な食餌の別個の栓(plug)におよそ5000個のＰＩＢを接種した。バイオアッセイの開始前12時間摂食していなかった個々の幼虫を24時間食餌を消費させた。幼虫を食餌トレイ中の個々の穴に移し、そして毎日症状および死亡についてモニターした。これらの最初のバイオアッセイは、ＡｃＬｑｈＩＴ２ウイルスおよびＡｃＡａＩＴウイルスを含有する食餌の消費後の麻痺の誘導を示した。驚くことに、ＡｃＬｑｈＩＴ２は、野生型ＡｃＮＰＶもしくはＡｃＡａＩＴのウイルスのいずれかより迅速に幼虫を殺すようであった。試験されたＡｃＬｑｈＩＴ２単離物のうち３個および最良のＡｃＡａＩＴウイルスをその後の試験のための選んだ。再度、結果は、ＡｃＬｑｈＩＴ２ウイルスがコントロールのいずれよりも迅速な死亡をもたらしたことを指摘した。当該組み換えウイルスの殺虫効果の詳細な評価に着手した。より早期の観察結果は、ＡｃＮＰＶによるＬｑｈＩＴ２の発現が昆虫細胞で細胞毒性効果を生じたことを指摘した。さらに、この細胞毒性効果により、ＡｃＬｑｈＩＴ２についての細胞あたりのＰＩＢの収量は、野生型ＡｃＮＰＶおよびＡｃＡａＩＴに比較して有意に低下した。実際、ＡｃＬｑｈＩＴ２に感染した細胞培養系は、ＡｃＡａＩＴおよび野生型ＡｃＮＰＶについての細胞培養系培地100mlあたり＞1.9×10⁹ 個のＰＩＢに比較して、細胞培養系培地100mlあたり5.03×10⁷個の平均のＰＩＢ数を生じた。より大量のＡｃＬｑｈＩＴ２組み換えＰＩＢさえ調製するために、ウイルスをインビボで増殖させた。ＡｃＬｑｈＩＴ２、ＡｃＡａＩＴおよび野生型ＡｃＮＰＶのインビボで産生されたＰＩＢを獲得するため、予備的バイオアッセイで死亡した昆虫を脱イオン水中のホモジェナイズ化、その後のプローブ超音波処理および細胞片を除去するための濾過により処理した。ＰＩＢをその後、標準的血球計算器を使用して数え上げた。ウイルス誘発性の昆虫の死亡の包括的分析を、Ｈ．ヴィレセンス(H.virescens )の３齢の幼虫を試験ウイルスおよびコントロールウイルスに感染させそして死亡の開始について観察した実験で実行した。プロビット分析プログラム(48)を使用して時間−死亡曲線および用量−死亡曲線を導き（第２表）、そして組み換え（ＡｃＬｑｈＩＴ２およびＡｃＡａＩＴ）ならびに野生型ＡｃＮＰＶの生物活性での有意差について検定した。致死時間（ＬＴ）を、飢えさせた昆虫を栓あたり 2500個のＰＩＢを接種された食餌栓を24時間給餌することにより導いた。これらの昆虫をその後、食餌の個々の穴に移し、そして死亡および／もしくは麻痺についてルーチンでモニター（最低１日２回）した。ＡｃＬｑｈＩＴ２、ＡｃＡａＩＴおよび野生型ＡｃＮＰＶについての近似のＬＴ₅₀（曝された昆虫の50％を殺す時間；８回の繰り返し実験、繰り返し実験あたり16匹の幼虫、処理あたりｎ＝昆虫128匹）は、それぞれ感染後82.7、97.9および118時間であった。最尤比検定（同等の傾きおよび切片、Ｃ．Ｉ．＝0.95）は処理間の有意差を示した。すなわち、組み換えウイルス、ＡｃＬｑｈＩＴ２およびＡｃＡａＩＴは、野生型ＡｃＮＰＶに感染した幼虫より有意に小さいＬＴ値を有した。さらに、ＡｃＬｑｈＩＴ２およびＡｃＡａＩＴの組み換えウイルスの傾きおよび切片（Ｃ．Ｉ．＝0.95）の直接の比較は、ＡｃＬｑｈＩＴ２についてのＬＴ₅₀値がＡｃＡａＩＴについてのものより有意に小さいことを確認した。第二の一組の実験で致死用量（ＬＤ）を決定した。Ｈ．ヴィレセンス(H．vire scens)の３齢の幼虫に、ＡｃＬｑｈＩＴ２、ＡｃＡａＩＴ、野生型ＡｃＮＰＶを接種された食餌および接種されない栓を給餌した。溶融させた食餌を、サンプル群について用量−反応曲線を確立するため、ウイルスの変化する用量で調製した。食餌栓のＰＩＢ濃度は対数用量で食餌１mLあたり１×10²から１×10⁴個のＰＩＢに及んだ。試験は、摂食後94と106時間との間の死亡についてモニターした。ＡｃＬｑｈＩＴ２、ＡｃＡａＩＴおよび野生型ＡｃＮＰＶについての近似のＬＤ₅₀ （曝された昆虫の50％を殺すのに必要とされるＰＩＢの数；４回の繰り返し実験、繰り返し実験あたり25匹の幼虫、処理あたりｎ＝昆虫100匹）は、それぞれ8 .29×10²、9.15×10²および1.19×10³個ＰＩＢ／mLであった。最尤比検定（同等な傾きおよび切片、Ｃ．Ｉ．＝0.95）は３種のウイルス処理の効力の間で有意差を示さなかった（第２表）。当該ウイルス類の有効性のさらなる評価を、メトロミックス(METROMIX)３５０生育媒体（グレース・シエラ(Grace-Sierra)、カリフォルニア州ミルピタス）で満たされた４インチ平方の鉢に植えられた２週齢のダイズ（ウィリアムズ(Willi ams)）植物で行った。これらの植物は温室で26℃で栽培した。Ｈ．ヴィレセンス (H．virescens)の２齢の幼虫をウイルス処理に24時間曝した。この処理は、処理された昆虫の99％より大きな致死的な感染をもたらすよう算出された濃度で食餌中に取り込まれた。この曝す期間の後、感染した昆虫を植物に移した。植物の設定は、開いた上部のある透明のプラスチックチューブに閉じ込められた１本のダイズ植物から成った。白色珪砂の層を鉢植え媒体の上面に置き、従って、落下された昆虫は容易に同定され得た。３匹の処理された昆虫を植物上に置きそしてユニットの上部を閉じた。処理あたり10本の植物を使用した。試験ユニットは、16時間明るくかつ８時間暗いサイクルの植物一時保存室に保管し、そして必要とされるように水を与えた。試験期間の終結時（処理された全ての昆虫の死）に試験ユニットを分解し、そして植物材料を、リコール(Li-Cor) 葉表面積計測器（リコール(Li-Cor)、ネブラスカ州リンカーン）を採用して定量化した。残存する平均の植物面積は、野生型ＡｃＰＮＶ、ＡｃＡａＩＴおよびＡｃＬｑｈＩＴ２についてそれぞれ154、199、223cm²であり、一方、処理されない（コントロール）植物は材料の243cm²の平均を有した。これらのデータは、荒らされない植物と比較した場合に、野生型ＡｃＮＰＶ、ＡｃＡａＩＴおよびＡｃＬｑｈＩＴ２についてそれぞれ63.6、82.2および92.1％の植物保護を指摘する（第７図）。明らかに、毒素を発現する組み換えウイルスは増大された保護を提供し、また、ＡｃＬｑｈＩＴ２はＡｃＡａＩＴより有意に大きな保護を提供する。実施例３バキュロウイルス初期プロモーターの転写制御下に合成ＬｑｈＩＴ２構造遺伝子を含む組み換えＡｃＰＮＶの構築および試験実施例２に記述されたと同じ様式で、実施例１からの精製されたＬｑｈＩＴ２構造遺伝子断片を、バキュロウイルス伝達ベクターｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３（テキサス州カレッジステーション、テキサスＡ＆Ｍ大学テキサス農学実験ステーション(Texas Agricultural Experiment Station，Texas A&M University，Colleg e Station，TX)、ドナルド・ヤルヴィス(Donald Jarvis)博士より提供された）のBglIIクローニング部位に挿入した。このプラスミド伝達ベクターは、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,162,222号に記述されるバキュロウイルス初期プロモーター伝達ベクターの誘導物である。この構築物は、バキュロウイルス初期ＩＥ１プロモーターおよびｈｒ５エンハンサー領域の下流にＬｑｈＩＴ２毒素をコードする合成構造遺伝子の挿入をもたらす。連結後、プラスミドＤＮＡを大腸菌(E．coli)ＸＬ１ブルー（ストラタジーン）に形質転換した。この連結の結果として、BglIIおよびBamHIの双方の切断部位が破壊され、そして結果として生ずる形質転換体を、ＬｑｈＩＴ２遺伝子の３’末端に配置される唯一の非対称のSphI部位を含有するプラスミドの保有についてスクリーニングした。 23個のSphI陽性クローンを、24個の形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの電気泳動分析から同定した。挿入の方向は、SphI（ＬｑｈＩＴ２遺伝子の３ ’末端で切断する）およびStuI（伝達ベクター中のBglIIクローニング部位の下流に存在するマルチクローニング部位のコード配列内で切断する）で同時に切断されたプラスミドの分析により確認した。８個のクローンを分析し、そのうち４個が、初期ＩＥ１プロモーター／ｈｒ５エンハンサー領域からの転写の方向に関して正しい方向にＬｑｈＩＴ２遺伝子を保有した。クローンの１個、ＣＧ２０１ −３からのＤＮＡを単離し、そして、実施例２に記述されたプロトコールに本質的に従ったコトランスフェクションにより組み換えバキュロウイルス発現ベクターを創製するのに利用した。プラークを単離しそして組織培養系で増殖させ、そして、殺虫活性を実施例２に記述されたプロトコールに従ったバイオアッセイにより決定した。Ｈ．ヴィレセンス(H．virescens)の新生幼虫を、試験ウイルスおよびコントロールウイルスで感染させ、そして死亡の開始について観察した。この一組のバイオアッセイのために、ウイルスを1.0×10⁴個ＰＩＢ／mLの濃度で昆虫の食餌中に組み込んだ。プロビット分析プログラム(48)を使用して、時間−死亡曲線を導きかつ組み換えウイルス（ＣＧ２０１−３−１およびＡｃＬｑｈＩＴ）ならびに野生型ＡｃＮＰＶの生物活性での有意差について検定した。ＣＧ２０１−３−１、ＡｃＬｑｈＩＴおよび野生型ＡｃＮＰＶについての近似のＬＴ₅₀（処理された昆虫の50％についての死亡時間）は、それぞれ44.4、61.5および91.0であった（４回の繰り返し実験、繰り返し実験あたり25匹、処理あたりｎ＝100匹の昆虫；第３表）。最尤比検定（Ｃ．Ｉ．＝0.95）は処理間での有意差を示し、組み換えウイルスのいずれかの適用は野生型ＡｃＮＰＶでの処理より迅速な死亡をもたらすことを指摘した。より特定しては、ＣＧ２０１−３−１はＡｃＬｑｈＩＴより有意に小さなＬＴ値を有し、この組み換えウイルスが処理された昆虫をより迅速に殺すことを指摘した。このデータは、昆虫特異的毒素をコードするコドンを偏らせた合成構造遺伝子の発現をさせるための初期プロモーターの利用が、同一の構造遺伝子の発現が後期プロモーターにより制御されるウイルスに比較して死亡の時間を27.8％短縮させることを示す。さらに、これらのデータは、初期プロモーターの転写制御下に合成の毒素遺伝子を発現するウイルスは、処理された昆虫の幼虫の死亡時間を、非組み換えの野生型ＡｃＮＰＶでの処理と比較した場合に50％より大きく短縮させることを指摘する。実施例４サソリレイウルスキンケストリアツスヘブラエウス(Leiurus quinquestri atus hebraeus)から単離されたＬｑｈＩＴ２遺伝子の相補ＤＮＡに基づく合成ＬｑｈＩＴ２構造遺伝子を含む組み換えＡｃＮＰＶの構築および試験ｃＤＮＡバージョンに対しての、ＮＰＶのコドンに偏らせたＬｑｈＩＴ２遺伝子により提供される増大された有効性を評価するため、ｃＤＮＡ遺伝子を、実施例１、２および３で記述されたものに類似の方法により、合成しそしてＡｃＮＰＶウイルスゲノム中に組み込んだ。合成ｃＤＮＡＬｑｈＩＴ２遺伝子を、実施例１で記述されたコドンを偏らせたＬｑｈＩＴ２遺伝子に類似の様式で、生じさせ、単離し、サブクローニングしそして配列決定した。ＬｑｈＩＴ２遺伝子のｃＤＮＡの形態を調製するため、10 個のオリゴヌクレオチドを標準的なホスホラミディート（phosphramadite）の化学により設計しかつ合成した。これらのオリゴヌクレオチドをギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイタースバーグ）キナーゼを使用してリン酸化し、アニーリングし、そして第３図に描かれた略図に従いかつ製造元の推奨されたプロトコールを採用してギブコ／ＢＲＬリガーゼを使用し連結した。連結された断片をその後、製造元のプロトコールおよび下に記述される改変に従って、パーキン−エルマーシータスアンプリタックポリメラーゼ（コネチカット州ノーウォーク）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲ増幅後、遺伝子生成物を、オリジナルＴＡクローニングキット（インヴィトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州サンジエゴ）に提供されるプロトコールに従い、ｐＣＲＴＭIIベクター中にクローニングした。連結、形質転換および制限酵素切断地図分析後、いくつかのクローンを配列決定し、そして、１個のクローンがボンビキシンのシグナル配列およびＬｑｈＩＴ２遺伝子のｃＤＮＡバージョンをコードすることを確認した。当該遺伝子をバキュロウイルス伝達ベクターｐＡｃＰ＋ＩＥ１ＴＶ３のSacI／NotIクローニング部位に挿入した。組み換えＡｃＮＰＶを、実施例２に記述された詳細に従ったプロトコールを使用して構築した。ｃＤＮＡＬｑｈＩＴ２遺伝子（ＩＣ７３５）をコードする５個の候補の組み換えウイルスの増殖後、ウイルスを有効性について試験し、そして致死時間値に関して最良のウイルス単離物を選択した。致死時間の特徴づけを、Ｈ．ヴィレセンス(H．virescens)の新生幼虫ならびに３齢および４齢の幼虫で、コドンが至適化されたＡｃＬｑｈＩＴ２（ＣＧ２０１−３−１）、ＡｃＬｑｈＩＴ２のｃＤＮＡバージョン（ＩＣ７３５−１）、および野生型ＡｃＮＰＶ（ＩＣ２００−２７）について実行し、殺す時間でのいずれかの有意差を決定した（第４表）。３齢および４齢の幼虫についてはダイエットピルアッセイを利用してＬＴ₅₀値を決定した。ウイルスのストック調製物を、ライヒェルト-ユング(Reichert-Jun g)の輝線血球計算器を使用して定量化した。ウイルス懸濁液は1000−2000個ＰＩＢ／μLの最終濃度に脱イオン水中で調製した。個々の50μLのダイエットピルを、16穴ポリスチレンバイオアッセイトレイの各穴に置いた。5000個のＯＢの用量を各50μLのダイエットピルの表面に適用し、そしてウイルス処理を乾燥させた。１匹の幼虫をその後、各穴内に置き、穴をシールしそして28℃インキュベーションした。ダイエットピルの完全な消費に際して（およそ24時間）、幼虫を処理されていない昆虫培地に移し、そして死亡について１日２回評価した。新生幼虫については、食餌取り込みアッセイをＬＴ₅₀値を決定するのに利用した。ストックウイルス調製物を、ライヒェルト-ユングの輝線血球計算器を使用して定量化し、そして脱イオン水で1.0×10⁵個ＰＩＢ／mLの濃度に希釈した。最終の10倍希釈は昆虫培地で実行した。ウイルスを含有するこの培地を30秒間混和して、1.0×10⁴個ＰＩＢ／mLのウイルス閉塞体の均一な懸濁液を確実にした。当該培地をその後、ポリスチレントレイの小室に注いだ。各トレイは25個の小室を含有した。およそ２mLの食餌を各小室に適用した。接種された培地の凝固に際し、１匹の新生のＨ．ヴィレセンス(H．virescens)幼虫を各小室内に置いた。小室をシールしそして28℃でインキュベーションした。幼虫の死亡についての評価を１日２回実行した。これらの実験からのデータを、ヴィスタット(Vistat)統計学的分析パッケージ (50)を使用して分析した。試験された全３種の幼虫段階について、コドンを偏らせたＬｑｈＩＴ２遺伝子をコードするＣＧ２０１−３−１は、ＩＣ７３５−１（ＬｑｈＩＴ２のｃＤＮＡバージョン）およびＩＣ２００−２７（野生型ＡｃＮＰＶ）より迅速に昆虫の幼虫を殺した。コドンを至適化されたＣＧ２０１−３−１についてＩＣ７３５−１と比較したＬＴ₅₀値の減少は、Ｈ．ヴィレセンス(H．vi rescens)の３齢および４齢の幼虫について統計学的に有意であり、殺す時間の短縮はそれぞれ22％および９％であった（第４表）。これらの差異は新生および３齢の幼虫についてのＬＴ₉₀でより劇的でさえあり、コドンを至適化された構築物ＣＧ２０１−３−１で殺す時間でそれぞれおよそ15％および32％の短縮であった(48)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．バキュロウイルスのもしくはバキュロウイルスが複製する細胞のコドンの偏りに基づき遺伝子発現のために至適化されているコーディングヌクレオチド配列を含んでなる昆虫選択的神経毒をコードする合成遺伝子。２．前述の遺伝子が昆虫選択的抑制性神経毒をコードする、請求の範囲１の合成遺伝子。３．前述の遺伝子がＬｑｈＩＴ２昆虫選択的抑制性神経毒をコードする、請求の範囲２の合成遺伝子。４．前述の至適化が、バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子のコーディング領域のコドンの偏りに基づく、請求の範囲１の合成遺伝子。５．配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲４の合成遺伝子。６．適するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に同じ読み取り枠で融合させた請求の範囲１の合成遺伝子を含む合成遺伝子。７．適するシグナルペプチドがボンビキシン由来である、請求の範囲６の合成遺伝子。８．配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲７の合成遺伝子。９．昆虫細胞でのキメラ遺伝子のコーディング配列の発現を支配するひとつもしくはそれ以上の調節配列に操作可能に連結された、請求の範囲６の合成遺伝子を含むキメラ遺伝子。１０．調節配列が、初期プロモーター、前初期プロモーター、後期プロモーターおよび非常に後期のプロモーターの群から選択されたバキュロウイルスプロモーターを含む、請求の範囲９のキメラ遺伝子。１１．請求の範囲１の合成遺伝子を含む組み換えバキュロウイルス。１２．請求の範囲６の合成遺伝子を含む組み換えバキュロウイルス。１３．請求の範囲９の合成遺伝子を含む組み換えバキュロウイルス。１４．ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＶＲ−２５０１およびＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＶＲ−２５０２により指定される組み換えバキュロウイルスの群から選択される、請求の範囲１３の組み換えバキュロウイルス。１５．請求の範囲１１−１４のいずれかひとつによる組み換えバキュロウイルスおよびそのための適する担体を含む、殺虫組成物。１６．請求の範囲１１−１４のいずれかひとつによる組み換えバキュロウイルスの殺虫的に有効な量を節足動物もしくはそれらの環境に適用することを含む、節足動物の制御方法。１７．それぞれの遺伝子のひとつを含有するバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞で、昆虫選択的神経毒をコードするコドンを偏らせない遺伝子より高度に発現される昆虫選択的神経毒をコードするコドンを偏らせた合成遺伝子を設計する方法であって、当該方法がａ．バキュロウイルスに感染した昆虫細胞で発現されるべきタンパク質をコードするコドンを偏らせない遺伝子のコーディングヌクレオチド配列を決定すること、ｂ．コドンを偏らせない遺伝子のコーディングヌクレオチド配列の一部をコドンの偏りに基づき改変して、前述のコーディングヌクレオチド配列が含有するよりも、バキュロウイルスによりもしくは意図された昆虫宿主細胞により好まれるコドンのより多数を含有する、改変されたコーディングヌクレオチド配列を得ること、を含む方法。１８．前述の改変が、核多角体ウイルスのポリヘドリン遺伝子のコドンの偏りに基づく、請求の範囲１７の方法。