TWI577802B - 胞外分泌型豬環狀病毒重組外殼蛋白類病毒顆粒（ＰＣＶ２ Ｃａｐ ＶＬＰ），其製備方法及於次單位疫苗之應用 - Google Patents
胞外分泌型豬環狀病毒重組外殼蛋白類病毒顆粒（ＰＣＶ２ Ｃａｐ ＶＬＰ），其製備方法及於次單位疫苗之應用 Download PDFInfo
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Description
本發明係關於胞外分泌型豬環狀病毒重組外殼蛋白類病毒顆粒之製備方法，以及所製得之胞外分泌型重組外殼蛋白類病毒顆粒於次單位疫苗之應用。更特別地，本發明係關於利用桿狀病毒表現系統、昆蟲細胞及無血清培養液，製備胞外分泌型豬環狀病毒重組全長外殼蛋白Cap蛋白，以及該胞外分泌型Cap重組蛋白自我組裝成之類病毒顆粒VLP於製備抗-PCV2次單位疫苗之應用。
豬環狀病毒病毒(Porcine circovirus；PCV)為不具封套之病毒，其核酸是由單股環狀DNA所構成(Tischer I.等人，Nature 295：64-66,1982)，於1974年首度在PK-15細胞株中被檢測到(Tischer I.等人，Zentralbl Bakteriol Orig A 226：153-167,1974)。90年代末一種變異之PCV出現，造成豬隻產生離乳後多系統消耗性綜合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome；PMWS)(Allan G.M.等人，J Vet Diagn Invest 10：3-10,1998)，經基因序列比對結果顯示，汙染PK細胞豬隻病毒與造成PMWS之病毒之基因序列間具有顯著性差異存在，因此將其區分為2型，其中汙染PK細胞株之病毒為第一型(PCV1)，對豬隻不具有病原性，而造成PMWS之病毒則為第二型(PCV2)(Hamel A.L.等人，J Virol 72：5262-7,1998；Meehan B.M.等人，J Gen Virol 79：2171-9,1998)。
豬環狀病毒二型被認為是引起豬環狀病毒相關疾病的主要原因，病豬臨床上常見漸進性消瘦、虛弱、呼吸困難、淋巴結腫大，並偶發皮膚蒼白、黃疸與下痢等症狀(Grau-Roma L.等人，Vet J. 187：23-32,2011)，是造成現今養
豬產業重大經濟損失的重要性疾病。而對於本疾病的防治，除了落實良好的環境衛生管理之外，疫苗的使用是目前被認為較具成效的方法。
PCV2隸屬於環狀病毒科(Circoviridae)，具有一單股環狀大小約為1.7kb之DNA，其中包含兩段主要的開放讀窗區(open reading frame)，分別是與病毒複製相關的ORF1(replication associated,rep gene)以及病毒的外殼蛋白ORF2(capsid protein；cap gene)；其中ORF2所轉譯的病毒外殼蛋白，含有主要的抗原決定位，具有能夠引起感染豬隻血清中和抗體的能力(Nawagitgul P.等人，J Gen Virol 81：2281-7,2000)。
PCV核酸序列中的ORF2又可稱為cap基因，其所轉譯出的Capsid蛋白質，在PCV1由232個胺基酸所組成，而在PCV2則由233個胺基酸所組成，是目前PCV2中所發現唯一的結構蛋白(Liu J.等人，Virology 347：422-33,2006；Mankertz J.等人，Virus Genes 16：267-76,1998)。分析PCV1與PCV2兩者之ORF2核酸序列，兩者之同源性僅有67%，而胺基酸之相似性則為65%(Hamel A.L.等人，J Virol 72：5262-7,1998；Meehan B.M.等人，J Gen Virol 79：2171-9,1998；Morozov I.等人，J Clin Microbiol 36：2535-41,1998)，顯示PCV2與PCV1之間主要差異之序列存在於ORF2區。若將PCV1基因體中之ORF2序列置換為PCV2之ORF2序列，並將此具有感染性的質體DNA接種於豬隻肝臟及淋巴結中，所產生的病變與PCV2病毒感染相似，因此推測病毒之毒力基因可能位於ORF2之中(Fenaux M.等人，J Virol 77：11232-43,2003)。
由ORF2序列轉譯而成之Capsid protein，其N’端具有一連串的精胺酸殘基(arginine residues)，形成細胞核定位訊息(nuclear localization signal；NLS)，被認為用來包裹病毒DNA而形成病毒外殼的內部區域(Crowther R.A.等人，J Virol 77：13036-41,2003)，可將ORF2所表現的蛋白質侷限在細胞核中；但若將N’端的41個胺基酸切除，或改變其序列，ORF2
所表現的蛋白質則可觀察到為分布於細胞質中(Liu Q.等人，Virology 285：91-9,2001；Liu Q.等人，Protein Expr Purif 21：115-20,2001)。將PCV2以PK-15細胞進行繼代120代(viral passage 120；VP120)，比較第一代病毒(VP1)與VP120，發現第120代病毒能更有效率的進行複製；進一步分析兩者間的基因序列之差異，發現第120代病毒之胺基酸序列在ORF2區域有兩處突變，分別是在110的位置由脯胺酸(porline)轉換為丙胺酸(alanine)；以及在191的位置由精胺酸(arginine)轉變成為絲胺酸(serine)。進一步將VP1以及VP120接種於SPF豬隻，結果在接種VP1的豬隻，具有較嚴重的病毒血症及病理變化，顯示Cap protein在這兩處的突變，能夠增進病毒的生長速率，並且減低病毒之毒力(Fenaux M.等人，J Virol 78：13440-6,2004)。
PCV2全基因體與ORF2基因序列進行系統發育研究或演化樹分析(phylogenetic study)，發現PCV2分離株可區分成3種基因型(genotype)：PCV2a、PCV2b、PCV2c(An D.J.等人，Virus Res. 129(2)：115-22,2007；Horlen,K.P.等人，Journal of Swine Health Production 15：270-278,2007；Olvera,A.等人，Virology 357,175-185,2007)。PCV2a與PCV2b的主要差異在於ORF2基因的第262~267個核酸序列，PCV2a的序列為CCCCG/TC，PCV2b的序列為AAAATC(An et al.,2007)；後來的研究發現，PCV2a與PCV2b存在大多數的國家，而PCV2c僅存在丹麥。在台灣，王等人在2013的研究發現PCV2分離株早先以PCV2a為主，但從2003到2013，大多數分離株有77.1%屬於PCV2b(Wang等人，Research in Vet Science 94：789-795,2013)，作者推測PCV2a基因型可能會發生轉變成PCV2b，而PCV2b是目前亞洲地區廣泛流傳的病毒株。
其他研究發現PCV2a與PCV2b的毒力不同，PCV2a與PCV2b混合感染豬隻可造成最嚴重的PMWS病變，PCV2b感染的豬隻所造成的病變又較PCV2a為嚴重
(Wiederkehr,D.D.等人，Vet.Microbiol.136,27-35,2009；Harding,J.C.等人，Vet.Microbiol.145,209-219,2010)。然而，目前尚無針對亞洲地區廣泛流傳的PCV2b病毒株製作類病毒顆粒次單位疫苗。
雖然已有文獻揭示將PCV2a ORF2基因選殖入桿狀病毒並且由昆蟲細胞培養在含胎牛血清培養液，可表現重組的Cap蛋白於細胞內，並經由細胞溶解作用自細胞中萃取Cap蛋白，大小約30kDa，具有組裝成PCV2結構蛋白，並可與抗-PCV2抗體產生特異性作用(Nawagitgul P.等人，J Gen Virol 81：2281-7,2000)。但是由於此製造過程繁瑣費時且經濟成本高；另外，自細胞中萃取Cap蛋白之產量有限，需藉由大量桿狀病毒感染大量細胞以獲得足量之重組Cap蛋白用於疫苗及其類似物；此外，含胎牛血清之細胞培養液由於有牛海綿狀腦病(或稱狂牛症)疑慮(Yanaqihara K.等人，Biotechnol Appl Biochem 45：59-64,2006)，且可能導致被免疫動物發生急性過敏反應之風險(Ohmori K.等人，Vet Immuno Immunopathol 104：249-56,2005)，在動物疫苗製造上將不被接受。因此，有需要改良原有之桿狀病毒表現系統，使用無動物來源血清之細胞培養液，製備可藉由細胞裂解方式釋放至細胞外的PCV2外殼蛋白Cap，以期經由簡單的濃縮與過濾程序製備成PCV2次單位疫苗之抗原。目前的商品化PCV2疫苗都是針對PCV2a，有別於目前商品化之環狀病毒疫苗，本重發明係選取豬環狀病毒PCV2b病毒株之田間分離株(Porcine circovirus type 2 Taiwan YL isolate)作為標準選殖株，製備胞外分泌型豬環狀病毒重組外殼蛋白類病毒顆粒(PCV2b Cap VLP)，並將其應用於次單位疫苗之製備。
基於上述目的，本發明遂首先將豬環狀病毒PCV2b Taiwan YL分離株之全長外殼蛋白(Cap)基因選殖入一
具有訊息序列(signal sequence)之轉移質體(transfer vector)的多重選殖切位(MCS)中，並在Cap基因的3’端接上一段His標幟序列，將構築完成之重組轉移質體與桿狀病毒線型DNA進行同源重組(homologous recombination)，而構築得到一重組桿狀病毒表現分泌系統(baculovirus expression-secretion system)。接著利用昆蟲細胞作為表現宿主，進行豬環狀病毒PCV2全長外殼蛋白的大量表現。昆蟲細胞在無血清培養液中進行懸浮培養並接種重組桿狀病毒，並自培養液回收得到已被釋放至細胞外之重組外殼蛋白。
於是，本發明之一方面係關於，一種製備胞外分泌型豬環狀病毒全長外殼蛋白(PCV2b Cap)的類病毒顆粒之方法，其特徵在於利用桿狀病毒表現系統、無血清培養液及昆蟲細胞，大量表現重組Cap蛋白並經細胞裂解而釋放至培養液中，及於培養液回收重組Cap蛋白。
於本發明之一具體實施態樣，所述之胞外分泌型豬環狀病毒重組Cap蛋白的類病毒顆粒之製備方法包含：製備重組分泌轉移質體，該轉移質體包含一訊號肽、多重選殖切位及PCV2基因型2b cap基因片段；將該重組分泌轉移質體轉移至Baculovirus製備重組桿狀病毒vBac-PCV2 genotype 2b/Cap株；將該重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，在無血清培養液中大量生產胞外分泌型豬環狀病毒重組Cap蛋白類病毒顆粒；及自培養液純化及回收重組Cap蛋白類病毒顆粒。
於本發明之一項具體實施態樣，所述之訊號肽為bombyxin訊號肽。於本發明之一項具體實施態樣，所述之重組Cap蛋白係受p10啟動子調控。於本發明之另一項具體實施態樣，所述之昆蟲細胞為High-Five昆蟲細胞。
本發明之另一方面，係關於一種重組桿狀病毒vBac-PCV2/Cap株，其包含胞外分泌型重組轉移質體pAcP10-SP：Cap，寄存編號為BCRC940657。
本發明之又一方面，係關於一種第二型豬環狀病毒(PCV2)疫苗之製備方法，其包含將本發明之重組桿狀病毒vBac-PCV2/Cap株接種於High-Five昆蟲細胞與無血清培養液；將培養物於27℃，180rpm懸浮培養7~8天；離心後收取上清液；將所得之上清液過濾並濃縮製得抗原原液；及將該抗原原液乳化而製得疫苗。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之疫苗製造方法進一步包含於乳化前將抗原不活化之步驟。
本發明之又一方面，係關於一種由本發明之方法製備得之第二型豬環狀病毒(PCV2)疫苗。於本發明之一些具體實施態樣，所述之疫苗包含由本發明之方法製備得之重組分泌型豬環狀病毒Cap蛋白的類病毒顆粒。
圖1為胞外分泌型重組轉移質體pAcP10-SPbbxMCS之圖譜。
圖2為使用豬抗PCV2多價血清偵測High-Five昆蟲細胞感染病毒後表現之PCV2重組Cap蛋白；其中C：昆蟲細胞均質液，Su：細胞培養液。
圖3係偵測High-Five昆蟲細胞感染重組桿狀病毒後細胞培養液中PCV2重組Cap蛋白之表現情形。(A)以12% SDS-PAGE。(B)於西方墨點法，分析不同時間點之細胞培養液中PCV2重組Cap蛋白，鼠抗His tag單株抗體可偵測到26kDa蛋白條帶。Dpi：感染後的天數。
圖4係以穿透式電子顯微鏡觀察PCV2重組Cap蛋白在細胞培養液中可自行組裝成類病毒顆粒(arrow)，大小約17nm。(A)放大倍率20萬倍；(B)放大倍率40萬倍。
圖5係顯示PCV2陰性SPF豬隻於免疫PCV2重組次單位疫苗後，其血清抗體力價測試結果。
圖6為PCV2陰性SPF豬隻於免疫PCV2重組次單位疫苗
後，其血清中PCV2中和抗體力價測試結果。
圖7係顯示攻毒後，PCV2陰性SPF豬隻血清中PCV2病毒載入量(viral loads)之變化。
圖8係顯示商業豬隻於免疫PCV2重組次單位疫苗後，其血清中PCV2中和抗體力價測試結果。* p<0.05。
圖9係顯示攻毒後，豬隻血清中PCV2病毒載入量(PCV2 viral loads)之變化。* p<0.05。
圖10係顯示攻毒犧牲後，試驗豬隻腸繫膜淋巴結(MLN)、肺門淋巴結(HLN)及鼠蹊淋巴結(ILN)中PCV2病毒載入量。* p<0.05。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
本實例以豬環狀病毒Porcine circovirus genotype type 2b Taiwan YL分離株之total DNA做為模版，選殖其cap基因(NCBI GenBank：AY885225)，以Pfu聚合酵素(MBI,Fermentas)進行cap基因之聚合酵素連鎖反應(PCR)，引子選用：PCV/cap-F(SacI)：5-TGAGCTC TGACGTATCCAAGGAGGCGT-3(SEQ ID No：1)；PCV/cap-R(SpeI)：5-TAACTAGTTTAATGATGATGATGATGATG-3(SEQ ID No：2)，並利用此對引子在PCR產物的兩端創造出不同限制酵素切位(restriction enzyme cutting site)，包含SacI與SpeI，並在3’端創造一段His標幟序列。
委託國外生物科技公司(Bio-Basic company,
Canada)以人工合成核酸序列技術合成一段DNA序列，此DNA片段包含69個核苷酸的bombyxin訊號肽(SPbbx,NCBI GenBank：D00340)與67個核苷酸的多重選殖切位(multiple cloning sites,MCS)，並在此DNA片段兩端創造出BglII與EcoRI切位；將商品轉移質體pAcUW21(BD Bioscience)以限制酵素BglII與EcoRI作用後，自瓊脂凝膠中回收9.2kb的基因片段，再與SPbbx：MCS DNA片段進行接合反應(ligation)，即構築成分泌轉移質體pAcP10-SPbbxMCS(質體圖譜如圖1所示)。
將上述之cap PCR增幅產物使用限制酵素SacI與SpeI進行作用後，同樣自瓊脂凝膠中回收基因片段，將回收後之基因片段與分泌轉移質體pAcP10-SPbbxMCS，使用T4 DNA ligase於16℃水浴中進行接和反應，作用時間約16小時；將接合後之重組質體以熱休克法轉型至大腸桿菌(Escherichia coli,TG1 strain)，然後將轉型作用後之大腸桿菌塗佈於選擇性培養基上(LB瓊脂平板/苄青黴素100μg)，於37℃培養箱中隔夜培養；隨機挑選單一菌落後，以前述方法進行篩選出重組載體pAcp10-PCV2/Cap。將轉型成功之E.coli菌株接種於5mL培養液(LB培養液/苄青黴素100μg)中，於37℃培養箱中，經200rpm震盪培養隔夜後，再以26%甘油保存於-70℃。
分泌型重組轉移質體pAcP10-SP：Cap經定序無誤後，利用光電比色計在波長260nm下估計重組質體之DNA濃度。再與BD BaculoGoldTM Linearized Baculovirus DNA進行共轉染反應。將前一日以1：1繼代之Sf9細胞數目調整為8×105/mL，接種1ml於6孔細胞培養盤中，並加入1mL完全Grace's培養基(含有10% FBS)，靜置於27℃培養箱中6小時，使細胞完全貼附。同時準備細胞轉染液：取純化後之2μg pAcP10-SP：Cap DNA與0.5μg BaculoGoldTM Linearized Baculovirus DNA加入100μL之空白Grace’s昆蟲培養基中，混合後靜置於室溫下5分鐘。另取Cellfectin® Reagent 6μL
與100μL之空白Grace’s昆蟲培養基混合後，與上述含有載體及Baculovirus DNA之混合液混合均勻，靜置於室溫下20分鐘，最後加入800μL空白Grace’s昆蟲培養基使總量為1mL，是為細胞轉染液(transfer mixture)。取2mL空白Grace’s昆蟲培養基小心的沖洗6孔細胞培養盤中之細胞，洗去未貼附以及活性較差之細胞，然後加入細胞轉染液，置於27℃培養箱中培養6小時；之後去除細胞轉染液，加入2mL完全Grace's培養基，置於27℃培養箱中培養，96小時後將含有第一代重組病毒病毒vBac-PCV2/Cap之培養液回收，以3,000rpm離心15分鐘，1mL保存於4℃，1mL保存於-70℃。
於500mL細胞懸浮培養瓶(shaking flask)中，加入2×108個High-Five昆蟲細胞(2×106 cells/mL)，懸浮於無血清培養液中，加入2~5 M.O.I.重組桿狀病毒vBac-PCV2/Cap，於27℃懸浮培養5~8天；以免疫螢光染色法偵測被病毒感染之細胞是否能產生PCV2重組次單位蛋白Cap。病毒感染96小時後的High-Five昆蟲細胞以Fisher’s formalin溶液進行固定；以PBST水洗，加入1,000x稀釋之抗-PCV2單株抗體於4℃反應12小時；以PBST水洗，加入1,000x稀釋之山羊抗-小鼠IgG-FITC抗體於25℃反應1小時；以PBST水洗，置於倒立螢光顯微鏡下可觀察到細胞內呈現特異性螢光反應，而以可見光觀察可見到被感染之細胞內具有明顯桿狀病毒包涵體。
間隔24小時收集一次重組桿狀病毒感染之細胞培養液，以SDS-PAGE蛋白質膠體電泳及西方墨點法分析重組蛋白之分子量、蛋白質質譜分析與抗原性。由圖3顯示，含有SPbbx片段與全長Cap蛋白的融合蛋白會表現在被感染的昆蟲細胞細胞質中，此融合蛋白的分子量為29kDa(上方箭頭)；融合蛋白通過細胞膜時，會被肽酶(peptidase)切除其N端的SPbbx片段，而僅重組Cap蛋白能夠被釋放到昆蟲培養液
中，此重組Cap蛋白的分子量為26kDa(下方箭頭)。圖3顯示，以重組桿狀病毒感染High-Five細胞後第5天，即可在培養液中偵測到重組Cap蛋白，且於第7~8天，重組Cap蛋白的產量可達到最高峰。本發明之胞外分泌型PCV2重組Cap蛋白之胺基酸序列係如SEQ ID No：3所示。
此外，收集感染後7天之細胞培養液以0.22μm filter過濾後，濾液緩慢注入等體積之40% sucrose cushion上層，以低溫超高速離心機於10℃、47,000g離心6小時；將沉澱團塊懸浮於200μL Tris/NaCl buffer(50mM Tris,50mM NaCl,pH8.0)；懸浮液再以4℃、12,000rpm離心10分鐘，保留上清液進行穿透式電子顯微鏡觀察(TEM)；上清液以銅網吸附1分鐘，使用2% uranly acetate染色45秒後即可上機觀察，分析細胞培養液中Cap重組蛋白是否能自我組裝成類病毒顆粒(virus-like particle,VLP)。圖4顯示以穿透式電子顯微鏡觀察，PCV2重組Cap蛋白在細胞培養液中可自行組裝成類病毒顆粒(箭頭所示)，大小約17nm。
本試驗之目的為評估以天竺鼠作為PCV2重組次單位疫苗於安全與效力試驗自家檢驗方法之可行性，做為本疫苗成品未來批次自家檢驗有效抗原含有量之參考依據。由國家實驗動物中心購買成年雌性SPF天竺鼠，所進行試驗之天竺鼠共6隻，採隨機分配方式分為免疫組與對照組，其中免疫組有4隻，而對照組則有2隻。引進後隨即送入隔離實驗動物房內，並依照實驗室之規定進行本試驗。
本試驗所使用之疫苗，是將所生產之PCV2重組次單位疫苗抗原，調整成50μg/mL後，以1：1.17(V/V)方式與W/O/W油質佐劑混製，使得每2mL中含有至少45μg重組次單位capsid蛋白質之試驗用疫苗，對照組動物則是利用昆蟲細胞培養液，以1：1.17(V/V)方式與W/O/W油質佐劑混製。免
疫方式採後肢大腿肌肉注射試驗疫苗成品1mL，免疫後連續觀察14天，評估疫苗之安全性。天竺鼠於免疫後4、6週進行心臟採血，分離其血清進行PCV2抗體力價測定。
實驗結果顯示在天竺鼠後肢肌肉注射1/2劑量(1mL)之PCV2重組次單位疫苗後，皆無任何急性或慢性之臨床症狀發生；此外，PCV2重組次單位疫苗可引起相當良好之體液性免疫反應，天竺鼠僅免疫一次於4週後即可呈現100%血清陽轉(seroconversion)，於免疫後4、6週檢測其抗PCV2之螢光抗體力價，發現所有免疫組天竺鼠的血清螢光抗體力價均大於4,096倍，並維持到免疫後第六週，但對照組血清即使僅稀釋64倍，也無法產生可辨識之細胞核內螢光訊號。上述之結果顯示，本發明所開發之PCV2重組次單位疫苗於天竺鼠具有高度安全性，並且可於免疫後產生良好的螢光抗體反應。
另外進行劑量決定試驗，評估含不同重組Cap蛋白濃度之疫苗(45、30、15μg/劑)在天竺鼠的安全與效力試驗，並以PCV2攻毒試驗評估免疫組天竺鼠的抗體揚升情形。結果列示於下表。
結果顯示，PCV2重組次單位疫苗可引起相當良好之體液性免疫反應，天竺鼠僅免疫一次1mL之含不同重組Cap蛋白濃度之疫苗，於4週後均可呈現100%血清陽轉(seroconversion)，於檢測其抗PCV2之螢光抗體力價，發現天竺鼠免疫15μg/劑量PCV2重組次單位疫苗的血清螢光抗體力價平均值為1：256，而免疫30μg/劑的天竺鼠血清螢光抗體力價平均值為1：1024，免疫45μg/劑的天竺鼠血清螢光抗體力價平均值為1：4096，但對照組血清即使僅稀釋4倍，亦無法產生可辨識之細胞核內螢光訊號。
此外，免疫後4週對所有天竺鼠進行PCV2攻毒，並觀察攻毒後一週的PCV2抗體變化；結果發現所有免疫組天竺鼠的PCV2抗體反應快速上升，顯示免疫組天竺鼠的免疫系統可辨識原始的PCV2病毒顆粒並產生對抗反應，其中又以免疫45μg/劑疫苗的天竺鼠血清螢光抗體反應(1：262,144)最為顯著；相對地，對照組天竺鼠有一隻沒有抗體反應，有兩隻對PCV2產生抗體反應(1：256；1：1024)，但顯著低於免疫組的抗體力價。因此，後續之豬隻免疫實驗皆以45μg之PCV2重組次單位蛋白為疫苗施予劑量。
自台灣動物科技研究所購買PCV2陰性SPF豬，
購買數量7頭，引進豬隻年齡為5週齡，隨即送入家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所之GMO隔離動物舍，於試驗開始前採血檢測病毒核酸載入量(viral load)與PCV2抗體力價，確認PCV2陰性且無PCV2抗體後，於豬隻6週齡時依照實驗室之規定進行本試驗。本試驗所使用之疫苗係由每劑量(2mL)含有45μg之PCV2重組次單位蛋白混合雙向油質佐劑(W/O/W)而製成，另外對照組疫苗則是空白昆蟲細胞培養液混合雙向油質佐劑(W/O/W)而製成。
免疫組豬隻於肌肉注射1劑量(2mL)後觀察14天，均無不良反應；再補強免疫1劑量後觀察14天，均無不良反應。在安全性方面，豬隻以該批重組次單位疫苗免疫後，注射部位未見紅腫等局部炎症反應等不良反應發生，且全數健存。
攻毒用之病毒係分讓自台灣大學獸醫系龐飛教授實驗室之病毒株PCV2 CYC08，經適當稀釋後，使每mL之病毒液含1×105 TCID50之PCV2病毒。攻毒方式是以點鼻與肌肉注射各1mL。免疫組動物(n=4)於6週及8週齡分別於頸部肌肉注射一劑量PCV2重組次單位疫苗，所有動物於第二次免疫後2週進行攻毒CYC08病毒株。
所有豬隻於免疫前、補強免疫前、攻毒前與攻毒後每週分別秤重與採取血清樣本，且於攻毒後每日觀察試驗豬隻之臨床症狀。血清中PCV2病毒核酸載入量(viral load)以real-time quantification PCR(qPCR)檢測，中和抗體力價則以間接螢光染色法進行測定。攻毒後四週將豬隻犧牲，所有試驗豬隻採完全解剖，採集肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結與鼠蹊淋巴結進行PCV2病毒核酸載入量檢測、免疫組織化學染色檢查與病理組織檢查。試驗結束後計算免疫組與對照組於免疫後與攻毒後之平均日增重與相對增重率。免疫組織化學染色檢查係取免疫組與對照組之肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結與鼠蹊淋巴結之石蠟切片進行PCV2免疫組織化學染色。採用盲目試
驗(blind test)進行免疫組織病理學檢查並進行PCV2抗原指數計算：在200倍視野下隨機挑選10個視野，觀察視野中各淋巴濾泡的PCV2抗原抗體反應訊號強弱，並參考Opriessnig等(2004)之抗原指數判定標準：0分代表沒有訊號，1分代表最輕微，4分代表最嚴重，計算各淋巴結之PCV2抗原指數平均值。
免疫前、攻毒前與攻毒後每週採集之血清，利用間接免疫螢光染色法測定PCV2抗體力價；試驗開始時，所有豬隻之PCV2抗體呈現陰性，疫苗組豬隻免疫PCV2 capsid次單位疫苗後抗體力價顯著上升，攻毒前PCV2抗體力價即顯著高於對照組豬隻(p<0.001)，且抗體力價持續上升到攻毒後第4週；相對地，對照組在攻毒後1週出現抗體，並持續到攻毒後4週，抗體力價在攻毒後第1、2週時仍有統計上的差異，但到第3週後則沒有差異(圖5)。
免疫前、攻毒前與攻毒後第1、4週採集之血清，經非慟化後進行PCV2中和抗體力價(VNT90)測定；結果顯示，在免疫前所有豬隻之PCV2平均中和抗體力價為1：2，疫苗組豬隻免疫PCV2重組次單位疫苗後第4週中和抗體力價顯著高於對照組豬隻(p<0.01)，且攻毒後第1週PCV2中和抗體力價明顯提升，並持續增加至攻毒後第4週；相對地，對照組豬隻之中和抗體在攻毒後並未立即產生，直到攻毒後第4週才出現中和抗體(圖6)。免疫PCV2重組次單位疫苗可誘發豬隻產生特異性PCV2抗體與PCV2中和抗體(VNT90)，並與對照組間呈顯著性差異；免疫組豬隻在攻毒後PCV2中和抗體力價明顯增加，並持續至試驗結束。
所有豬隻於免疫後4週(10週齡)攻毒，攻毒前先採血，攻毒後每週採血一次，直到攻毒後4週犧牲為止(14週齡)，並利用qPCR技術檢測血清中PCV2病毒載入量。圖7之結果顯示，於攻毒後第1週，對照組所有豬隻血清中可測得PCV2核酸，PCV2病毒載入量於攻毒後第2週達到最高，
並維持到攻毒後4週，PCV2 qPCR檢出率100%；然而，免疫組豬隻(2/4)在攻毒後第1週亦可測得PCV2核酸，攻毒後第2週達到最高，之後明顯減少，平均PCV2病毒載入量均顯著地低於對照組(p<0.05)。
組織病理學檢查結果顯示，對照組豬隻呈現嚴重間質性肺炎(3/3)、中度間質性腎炎(2/3)、各淋巴結出現嚴重淋巴細胞流失(3/3)，但免疫組豬隻僅有輕度間質性肺炎，而各淋巴結出現中度淋巴細胞流失(2/4)；在病變指數方面，除肺門淋巴結外，兩組間平均病變指數均有顯著差異。淋巴結PCV2免疫組織化學染色檢查結果顯示，對照組豬隻淋巴結呈現中度以上PCV2抗原反應，免疫組豬隻各淋巴結呈現輕度PCV2抗原反應，其PCV2抗原指數均顯著低於對照組。
本試驗之目的在於評估利用昆蟲桿狀病毒所開發之豬環狀病毒二型重組次單位疫苗在具有高PCV2移形抗體與可能PCV2感染的商業豬隻的免疫保護效力。試驗豬隻係購自台中霧峰，試驗豬隻年齡為3週齡，於該豬場哺乳舍中進行第一次免疫後繼續飼養，免疫後4週送至中興大學獸醫病理生物學研究隔離動物舍進行PCV2攻毒試驗。
本試驗所使用之疫苗係由每劑量(2mL)含有45μg之PCV2重組次單位蛋白混合雙向油質佐劑(W/O/W)而製成，另外對照組疫苗則是空白昆蟲細胞培養液混合雙向油質佐劑(W/O/W)而製成。攻毒用之病毒係分讓自台灣大學獸醫系龐飛教授實驗室之病毒株PCV2 CYC08，經適當稀釋後，使每mL之病毒液含1×105 TCID50之PCV2病毒。攻毒方式是以點鼻與肌肉注射各1mL。
免疫組動物於3週齡分別於頸部肌肉注射一劑量PCV2重組次單位疫苗，所有動物於第一次免疫後4週進行攻毒CYC08病毒株。所有豬隻於免疫前、攻毒前與攻毒後每週
分別秤重與採取血清樣本。且於攻毒後每日觀察試驗豬隻之臨床症狀。以real-time quantification PCR(qPCR)檢測血清中PCV2病毒核酸載入量(viral load)，PCV2中和抗體力價則以間接螢光染色法進行測定。攻毒後四週將豬隻犧牲，所有試驗豬隻採完全解剖，採集肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結與鼠蹊淋巴結進行PCV2病毒核酸載入量檢測、免疫組織化學染色檢查與病理組織檢查。試驗結束後計算免疫組與對照組於免疫後與攻毒後之平均日增重與相對增重率、死亡率與發育不良率(以試驗結束時全體豬隻平均體重75%為基準點，低於此體重者視為發育不良豬隻)。
結果顯示，試驗期間免疫組所有豬隻的精神與食慾良好，並無任何臨床症狀產生。但對照組中則有兩頭豬隻(No.357、358)於攻毒後生長緩慢，其中一頭豬隻(No.357)於攻毒後兩週出現蒼白與明顯消瘦等症狀，並於攻毒後第23天死亡，兩組間呈現顯著差異。
攻毒前與攻毒後第1~3週採集之血清，經非慟化後進行PCV2中和抗體力價(VNT90)測定；結果顯示，疫苗組豬隻單次免疫PCV2重組次單位疫苗後第4週平均中和抗體力價顯著高於對照組豬隻(p<0.05)；PCV2攻毒後一週，免疫組與對照組之平均中和抗體力價仍具有顯著差異(p<0.05)，到第二週後兩組的中和抗體力價均明顯增加，但無統計上差異(圖8)。
所有豬隻於免疫後4週(7週齡)攻毒，攻毒前先採血，攻毒後每週採血一次，直到攻毒後4週犧牲為止(11週齡)，並利用qPCR技術檢測血清中PCV2病毒載入量；結果顯示攻毒後第1週，對照組豬隻血清中可測得高濃度的PCV2核酸，PCV2病毒載入量於攻毒後第2週達到最高，並維持到攻毒後3週，其中發病死亡之對照組豬隻(No.357)的血清PCV2載入量更高達2.6×107 copies/mL；相對地，免疫組豬隻在攻毒後第1週亦可測得PCV2核酸，但攻毒後第2週明顯減少，攻毒後第3週平均PCV2病毒載入量顯著地低於對照組
(p<0.05)。比較兩組間的qPCR檢出率，對照組在攻毒後1、2、3週的檢出率分別為4/6、4/6、5/6，但免疫組的qPCR檢出率分別為3/5、1/5、1/5(圖9)。
試驗結束後犧牲所有實驗動物，每頭豬均採集肺門淋巴結、腸繫膜淋巴結與鼠蹊淋巴結；採集之淋巴結研磨成乳劑後抽取其DNA，取等量之DNA以qPCR技術檢測各淋巴組織中PCV2病毒載入量；結果顯示所有豬隻之淋巴結中均可測得PCV2核酸，但免疫組豬隻各淋巴結中平均PCV2病毒載入量均低於對照組豬隻至少10倍，顯示，免疫組豬隻各淋巴結中PCV2病毒載入量均顯著低於對照組，具有統計上的差異(p<0.05)；值得注意的是發病死亡之對照組豬隻(No.357)，其鼠蹊淋巴結(ILN)、肺門淋巴結(HLN)與腸繫膜淋巴結(MLN)之PCV2載入量更高達3.7×107、4.7×107、1.9×108 copies/μg DNA(圖10)。
組織病理學檢查結果顯示，對照組有三頭豬隻呈現嚴重間質性肺炎(3/6)、有兩二頭呈現中度間質性腎炎(2/6)、有二頭豬隻(No.357、358)的淋巴結出現嚴重淋巴細胞流失(2/6)；在免疫組豬隻，有二頭出現中度間質性肺炎(2/5)，有一頭豬隻(No.351)的各淋巴結出現中度淋巴細胞流失(1/5)；在病變指數方面，除腎臟病變指數有顯著差異外，其他組織的平均病變指數均無統計上差異。淋巴結PCV2免疫組織化學染色檢查結果顯示，對照組有三頭豬隻(No.354、357、358)的各淋巴結呈現重度PCV2抗原反應，免疫組豬隻各淋巴結均呈現輕度PCV2抗原反應，其PCV2抗原指數均顯著低於對照組。
攻毒後，免疫組豬隻並未出現臨床症狀且精神食慾皆正常，對照組有一頭豬隻出現蒼白消瘦之特徵性臨床症狀。在死亡率與發育不良率方面，整個試驗期間，疫苗組全數存活，死亡率為0%，對照組於攻毒PCV2後死亡1頭(No.357)，死亡率為16.7%，而死亡的豬隻(No.357)經PCV2 qPCR、
組織病理學檢查與IHC檢查確認為PCVAD。此外，以試驗結束時全體豬隻平均體重75%為基準點，低於此體重者視為發育不良豬隻，試驗結束時全體豬隻平均體重為28.4公斤，平均體重的75%為21.3公斤，統計發現免疫組豬隻體重均高於21.3公斤，發育不良率為0%，而對照組有兩頭低於21.3公斤，發育不良率為33.3%(2/6)。
由以上所例舉之豬隻免疫保護效力試驗結果證明，不論是PCV2陰性SPF豬隻或PCV2陽性之商業豬場的豬隻，經二次或單次免疫PCV2重組次單位疫苗後，不僅可誘發特異性抗體與中和抗體反應外，更可保護豬隻抵抗高劑量PCV2病毒的攻擊，並能有效降低血液中病毒載入量、淋巴組織中病毒載入量與PCV2病毒抗原量，更可避免豬隻出現發育不良與死亡，顯示本發明所製得之分泌型PCV2全長外殼蛋白類病毒顆粒的疫苗具有良好的免疫保護效果。
製備抗原豬環狀病毒重組Cap蛋白抗原液：首先製備昆蟲細胞(High-Five Production Cell)之繼代培養，將High-Five細胞解凍並擴增培養後，將細胞懸浮培養於無血清培養液HyQ SfX-insect Cell Culture Medium，濃度調整至1×106 cells/mL。將所有細胞液加至250ml shaking flask中，放置於27℃培養箱以80-90rpm進行震盪培養。連續繼代培養至製造所需量。每批次製造抗原所需細胞體積為50公升。
以新鮮的HyQ SFX-無血清培養基稀釋High-Five細胞，使細胞密度為2×106個細胞/mL。取vBAc-PCV2/Cap重組桿狀病毒液加到High-five細胞中(攻毒劑量為1~3 M.O.I.；攻毒劑量之病毒數以pfu/ml表示)。放置於27℃，180rpm下進行懸浮培養7~8天。之後取出500mL shaking flask，收集所有細胞與培養液，以高速離心方式(12,000rpm,30min,4℃)移除細胞碎片與桿狀病毒包含體，收集上清液。上清液以0.45μm filter過濾。將過濾之上清液使用橫切向蛋白濃縮裝置進行
2~5x濃縮，而得到抗原液。
抗原不活化：將上述之抗原液以每1,000mL加入5mL不活化劑(配製不活化劑：2-溴乙胺Bromoethylamine以0.2N NaOH配製成1M BEI溶液，置於37℃感作1小時)，混合均勻使不活化劑最終濃度為5mM。另加入Leupeptin(1mg/mL)混合均勻，使蛋白酶抑制劑最終濃度為1μg/m。置於25℃感作24小時。經不活化之抗原液以100對1比例加入4.93%(1M)硫代硫酸鈉，使其最終濃度為10mM。於25℃感作1小時。
疫苗乳化：先將抗原液以生理鹽水調整成每1mL中重組Cap蛋白含有量為50μg之抗原液，調整抗原濃度用生理鹽水每1,000mL須加入1mL之10%硫柳汞(Thimerosal)混合均勻。將蛋白質含有量調整後之抗原液與油質佐劑(Montanide ISA 201；W/O/W)放置於32℃ 1小時後，先將油質佐劑33,300mL(55.5 V/V%)加入乳化機中，以400rpm混合均勻，再將經蛋白質含有量調整後之抗原液26,640mL(44.4 V/V%)與10% Thimerosal 33.3mL加入為一單位，進行乳化30分鐘，至全批乳化完成為止。將疫苗送至4℃冷藏至少24小時。最終每劑量2mL中含豬環狀病毒重組Cap蛋白質45μg，油質佐劑(W/O/W)1.11mL，硫柳汞(Thimerosal)0.2mg。
寄存單位：食品工業發展研究所
寄存日期：103年7月31日
寄存號碼：BCRC940657
<110>
<120> 重組分泌型豬環狀病毒外殼蛋白類病毒顆粒(PCV2 Cap VLP)，其製備方法及於次單位疫苗之應用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子PCV/cap-F(SacI)
<400> 1
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子PCV/cap-R(SpeI)
<400> 2
<210> 3
<211> 233
<212> 蛋白質
<213> 豬環狀病毒PCV2b Taiwan YL分離株
<400> 3
Claims (10)
- 一種胞外分泌型豬環狀病毒重組Cap蛋白的類病毒顆粒(PCV2 Cap VLP)之製備方法，其包含：製備一胞外分泌型重組蛋白轉移質體，該轉移質體包含一分泌訊號肽、多重選殖切位及PCV2基因型2b cap基因片段；將該胞外分泌型的重組轉移質體轉移至桿狀病毒(Baculovirus)製備重組桿狀病毒vBac-PCV2-基因型2b/Cap選殖株，其包含胞外分泌型重組轉移質體pAcP10-SP：Cap；將該重組桿狀病毒感染昆蟲細胞於無任何動物來源之血清培養條件下大量生產經細胞分泌至培養液之胞外分泌型豬環狀病毒重組Cap蛋白；及自該昆蟲細胞培養液純化及回收已自行組裝為類病毒顆粒之重組Cap蛋白。
- 如請求項1所述之方法，其中該訊號肽為家蠶類胰島素肽(bombyxin)訊號肽。
- 如請求項1所述之方法，其中該昆蟲細胞為High-Five昆蟲細胞。
- 一種重組桿狀病毒vBac-PCV2-基因型2b/Cap株，其包含胞外分泌型重組轉移質體pAcP10-SP：Cap。
- 一種第二型豬環狀病毒(PCV2)疫苗之製備方法，其包含： 將如請求項4所述之重組桿狀病毒vBac-PCV2-基因型2b/Cap株接種於昆蟲細胞培養液，且該培養液為不含有任何動物來源之血清；將所得之昆蟲細胞培養物於27℃，180rpm下懸浮培養7~10天；將培養物離心，收取上清液；將所得之上清液過濾並濃縮製得抗原液；及將該抗原液以獸醫學上可接受之佐劑乳化而製得該疫苗。
- 如請求項5所述之方法，其中該昆蟲細胞為High-Five昆蟲細胞。
- 如請求項5所述之方法，其進一步包含於乳化前將抗原不活化之步驟。
- 如請求項5所述之方法，其中該重組桿狀病毒vBac-PCV2/Cap株之接種量為1~3 M.O.I.。
- 一種第二型豬環狀病毒(PCV2)疫苗，其包含由如請求項1所述之方法製備得之胞外分泌型豬環狀病毒重組Cap蛋白的類病毒顆粒及獸醫學上可接受之佐劑，其中該豬環狀病毒重組Cap蛋白具有SEQ ID No.4所示的胺基酸序列。
- 如請求項9所述之疫苗，其係由如請求項5所述之方法製備得，其中該豬環狀病毒重組Cap蛋白具有SEQ ID No.4所示的胺基酸序列。
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Non-Patent Citations (2)
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| Wu, Pei-Ching, et al. "Characterization of porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid particle assembly and its application to virus-like particle vaccine * |
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