JP2020524182A - 豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物並びにその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1.病理材料の由来
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が9.4%増加し、受胎率が1.2%低下し、ミイラ変性胎子が8.2%増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、PCV2関連流産の症状と一致している。母豚から観察された臨床表現及び流産症状全体として、豚サーコウイルス2型による繁殖障害疾患と一致するが、全ての母豚の腎臓、リンパ節、肺、皮膚及び死胎を含む異なる組織を免疫組織化及び定量PCRによりPCV2、PRRSV、PPV、CSFV、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ検査を行った結果、いずれも陰性であった。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
病理材料を1:10(体積比)でDMEM培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して3回にかけて凍結融解させた後、12000r/min下で15min遠心し、上清液を収集し、上清液を0.22μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をPK15細胞上で継代させて、37℃で1h培養し、2%仔ウシ血清を含有するDMEM培養液を入れ替えるように加え、37℃に置いて5日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を2回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
上記のステップにおけるウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、サーコウイルス種の特異的プライマーを使ってPCR増幅同定を行い、その結果、2000bpターゲットバンドをPCR増幅されたことが示された。PCR生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列及びアミノ酸配列は、既に報道された他のサーコウイルスとのホモロジーがいずれも50%より小さいことが示された。然しながら、国際ウイルス学分類委員会の標準によると、サーコウイルス属における同一種類のウイルスは75%より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有し、Capタンパク質は70%より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。これにより、当該ウイルスは新たな豚サーコウイルスであることが確定でき、目前豚の体で発見された第3の種類のサーコウイルスでもある。
1.PCV3ウイルスDNAの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、T4 DNA LigaseはBioLab社から入手可能であり、pET28aプラスミドはNovagen社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
最適化されたCap遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技股ふん有限公司に送って完全配列合成を行い、pET28aプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドpG−Tf2とを大腸菌BL21(DE3)に共形質転換させ、モノクローンを選んで100μg/mlのカナマイシン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、合成配列が正確であると確定され、陽性クローンはpET28a−PCV3−Cap/pG−Tf2発現菌株pET28a−PCV3-Cap/pG−Tf2/E.Coli BL21(DE3)である。
実施例2で調製されたpET28a−PCV3-Cap/pG−Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株を50〜100μg/mlのカナマイシン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地に接種する。一方、LB培地に分子シャペロンタンパク質の誘導発現に用いられる5〜10ng/mlのテトラサイクリンを含有し、接種量は1%(V/V)あり、37℃で振盪培養する。OD600=0.4〜0.6である場合、28℃で30分間放置する。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、その最終濃度が0.1〜1.0mMになるようにし、28℃で24時間振盪培養させる。培養が完了した後、菌体を収集し、PBS(PBS組成成分:塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2g、りん酸水素二ナトリウム1.44g、リン酸二水素カリウム0.24gであり、pHが7.4になるように調整し、1Lに定容する)で菌体を再懸濁し、超音波破砕を行い、超音波で破砕した後に溶菌液を遠心して上清を取る。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の25%に達し得、エンドトキシンの含有量は0.28×105EU/mlである。
1.5ml遠沈管に0.5mlの可溶性Capタンパク質を含有する処理すべき上清液及び最終濃度が1%(V/V)であるトリトンX−114(Triton X−114)(添加量は5μlである)を加え、渦流振盪を行う。渦流振盪により均一に混ぜ合わせられたサンプルを氷上で5分間放置する。サンプルが冷却された後、遠沈管を直ちに37℃水浴に入れて5min温浴させて、新たな二相を形成させる。そして、サンプルを37℃の温度条件下で60s遠心させる。遠心の後、標的タンパク質は上層に残る一方、エンドトキシンを含有する非イオン界面活性剤は油滴の形状で遠沈管の底部に残留し、これにより二相が分離される。上記のエンドトキシンを除去する全体の操作は3回循環される。最終的な純化生成物を測定した結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は0.008×105EU/mlに低下する。一方、200KV透過型電子顕微鏡により60000倍まで拡大させて、5%リンタングステン酸ネガティブ染色を経て炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたPCV3ウイルス様粒子を観察した結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を呈した。
1.病理材料の由来
中国国内の一免疫商品化PCV2ワクチンの養豚場で、母豚が流産し、ミイラ変性胎子が増加する現象が散発的に起こった。影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、PCV2関連流産の症状と一致している。免疫組織化及び定量PCR検査を行った結果、PCV2陽性であった。PCV2商品化ワクチンで免疫した後でも依然として発病豚組織からPCV2が検出されたため、その原因は深く究明するに値する。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
病理材料を1:10(体積比)でDMEM培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して3回にかけて凍結融解させた後、12000r/min下で15min遠心し、上清液を収集し、上清液を0.22μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をPK15細胞上で継代させて、37℃で1h培養し、2%仔ウシ血清を含有するDMEM培養液を入れ替えるように加え、37℃に置いて5日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を2回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
上記のステップで収穫されたウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、PCV2の特異的プライマーを使ってPCR増幅同定を行い、その結果、1.7kbターゲットバンドをPCR増幅されたことが示された。PCR生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列は、既に報道された他のPCV2とのホモロジーがいずれも96%より小さく、アミノ酸配列は94%より小さいということが示された。全ゲノム配列解析により、当該ウイルス株はPCV2bとPCV2dの間に介在し、ORF2遺伝子の中に突然変異が存在するか、又は異なる遺伝子サブタイプのORF2遺伝子の間での組み換えを経て生じたものであることをさらに示している。遺伝進化解析を行った結果、当該ウイルスは新たなPCV2遺伝子サブタイプに属すると確定された。
1.PCV2ウイルスDNAの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、T4 DNA LigaseはBioLab社から入手可能であり、pET28aプラスミドはNovagen社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
最適化されたCap遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技股ふん有限公司に送って完全配列合成を行い、pET28aプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドpG−Tf2とを大腸菌BL21(DE3)に共形質転換させ、モノクローンを選んで100μg/mlのカナマイシン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有するLB培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、合成配列が正確であると確定され、陽性クローンはpET28a−PCV2-Cap/pG−Tf2発現菌株pET28a−PCV2-Cap/pG−Tf2/E.Coli BL21(DE3)である。
実施例6で調製されたpET28a−PCV2-Cap/pG−Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株に対して、実施例3を参照しながらタンパク質誘導発現を行う。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の50%に達し得、エンドトキシンの含有量は0.26×105EU/mlである。
実施例7で発現された可溶性Capタンパク質を含有する上清液に対して、実施例4を参照しながらエンドトキシン除去を行う。測定を行った結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は0.008×105EU/mlに低下した。一方、200KV透過型電子顕微鏡により60000倍まで拡大させて、5%リンタングステン酸ネガティブ染色を経て炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたPCV2ウイルス様粒子を観察した結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を呈した。
実施例4に従って純化された豚サーコウイルス3型Capタンパク質及び実施例8に従って純化された豚サーコウイルス2型Capタンパク質を比率によって混合した後、水溶性アジュバントGelアジュバント(フランスSEPPIC社)の中にゆっくり加え、加える過程で絶え間なく回転数が800rpmである乳化機で12min撹拌して均一に混ぜ合わせる。免疫原性組成物の具体的な配合比率は表3を参照する。
28〜30日齢の、ELISA測定を行った結果、PCV2抗原、PCV3抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚60匹を5匹/群になるようにランダムに12の群に分け、実施例9で調製された豚サーコウイルス3型及び2型である免疫原性組成物で免疫する。第1〜2の群は組成物1で免疫し、第3〜4の群は組成物2で免疫し、第5〜6の群は組成物3で免疫し、第7〜8の群はそれぞれ組成物4で免疫し、第9〜10の群はそれぞれ原性組成物5及び組成物6で免疫し、第11〜12の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を2ml/匹を注射し、比較群はDMEM培地を2ml/匹を接種する。免疫後28日目にウイルスチャレンジを行い、第1の群、第3の群、第5の群、第7の群、第9の群、第11の群を豚サーコウイルス3型SG株(Porcine Circovirus type3、Strain SG、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はCCTCC NO.V201712であり、寄託日付は2017年3月23日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である)でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量はいずれも105.0TCID50/匹である。第2の群、第4の群、第6の群、第8の群、第10の群、第12の群を豚サーコウイルス2型HH3株(Porcine Circovirus type2、Strain HH3、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はCCTCC NO.V201726であり、寄託日付は2017年6月4日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である)でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量はいずれも105.0TCID50/匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表4を参照する。
28〜30日齢の、ELISA検査を行った結果、PCV2抗原、PCV3抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚100匹を5匹/群になるようにランダムに20の群に分け、第13〜22の群は実施例9で調製された免疫原性組成物1で免疫し、第23〜32の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を2ml/匹を注射し、ウイルスチャレンジ比較群はDMEM培地を2ml/匹を接種する。免疫後28日目にウイルスチャレンジを行い、第13の群及び第23の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス2a遺伝子サブタイプHN06株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第14の群及び第24の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス2b遺伝子サブタイプJS04株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第15の群及び第25の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス2d遺伝子サブタイプJL13株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第16の群及び第26の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス2新(new)遺伝子サブタイプCQ14株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第17の群及び第27の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス2新(new)遺伝子サブタイプGD15株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第18の群及び第28の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス3型HN12株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第19の群及び第29の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス3型JS08株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第20の群及び第30の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス3型JL11株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第21の群及び第31の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス3型CQ04株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第22の群及び第32の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス3型GD05株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は105.0TCID50/匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表5乃至表6を参照する。
28〜30日齢の、ELISA検査を行った結果、PCV2抗原、PCV3抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚20匹を5匹/群になるようにランダムに四つの群に分ける。第33の群は実施例9で調製された免疫原性組成物1で免疫し、第34の群は実施例9で調製された免疫原性組成物5で免疫し、第35の群は実施例9で調製された免疫原性組成物6で免疫し、第36の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を2ml/匹を注射し、比較群はDMEM培地を2ml/匹を接種する。免疫後28日目にウイルスチャレンジを行い、全ての群を豚サーコウイルス3型SG株と豚サーコウイルス2型HH3株との混合ウイルス液でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は105.0TCID50/匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化結果に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表7を参照する。
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が9.8%増加し、受胎率が1.2%低下し、ミイラ変性胎子が8.6%増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有している。臨床表現症状のある母豚から32匹の妊娠した母豚を選んで、16匹/群になるようにランダムにA群及びB群の二つの群に分ける。A群は、免疫原性組成物接種群であり、A群は実施例9で調製された免疫原性組成物1で免疫し、B群はブランクとして比較群である。免疫群に免疫原性組成物2ml/匹を注射し、ブランクである比較群にDMEM培地を2ml/匹を接種する。2つの群の母豚の仔豚生産状況を統計し、その結果は表8を参照する。
Claims (13)
- 豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス3型Capタンパク質抗原と、免疫量の豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含み、
前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質抗原は、豚サーコウイルス3型Capタンパク質又は前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体であり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質抗原は、豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質又は前記豚サーコウイルス2型Capタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体である豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。 - 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質はSEQ ID No.1によりコードされるタンパク質であり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質はSEQ ID No.2によりコードされるタンパク質である請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質の含有量は20μg/ml以上であり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質の含有量は20μg/ml以上である請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質の含有量は20μg/ml〜100μg/mlであり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質の含有量は20μg/ml〜100μg/mlである請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質の含有量は20μg/ml〜50μg/mlであり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質の含有量は20μg/ml〜50μg/mlである請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質の含有量は30μg/ml〜50μg/mlであり、前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質の含有量は30μg/ml〜50μg/mlである請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記豚サーコウイルス3型Capタンパク質遺伝子と前記豚サーコウイルス2型新(new)遺伝子サブタイプCapタンパク質遺伝子とは同一生担体に組み換えられ、前記生担体は組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、MontanideTMGel、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ISA206アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み、
前記アジュバントの含有量は5〜20V/V%である請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。 - 前記アジュバントの含有量は10V/V%である請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントはMontanideTMGelであり、前記アジュバントの含有量は5〜20V/V%である請求項1に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 前記アジュバントの含有量は10V/V%である請求項10に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物。
- 請求項1乃至11のいずれか一項に記載の豚サーコウイルス3型及び豚サーコウイルス2型である抗原を含有する免疫原性組成物の豚サーコウイルス関連疾患を予防及び/又は治療する医薬の調製における用途。
- 前記豚サーコウイルス関連疾患は、離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群と、豚皮膚炎腎症症候群と、増殖性壊死性肺炎と、繁殖障害と、心臓及び多臓器系炎症性反応とを含む請求項12に記載の用途。
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