CN115819567B - 一种单克隆抗体及其在检测试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明一方面公开了一种猪圆环病毒3型单克隆抗体，所述的编码单克隆抗体的的重链可变区序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种用于检测猪圆环病毒3型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体和有效量的猪圆环病毒3型Cap蛋白；以及对猪圆环病毒3型抗体反应进行检测的检测试剂。本发明制备的抗猪圆环病毒3型Cap蛋白的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的猪圆环病毒3型诊断试剂。

Description

一种单克隆抗体及其在检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种单克隆抗体及其在检测试剂盒中的应用。

背景技术

猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)在临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，呼吸系统和肠道疾病，繁殖障碍，猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒相关疾病主要致病源。

2016年在美国发生急性死亡并伴有类似猪皮炎和肾病综合征临床症状且表现繁殖障碍的母猪体内分离出一种新型圆环病毒—猪圆环病毒3型(PCV3)

PCV3是一种新发传染病，区别于PCV2，其基因组结构和蛋白序列存在着显著差异。PCV3与PCV2只是基因组呈圆环状，所以依据这种特征都被命名为圆环病毒。但二者的基因组差异巨大，基因组同源率约为40％。PCV3基因组长2000bp，其主要免疫原性基因Cap基因长645bp；PCV2基因组长1767/1768bp，其主要免疫原性基因Cap基因长701bp，二者Cap基因同源率39％-41％，属于不同蛋白，因此猪免疫了圆环2型疫苗不能阻止圆环3型病毒的感染和繁殖。

基于以上原因，目前PCV2疫苗以及PCV2的检测方法都不能直接适用于PCV3，因此，急需开发针对PCV3 ORF2基因的特异性研究适合它的检测方法和疫苗。临床上常使用血清学监测的方法了解抗体或者病原在动物体内的分布情况。间接免疫荧光实验和免疫过氧化物酶单层细胞试验操作复杂，成本昂贵，对设备、人员和病毒要求高，不适用于临床大规模检测。ELISA方法不仅可以简便地对猪群感染情况进行监测，还可以用于评价疫苗的免疫效果。所以急需开发一种PCV3 ELISA抗体检测试剂盒。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种猪圆环病毒3型Cap蛋白的单克隆抗体；本发明的目的之二，提供一种使用本发明制备的Cap蛋白和单克隆抗体制备猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒。

因此，本发明一方面公开了一种猪圆环病毒3型单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合猪圆环病毒3型Cap蛋白，所述的编码单克隆抗体的的重链可变区序列如SEQ IDNO.1所示，所述的编码单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，本发明所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：

CDR-H1：NYYIT；

CDR-H2：WIYCGRDGSTKYRDKFKG；

CDR-H3：ANDYYMFPY；

所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：

CDR-L1：RSSQSIVHSTGNTPYLG；

CDR-L2：KVSNRFS；

CDR-L3：FQGQHVPPT。

优选地，本发明所述的单克隆抗体的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：

FR-H1：VQTLQQSGPDLVGPHASVRISCKASGYQFT；

FR-H2：WVAQRPGEQGLEWIG；

FR-H3：PTTLTADKSSTKFISLIGLTSEDSAIMFCSL；

FR-H4：WGQDTLITVSA；

所述的单克隆抗体的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：

FR-L1：VPKICQSPLHLPVHGGDQASISC；

FR-L2：WYLQKGGYSPKLLIF；

FR-L3：GVKDRNSGSGSGTDNTLKISDAARVEAEDLGLYYC；

FR-L4：FGAGTKLELK。

再一方面，本发明还公开了一种用于检测猪圆环病毒3型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体和有效量的猪圆环病毒3型Cap蛋白；以及用于猪圆环病毒3型抗体检测的配套试剂。

优选地，本发明所述试剂盒为阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述阻断ELISA抗体检测试剂盒包括包被有制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白的包被板、HRP标记的单克隆抗体、样品稀释液、25×浓缩洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液。

优选地，本发明所述试剂盒中猪圆环病毒3型Cap蛋白包被浓度为2μg/ml，；所述的HRP标记单克隆抗体的使用稀释比例为1:20000倍。

本发明制备的抗猪圆环病毒3型Cap蛋白的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性，适用于制备不同的猪圆环病毒3型诊断试剂，如胶体金、ELISA等检测试剂盒。

本发明所提供的猪圆环病毒3型阻断ELISA抗体检测试剂盒适用于猪血清中猪圆环病毒3型抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于猪圆环病毒3型抗体的早期筛查、免疫评价(有疫苗时适用)以及流行病学调查等。

附图说明

图1单克隆抗体特异性检测(werstern blot)。其中M是marker，1是PCV3Cap蛋白，2是CSFV，3是PRRSV，4是PRV，5是PCV2。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

1猪圆环病毒3型Cap蛋白的制备

参见中国发明专利CN 114014916 A中实施例1中的方法制备PCV2 Cap蛋白，共制备3批蛋白，每批蛋白约10mg，其浓度分别为1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.4mg/ml，定量(0.2ml/管)分装后置于-70℃以下保存。

2小鼠免疫和筛选

将制备好的猪圆环病毒3型Cap蛋白，与等质量福氏完全佐剂充分乳化后背腹部皮下多点注射6～8周龄BALB/c雌性小鼠，0.2ml/只；间隔2周，取与一免等量抗原和等质量的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml/只，过2周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射免疫。具体免疫程序见表1。

表1制备单克隆抗体制备免疫方案

免疫次数	间隔天数	佐剂类型	免疫部位及方式
				第一次	0	弗氏完全佐剂	背腹部皮下多点注射
第二次	14	弗氏不完全佐剂	腹腔注射
				第三次	14	/	腹腔注射

第三次免疫后3天尾静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对抗原的抗体生成。比较5只小鼠效价，最后选择抗体效价较高的小鼠(04号)用于细胞融合。具体结果见表2所示。

表2小鼠免疫后ELISA效价检测结果

3单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

3.1骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞)的复苏从液氮中取出冻存细胞,立即放入37℃水浴中融化，离心，弃上清,用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中,置于37℃二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养,在倒置显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞备做融合用。

3.2小鼠脾细胞的制备取效价最高的小鼠(04号)，眼球摘除采血,分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内,固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开左侧皮肤和腹膜，无菌取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛约有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔,然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到平皿中的基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次

3.3细胞融合使用PEG法将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用HAT培养基重悬，均匀铺于96孔板内，每孔100μl，37℃，5％CO₂培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10～30％时。取培养上清，用间接ELISA方法(PCV3 Cap蛋白包被，2μg/ml)进行阳性克隆的检测。共获32个阳性孔，分别选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法细胞克隆，获得一株杂交瘤细胞。经传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

4单克隆抗体的大量制备与纯化

取8周龄左右BALB/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.3～0.5ml/只，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞1×10⁶个。注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，4℃8000rpm离心3min，收集上清液，即为单抗腹水。取1倍体积腹水，加入2倍体积醋酸盐缓冲液(0.06mol/L，pH值4.8)，混合均匀后在室温下边搅拌边加入辛酸(30μl/ml腹水)，4℃澄清2h小时，以4℃12000rpm离心20min，收集上清。再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃静置2小时，4℃3000rpm离心30min，收集沉淀。用2倍体积PBS溶解沉淀后用PBS透析过夜，即获得纯化的腹水抗体，置于-70℃保存备用。使用BCA试剂盒对单克隆抗体进行浓度检测，单克隆抗体的检测结果为1.41mg/ml。

5单克隆抗体的性能鉴定

5.1抗体特异性检测：分别取单克隆抗体对猪瘟病毒CSFV(市购弱毒苗提取蛋白质)、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV(市购弱毒苗提取蛋白质)、猪伪狂犬病病毒PRV(市购弱毒苗提取蛋白质)和猪圆环病毒2型PCV2(市购亚单位疫苗)进行werstern blot检测(图1)，以判断其特异性，结果显示，单克隆抗体检测4种抗原均为阴性，检测PCV3 Cap蛋白为阳性，说明单克隆抗体的特异性良好。

5.2类及亚类测定：用ELISA试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，鉴定结果显示(表3)两株单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。

表3单克隆抗体类型及亚类鉴定结果

抗体亚类	重复1(OD450nm)	重复2(OD450nm)
			IgG1	0.705	0.719
IgG2a	0.052	0.055
			IgG2b	0.051	0.048
IgG3	0.052	0.054
			IgA	0.052	0.049
IgM	0.051	0.056
			Kappa	0.956	0.915
Lambda	0.056	0.051

5.3HRP标记性能测定：使用经典的高碘酸钠法或者市购的HRP标记试剂盒对单克隆抗体进行HRP标记，并使用直接ELISA方法(包被原PCV3 Cap蛋白的包被量为2μg/ml)测定标记效价(OD值≥1.0时判阳性)，结果为1:20000。说明HRP标记成功，标记效率较高，符合试剂盒开发需要。

5.4单克隆抗体可变区序列的测定参见中国发明专利(CN 111393525 B)实施例5的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定(序列测定委托华大基因进行测定)，编码重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。所述的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如表4所示。

表4单克隆抗体氨基酸序列信息

实施例2：猪圆环病毒3型抗体检测

使用实施例1制备的PCV3 Cap蛋白和单克隆抗体建立猪圆环病毒3型阻断ELISA抗体检测方法，以用于猪圆环病毒3型的血清抗体检测。

1试剂盒的制备

1.1酶标板的制备：将Cap蛋白用包被缓冲液(0.05M pH9.6碳酸钠溶液)稀释到2μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃过夜(12～14小时)；取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；加入封闭液(含2％BSA的PBST溶液)，200μl/孔，37℃孵育2小时。

1.2阳性对照：使用制备的Cap蛋白与ISA 201佐剂乳化制备疫苗(100μg/ml)免疫健康易感的21日龄仔猪(PCV3、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PRRSV抗体抗原均为阴性)，在一免14日和28日分别进行二免和三免，2ml/头/次，三免后7日采血，用间接ELISA方法进行检测，选择效价高于1:10000的猪用于血清制备。对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，3000r/min离心10分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，即为阳性对照。

1.3阴性对照：筛选健康易感的21日龄仔猪(PCV3、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PRRSV抗体抗原阴性)，进行颈动脉放血，3000r/min离心10分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，即为阴性对照。

1.4样品稀释液的制备：在1×PBST中加入终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)和终浓度为2％ BSA(m/V)，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

1.5 25×浓缩洗涤液的制备：为25×PBST溶液中加入终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

1.6酶标抗体的制备：使用样品稀释液2万倍稀释HRP标记的单克隆抗体，即为酶标抗体。

1.7底物溶液的制备：为北京索莱宝生物科技有限公司的单组份TMB显色液或其他通用显色液，定量分装。

1.8终止液的制备：为配制的2M H₂SO₄，定量分装。

1.9试剂盒的组装：按下表组装试剂盒。

2试剂盒的检测

2.1加样：在每孔中加入50μl样本稀释液，再在对应孔中加入50μl阳性对照、阴性对照和待检血清，振荡混匀。置37℃孵育30分钟。

2.2洗涤：孵育结束后，甩去孔内液体，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3～5次，拍干。

2.3酶标抗体孵育：加入酶标抗体，100μl/孔，置37℃孵育30分钟。

2.4洗涤：孵育结束后，甩去孔内液体，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3～5次，拍干。

2.5显色：加入底物溶液，100μl/孔，置37℃避光孵育10分钟。

2.6终止：加入终止液，50μl/孔，轻微震荡混合均匀。

2.7读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，读取OD_450nm值。

2.8S/N值计算按照以下计算公式，计算S/N值。

2.9判定

2.9.1试验成立条件：阴性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.8且各孔间最大差值应<0.3，阳性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3。

2.9.2当S/N值大于0.5时判为阴性；当S/N值小于等于0.5时判为阳性。

3试剂盒性能验证：按照上述方法连续生产了3批试剂盒，批号分别为220901、220902、220903，使用这三批试剂盒进行性能验证。

3.1敏感性验证：三批试剂盒对制备的阳性血清进行梯度检测，最低检测梯度能达到3200倍，说明该试剂盒的敏感性很好。具体数据见表5。

表5敏感性检测结果(S/N值)

3.2特异性验证：三批试剂盒对7份猪源特异性质控血清进行检测，结果均为阴性，说明本试剂盒的特异性很好。具体数据见表6。

表6特异性检测结果

3.3重复性验证：三批试剂盒对阳性血清和阴性血清的批间和批内的变异系数均小于10％，说明本试剂盒的重复性很好。具体见表7和表8。

表7重复性检测结果(批内)

表8重复性检测结果(批间)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种猪圆环病毒3型单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能特异性结合猪圆环病毒3型Cap蛋白，所述的单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为序列如SEQ ID NO.1所示的核酸编码，所述轻链可变区为序列如SEQ ID NO.2所示的核酸编码。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：

CDR-H1：NYYIT；

CDR-H2：WIYCGRDGSTKYRDKFKG；

CDR-H3：ANDYYMFPY；

所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：

CDR-L1：RSSQSIVHSTGNTPYLG；

CDR-L2：KVSNRFS；

CDR-L3：FQGQHVPPT。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：

FR-H1：VQTLQQSGPDLVGPHASVRISCKASGYQFT；

FR-H2：WVAQRPGEQGLEWIG；

FR-H3：PTTLTADKSSTKFISLIGLTSEDSAIMFCSL；

FR-H4：WGQDTLITVSA；

所述的单克隆抗体的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：

FR-L1：VPKICQSPLHLPVHGGDQASISC；

FR-L2：WYLQKGGYSPKLLIF；

FR-L3：GVKDRNSGSGSGTDNTLKISDAARVEAEDLGLYYC；

FR-L4：FGAGTKLELK。

4.一种用于检测猪圆环病毒3型抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求1所述的单克隆抗体和有效量的猪圆环病毒3型Cap蛋白；以及用于猪圆环病毒3型抗体检测的配套试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述阻断ELISA抗体检测试剂盒包括包被有猪圆环病毒3型Cap蛋白的包被板、HRP标记权利要求1所述的单克隆抗体、样品稀释液、25×浓缩洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中猪圆环病毒3型Cap蛋白包被浓度为2μg/mL。