CN113150079B

CN113150079B - 一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用

Info

Publication number: CN113150079B
Application number: CN202110084465.XA
Authority: CN
Inventors: 冯春燕; 王彩霞; 林祥梅; 吴绍强; 刘晓飞; 仇松寅
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-01-21
Also published as: CN113150079A

Abstract

本发明公开了一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用。本发明还公开了包括所述p72蛋白的检测试剂盒。本发明的试剂盒可特异性的检测ASFV，灵敏度高，特异性好，为ASFV感染的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。

Description

一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASFV)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的猪的急性、烈性、高度接触传染性疾病，期临床症状眼观病变与猪瘟(classical swine fever，CSF)高度近似，又起源于非洲，故称之为非洲猪瘟。

近几年来随着单克隆抗体技术的发展，针对非洲猪瘟单克隆抗体的研究在ASFV研究与ASFV诊断中发挥的作用也愈来愈凸显，主要表现在两个方面，一是将单克隆抗体用于免疫学相关ASFV检测方法的建立，例如用于建立检测ASFV抗原的直接免疫荧光试验(DIF)、免疫酶组化试验、夹心法酶联免疫吸附试验等；二是用于病毒和抗原结构的研究及ASFV抗原特性的研究。尽管目前还没有ASFV疫苗，ASFV抗体阳性即表明当前或曾经发生了感染，但并不代表未来没有ASFV疫苗，因此ASFV抗原的检测就显得尤为重要，只有精准确定感染情况，才能及时采取疫病防控措施。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其在检测或制备抗体或活性片段中的用途。

第一方面，本发明提供一种重组p72蛋白，编码所述重组p72蛋白的核苷酸序列包括：

(1)：SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列；或

(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或

(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码所述p72蛋白的所述核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统包含所述表达载体。

优选地，所述表达系统为感受态细胞。

更优选地，所述感受态细胞为大肠杆菌。

第四方面，本发明提供所述重组p72蛋白、所述表达载体、或者所述表达系统在检测或制备抗体或活性片段中的用途。

第五方面，本发明提供所述重组p72蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒的诊断试剂或试剂盒中的用途。

第六方面，本发明提供非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述重组p72蛋白。

本发明还提供所述重组p72蛋白在非洲猪瘟病毒检测试剂盒的质量控制中的应用。

第七方面，本发明提供所述重组p72蛋白在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。

第八方面，本发明提供一种特异性结合所述p72蛋白的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白具有SEQ ID NO:19所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:20所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:22所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:23所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区CDR3。

优选地，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

其中，

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNASIKDTYMHWVKQRPEQGLAWIGMIDPANCTGNSKFDPKFQGKATIAADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCGGLSDTYYGKYEGDYYGLDCWGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：

DIVMSQSPYSPAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYESYSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAVPSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVRAEDLAIYYCHQYYTSVYPWTFGGGTKLEIK。

第九方面，本发明提供一种特异性结合所述p72蛋白的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白具有SEQ ID NO:25所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:26所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:27所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:28所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:29所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区CDR3。

优选地，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQID NO:4所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

其中，

SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVRISCKASGYISMFTTAGMEWVQKKPGKGLKWIGWINTHSLQGVTKNGEDFKGRFAFSLETSASTTYLQISNLKNEDTATYFCARWGNYHNADGMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列如下：

DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINDTVWLSWYQQKPGNIPKLLIYRTSQLNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGTPQSYPLTFGGGTKLEIK。

第十方面，本发明提供一种特异性结合所述p72蛋白的抗体或活性片段，所述抗体或活性片段具有SEQ ID NO:19所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:20所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:21所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:22所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:23所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:24所示的轻链互补决定区CDR3。

优选地，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

更优选地，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种；进一步优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体ASFV-p72-5G8。

在一个优选的实施方案中，所述抗体ASFV-p72-5G8通过下述方法制得：用重组真核表达的p72蛋白免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0细胞融合，筛选获得分泌特异性的抗体的单克隆杂交瘤细胞5G8，将所述杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，通过对腹水进行盐纯，即可获得含有抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体ASFV-p72-5G8。

第十一方面，本发明提供一种特异性结合所述p72蛋白的抗体或活性片段，所述抗体或活性片段具有SEQ ID NO:25所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:26所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:27所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:28所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:29所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:30所示的轻链互补决定区CDR3。

优选地，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

更优选地，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种；进一步优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体ASFV-p72-12F6。

在一个优选的实施方案中，所述的抗体ASFV-p72-12F6通过下述方法制得：用重组真核表达的p72蛋白免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0细胞融合，筛选获得分泌特异性的抗体的单克隆杂交瘤细胞12F6，将所述杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，通过对腹水进行盐纯，即可获得含有抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体ASFV-p72-12F6。

第十二方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒p72基因双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段。

优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体ASFV-p72-5G8和ASFV-p72-12F6。

在一个优选的实施方案中，本发明的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒包括：包被有单克隆抗体ASFV-p72-5G8的酶标板、阳性对照和阴性对照、HRP标记的检测抗体ASFV-p72-12F6、样品稀释液、显色液以及洗涤液。

第十三方面，本发明提供所述特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，或所述双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒在样品中检测非洲猪瘟病毒的应用。

优选地，所述样品为血清样品或血液样品。

第十四方面，本发明提供利用特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，或所述双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒体外检测样品中非洲猪瘟病毒的方法。

优选地，所述样品为血清样品或血液样品。

本发明的有益效果：

(1)本发明使用两个辅助蛋白B602L和B438L协同帮助p72蛋白在真核细胞中的表达，使其在表达的过程中更易形成天然病毒抗原所具备的空间结构，保证了本发明制备单克隆抗体的抗原更接近于真实病毒抗原，本发明所制备的抗原纯度高，具有很好的免疫原性和抗原性。

(2)本发明提供的针对ASFV p72蛋白的单克隆抗体效价高，性质稳定，可利用小鼠腹水制备抗体，适于大量生产。

(3)本发明利用高纯度、真核表达的ASFV p72蛋白作为免疫原和检测原，制备ASFVp72蛋白的单克隆抗体，并从获得的单克隆抗体中优选出其中两株(5G8和12F6)建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法，可快速准确地检测ASFV抗原。

(4)本发明在制备ASFV p72蛋白特异性单克隆抗体的过程中得到8株单克隆抗体，通过抗原位点分析和配对试验最后筛选到2对效果较好的单克隆抗体5G8和12F6，亚类鉴定确定为IgG1亚型，轻链均为Kappa亚型。本发明优选出的杂交瘤细胞ASFV-p72-5G8和ASFV-p72-12F6分泌的单克隆抗体5G8和12F6均能与ASFV感染细胞发生特异性反应，两株细胞生物学特性稳定，分泌的单克隆抗体针对ASFV p72蛋白不同表位，在ASFV感染诊断方面具有重要的应用价值。本发明以杂交瘤细胞株ASFV-p72-5G8分泌的单克隆抗体5G8为捕获抗体、以杂交瘤细胞株ASFV-p72-12F6分泌的单克隆抗体12F6(HRP偶联)为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可特异性的检测ASFV p72蛋白，且方法具有较高的线性系数和较广的检测范围，灵敏度高，特异性好，表明本发明双抗体夹心ELISA方法具有实际应用价值，并进一步制备成试剂盒，为ASFV感染的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。

根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下面表A：

表A

此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表B：

表B

附图说明

图1是p72重组蛋白的洗脱峰图及SDS-PAGE检测鉴定图。

图2是p72重组蛋白的Western-blot分析结果。

1：蛋白Marker；2：纯化后的重组p72蛋白。

图3是重组p72蛋白的特异型性鉴定。

1：蛋白Marker；2：标准阳性血清；3：猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN4-F122株)阳性血清；4：猪细小病毒(WH-1)阳性血清；5：猪瘟病毒(C株)阳性血清；6：猪圆环病毒2型(LG株)阳性血清；7：猪伪狂犬病毒(Kartha-K61株)阳性血清；8：猪阴性血清。

图4是重组p72蛋白的免疫原性分析。

图5是8株单克隆抗体与杆状病毒表达p72的间接免疫荧光鉴定结果。

图6是纯化后单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果示意图(5G8)。

图7是杂交瘤细胞染色体检测结果。

图8是单克隆抗体抗体亚类测定结果。

图9是p72蛋白定量检测的标准曲线与回归分析。

具体实施方式

为了快速准确地诊断ASFV感染，本发明研制出了能够与ASFV p72蛋白具有良好反应性的单克隆抗体，进而制备了检测p72蛋白的双抗体夹心ELISA检测试剂盒。下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是本发明保护范围的限定。

实施例1非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备与鉴定

1.材料

1.1菌种

大肠杆菌感受态DH5α、DH10Bac购自北京全式金生物技术有限公司，pCMV载体、pFastbac1载体、293F细胞由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫实验室保存。

1.2血清

经0.3％TNBP和1％triton X-100灭活的非洲猪瘟标准阳性血清由波兰国家兽医研究所保存。猪伪狂犬病活疫苗(Kartha-K61株)(Pseudorabies virus，PRV)，购自青岛易邦生物工程有限公司；猪细小病毒病灭活疫苗(WH-1)(porcine parvovirus，PPV)，购自武汉科前生物股份有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)(porcine circovirus，PCV2)购自哈尔滨维科生物技术开发公司，猪瘟活疫苗(C株)(Classical Swine Fever，CSF)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F122株)(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)购自哈药集团生物疫苗有限公司。猪阴性对照血清购自Hyclone公司。

1.3试剂

SMM 293-TI培养基购自北京义翘神州生物技术有限公司，Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI1640培养基及胎牛血清购自Gibico公司；EcoR I/Xho I限制性内切酶、T4连接酶、TaKaRa LA PCR^TM Kit购自TaKaRa公司，DNA提取试剂盒DNeasy Blood and Tissue Kit购自Qiagen公司，胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit、质粒提取试剂盒PlasmidMini Kit购自Omega公司，IPTG、X-gal、氨苄霉素购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4仪器

ABI公司的普通PCR仪(AB Applied Biosystems)，sigma公司的台式离心机(3-18k)，恒温振荡培养箱(HZQ-F100)，荧光显微镜(ZEISS，AXIO)，六一电泳仪，双红外激光扫描成像系统(Proteinsimple)。

2.重组p72蛋白的表达

2.1p72重组质粒的构建

根据GenBank中公布的非洲猪瘟黑龙江株(MK333180.1)的p72基因全长序列(1941bp)，利用生物信息学技术ExPASy、SOMPA、PSIPRED Server、DNASTAR、Phyre、ABCpredPrediction、Scratch、NetCTLE及IEDB等对p72蛋白进行理化性质、二级结构、三级结构分析以及T、B淋巴细胞表位的预测，最后选择N端优势抗原表位区域通过Linker进行链接并将462-545位的loop功能区折叠形成3个重复序列，具体序列如下：

atggcatcaggaggagctttttgtcttattgctaacgatgggaaggccgacaagattatattggcccaagacttgctgaatagcaggatctctaacattaaaaatgtgaacaaaagttatgggaaacccgatcccgaacccactttgagtcaaatcgaagaaacacatttggtgcattttaatgcgcattttaagccttatgttccagtagggtttgaatacaataaagtacgcccgcatacgggtacccccaccttgggaaacaagcttacctttggtattccccagtacggagactttttccatgatatggtgggccatcatatattgggtgcatgtcattcatcctggcaggatgctccgattcagggcacgtcccagatgggggcccatgggcagcttcaaacgtttcctcgcaacggatatgactgggacaaccaaacacccttagagggcgccgtttacacgcttgtagatccttttggaagacccattgtacccggcacaaagaatgcgtaccgaaacttggtttactactgcgaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattccctagacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaaatgactggatataagcacttggttggccaggaggtatcggtggagggaaccagtggccctctcctatgcaacattcatgatttgcacaagccgcaccaaagcaaacctattcttaccgatgaaaatgatacgcagcgaacgtgtagccataccaacccgaaatttctttcacagcattttcccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctatcacggacgcaacgtatctggacataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagttgcgcttttggtttaatgagaacgtgaaccttgctattccctcagtatccattcccttcggcgagcgctttatcaccataaagcttgcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttgtacgccagtcacgttttatagctggacgccccagtagacgcaatatacgctttaaaccatggtttatcccaggagtcattaatgaaatctcgctcacgaataatgaactttacatcaataacctgtttgtaacccctgaaatacacaacctttttgtaaaacgcGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCCcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCCcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCCcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcat(SEQ ID NO:31)。

将该基因序列插入真核表达载体制备抗原。

上述基因序列由北京擎科生物科技有限公司人工合成，在序列两端分别引入EcoRI和Xho I酶切位点，通过两酶切位点将序列N端引入10个His和3个Flag的B646L序列插入到pCMV载体中构建成pCMV-ASFV-p72重组质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板过夜培养。次日挑取阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌液加入甘油保菌后，-80℃保存备用。

2.2B602L和B438L重组质粒的构建

根据GenBank中公布的非洲猪瘟黑龙江株(MK333180.1)的B602L基因全长序列(1953bp)，由北京擎科生物科技有限公司合成，并在序列两端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点，通过两酶切位点将N端引入1个Flag和1个Strep的B602L目的基因序列插入到pCMV载体中构建成pCMV-ASFV-B602L重组质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板过夜培养。次日挑取阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌液加入甘油保菌后，-80℃保存备用。

根据GenBank中公布的非洲猪瘟黑龙江株(MK333180.1)的B438L基因全长序列(1317bp)，由北京擎科生物科技有限公司合成，并在序列两端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点，通过两酶切位点将N端引入1个Flag和1个Strep的B438L目的基因序列插入到pCMV载体中构建成pCMV-ASFV-B438L重组质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板过夜培养。次日挑取阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌液加入甘油保菌后，-80℃保存备用。

2.3重组质粒的转染

用SMM 293-TI培养基和5％CO₂在37℃下悬浮培养HEK-293F细胞。利用转染试剂PEI 12mg将2mg pCMV-ASFV-p72质粒、2mg pCMV-ASFV-B602L和2mg pCMV-ASFV-B438L质粒共同转染1L密度为2×10⁶cells/mL的293F细胞。

2.4ASFV-p72重组蛋白的表达与纯化

转染293F细胞48h后，以1000×g离心20min收集转染细胞，细胞沉淀用含有20mMhepes缓冲液，pH7.4，300mM的NaCl和PMSF蛋白酶抑制剂的重悬缓冲液重悬，冰上超声3min。160000rpm，4℃离心20min，取上清用0.22μm的滤器去除杂质，向上清中加入抗flag标签的亲和beads结合，结合蛋白用重悬缓冲液洗涤两次，然后用洗脱缓冲液(0.1mg/mL3×flagpeptide，20mM HEPES and 300mM NaCl，pH 7.4)洗脱目标蛋白。洗脱液进一步用Superdex200 10/300GL预装柱进行纯化，采用20mM咪唑的缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.5)洗脱杂蛋白，用200mM咪唑(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，200mM咪唑，pH7.5)洗脱目标蛋白，收集ASFV-p72重组蛋白峰的洗脱液，每管洗脱液取适量样品进行SDS-PAGE检测。用10KD超滤浓缩管浓缩目的蛋白，纯度达到要求后，采用BCA法测定蛋白浓度，分装后-20℃保存备用。

采用镍柱纯化p72重组蛋白，收集目的蛋白峰的洗脱液，对每管洗脱液取适量样品进行SDS-PAGE检测，检测结果见图1，在78KD左右有一条带，符合预期目的条带大小。BCA法测定的蛋白浓度为3.2mg/mL。

3.重组p72蛋白的鉴定

3.1表达产物的SDS-PAGE分析

将洗脱的重组蛋白取样进行SDS-PAGE电泳。

(1)灌制12％分离胶配制(15.08mL)：纯化水5.1ml，30％丙烯酰胺贮存液6.0mL，Tris-HCl(1.5moL/L，pH值8.8)3.8mL，10％SDS 150μL，10％过硫酸铵150μL，TEMED5μL，ddH₂O补足15mL。将分离胶各组份混匀，在安装好的玻璃平板中，立即加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖水层封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。室温(15～25℃)静置约30min，待凝胶聚合完成后会出现一条非常明显的分界面，此时可倒掉上层封顶的水层，用滤纸尽可能吸干多余液体。

(2)灌制5％浓缩胶：30％丙烯酰胺贮存液1.0mL，Tris-HCl(1moL/L，pH值6.8)750μL，10％SDS 60μL，10％过硫酸铵60μL，TEMED 6μL，用ddH₂O补足至6mL。将浓缩胶各组份混匀，立即加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，尽快小心插入梳子，避免产生气泡。室温(15～25℃)静置约30min后，小心拔出梳子。

(3)电泳：在电泳槽中加入Tris-甘氨酸缓冲液。取适量的重组蛋白样品，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，水浴煮沸5min，上样20μL，用80V电压电泳至溴酚兰进入分离胶，将电压提高到120V，继续电泳至溴酚兰到达凝胶底部。

(4)染色：电泳结束后，取下凝胶用纯化水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮兰染色液(45mL甲醇：45mL水：10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮兰)浸泡凝胶，置于脱色摇床上室温(15～25℃)染色2h。

(5)脱色：用纯水冲洗染色的凝胶后，将其置于30％甲醇和10％冰乙酸混合液中，振摇脱色，其间更换脱色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入纯水中终止脱色。3.2表达产物的Western-blot分析

取纯化的重组p72蛋白样品进行SDS-PAGE，结束后，取出凝胶，按下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸。用干净的玻棒轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以消除各层之间的气泡。海绵垫和滤纸、PVDF膜预先在转移缓冲液中平衡10min。将固定好的凝胶-膜：“三明治”转移至电转仪中，凝胶侧朝向负极，PVDF膜侧朝向正极，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h。转移完毕后取下PVDF膜，进行如下操作：

(1)洗膜I：转移完毕后取下PVDF膜，放入大小适当的玻璃平皿中，用TBST缓慢震荡洗膜3次，每次5min；

(2)封闭：将PVDF膜放入大小适当的玻璃平皿中，用5％脱脂奶粉37℃封闭作用1h；

(3)洗膜Ⅱ：弃去封闭液，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5min；

(4)加一抗：加入封闭液稀释的抗His标签单克隆抗体(鼠源：工作浓度1:2000)，室温缓慢振摇1h；

(5)洗膜Ⅲ：弃去一抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5min；

(6)加二抗：加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(工作浓度1:10000倍稀释)，室温缓慢振摇1h；

(7)洗膜Ⅳ：弃去二抗，用TBST缓慢振摇洗膜3次，每次5min；

(8)显色：将PVDF膜放入化学发光底物溶液中，避光显色，在凝胶成像仪上成像拍照。

采用抗His标签单克隆抗体，对纯化后的p72蛋白做Western Blot鉴定，在75KD左右出现目的条带，结果见图2。

3.3重组蛋白特异性鉴定

采用Western Blot方法对重组p72蛋白的特异性进行鉴定。其中一抗分别为标准阳性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN4-F122株)阳性血清，猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)阳性血清，猪瘟病毒(C株)阳性血清，猪伪狂犬病毒(Kartha-K61株)阳性血清，猪阴性血清，二抗为HRP标记的山羊抗猪IgG。具体操作步骤参照3.1和3.2。

采用Western Blot方法，对纯化后的重组p72蛋白进行特异性鉴定，结果见图3。从图中可以看出，p72蛋白仅与标准阳性血清出现明显的阳性反应，而与猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN4-F122株)阳性血清，猪细小病毒(WH-1)阳性血清，猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)阳性血清，猪瘟病毒(C株)阳性血清，猪伪狂犬病毒(Kartha-K61株)阳性血清，猪细小病毒(WH-1)阳性血清，猪阴性血清均未发生交叉反应，证明该重组蛋白具有良好的特异性。

3.4重组蛋白的免疫原性

将100μg重组p72蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，采用腹腔注射的方式免疫8周龄BALB/c小鼠2只，同时用弗氏完全佐剂与PBS乳化后免疫阴性小鼠2只；14天后进行第二次免疫，用弗氏不完全佐剂与100μg p72蛋白等体积乳化后免疫阳性组小鼠，阴性组小鼠同样处理；再过28天第三次免疫，取100μg重组p72蛋白免疫阳性组小鼠，阴性组小鼠用PBS免疫。首免和二免后分别采集小鼠血清，三免14天后采集小鼠血液，收集血清。

将纯化的重组p72蛋白稀释至1mg/mL，每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；用PBS洗涤3次，每次2～3min，以5％BSA于37℃封闭2h；PBS洗涤3次，每次2～3min；p72一免、二免、三免后获得的抗血清用5％BSA进行1:100稀释，分别加入对应的蛋白孔，37℃孵育1h，阴性血清做同样处理；PBST洗涤5次，每次2～3min；加入用5％BSA稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(稀释比1:5000)，37℃孵育1h；PBST洗涤5次，每次2～3min，每孔加入100μL TMB显色液，避光显色15min，加入2mol/L H₂SO₄终止反应并检测OD₄₅₀值。

采用间接ELISA测定免疫小鼠一免、二免、三免后血清中的特异性抗体效价。如图4所示，与对照组相比，重组p72蛋白免疫小鼠后诱导产生了特异性抗体，且免疫组小鼠血清的效价随时间的延长而升高，三免后血清的OD450_nm值可达到1.5左右，而对照组的OD450_nm在0.1以下。

实施例2抗非洲猪瘟病毒p72蛋白鼠源单克隆抗体的制备

1.材料

1.1病毒：猪伪狂犬病活疫苗(Kartha-K61株)(Pseudorabies virus，PRV)，购自青岛易邦生物工程有限公司；猪细小病毒病灭活疫苗(WH-1)(porcine parvovirus，PPV)，购自武汉科前生物股份有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)(porcine circovirus，PCV2)购自哈尔滨维科生物技术开发公司，猪瘟活疫苗(C株)(Classical Swine Fever，CSF)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F122株)(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)购自哈药集团生物疫苗有限公司，上述病毒均由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所从疫苗中分离、鉴定和保存。

1.2细胞：SF9细胞、293F细胞、Hi5细胞、SP2/0细胞，均由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所鉴定、保管和供应。

1.3蛋白：纯化的重组p72蛋白，由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所鉴定、保管和供应；商品化His标签蛋白购自上海博奥派克生物科技有限公司。

1.4试验动物：6～8周龄雌性BALB/c小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.5相关试剂：HRP标记羊抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗鼠IgG抗体、HAT培养基、HT培养基、PEG1450均购自Sigma公司；腹水专用佐剂、Quick Antibody-Mouse 5W佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒(Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit)，购自Thermo Scientific公司。

1.6.免疫动物：用PBS将重组p72蛋白稀释到1mg/ml最终浓度，充分混匀佐剂，无菌条件下取出25μL佐剂与抗原等体积迅速混匀。将10只老鼠分为两组，分别做背部皮下多点注射或者腿部肌肉注射。往后每间隔两周免疫一次，再免疫两次，免疫剂量及免疫方式同首免，每次免疫后7～10日采血，用间接ELISA方法检测小鼠产生的抗体效价。选择抗体效价高的小鼠，在融合前第3天进行加强免疫，即腹腔注射不加佐剂的抗原100μg，冲击免疫3天后取小鼠脾细胞与SP20瘤细胞进行融合。

2.杂交瘤细胞株的建立

2.1SP2/0细胞的准备

细胞融合前3天处理细胞，弃去细胞上清，用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)将细胞重悬，以2×10⁵个细胞/min的量接种3～4皿。于细胞融合前1天观察SP2/0细胞状态，细胞应浑圆透亮，大小均一，且边缘圆滑。在进行细胞融合前，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数后备用，SP2/0细胞数目记为B。

2.2免疫脾细胞的制备

取正常BALB/c小鼠，眼球采血(收集血清，作为阴性血清对照)。取加强免疫后3天的小鼠，眼球采血(收集血清，作为阳性血清对照)，将小鼠处死后用75％酒精浸泡消毒10min，移入超净台中，无菌条件下，用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剪开皮肤，暴露腹腔，分离免疫小鼠的脾细胞，移入预先加RPMI-1640培养基的平皿中，置于200目筛网上，用5mL注射器芯研磨，并用RPMI-1640培养基将筛网两面的细胞冲洗到平皿中，收集细胞移入50mL离心管中，1000rpm，离心5min，重复1次，用1640共洗涤2次。利用计数板计数。脾脏细胞的数目总数一般在8×10⁷-1.2×10⁸个之间。记录免疫脾细胞的数目为A。

2.3细胞融合

收集培养好的sp2/0骨髓瘤细胞和脾细胞，B：A的数目为1:4～1:10之间均可。脾细胞第三次洗涤时，将sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，一起离心清洗，转速1000rpm，洗涤4min即可。

洗涤后，倒去上清，留少许溶液(保证细胞不干掉)，然后在手掌上轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀。用1mL的吸管吸取0.8mL预温至37℃的50％的PEG1450，手持装有混合细胞的50mL离心管(倾斜离心管)，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻转动，1min内加完，室温放置1min，从CO₂培养箱取出温育到37℃的50mL的1640，用吸管吸取10mL缓缓加到融合细胞上，使细胞团块分散，加完第1个10mL后，接着沿管壁加完剩下的，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。1500r/min离心5min，弃上清，用含有HAT培养液将融合细胞重悬。根据sp2/0的数目来计算铺的平板的数目，保证每个孔中的sp2/0的数目为4000-10000个/孔。将融合细胞滴加至96孔细胞板内。于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养。

2.4间接ELISA方法的建立

间接ELISA用方阵滴定法摸索抗原的最佳包被浓度和酶标二抗的最佳稀释度，操作步骤如下：

(1)包被：将纯化好的重组p72蛋白稀释至1mg/mL后用包被液稀释成1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:20000分别进行包被，100μL/孔，2～8℃孵育过夜；

(2)洗涤：取出酶标板，弃掉包被液，用PBST洗涤3次，拍干；

(3)封闭：每孔加入5％BSA(PBST配制)200μL/孔，37℃孵育1h，重复(2)洗涤3次，拍干；

(4)一抗：按照100μL/孔加入1:5000稀释的阴性血清和阳性血清，同时设空白对照，37℃孵育1h，重复(2)洗涤3次，拍干；

(5)二抗：将酶标二抗用稀释液(即封闭液)按1:5000、1:10000、1:20000、1:40000进行稀释，100μL/孔，37℃反应1h，重复(2)洗涤3次，拍干；

(6)显色：每孔加入100μL/孔TMB显色液，室温避光显色15min；

(7)终止并读数：按50μL/孔加入硫酸(2moL/L)终止反应，用酶标仪检测OD450nm值。

通过上述方阵滴定的方式确定了间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.1mg/mL，酶标二抗的最佳稀释度为1:10000。

3.阳性杂交瘤细胞株的初步筛选

上述融合细胞长至孔底1/3～1/2时，取细胞上清通过间接ELISA法对其进行检测和筛选阳性杂交瘤细胞。筛选的阳性克隆通过有限稀释法连续克隆2～3次，至阳性率为100％，对细胞株进行扩大培养，冻存于液氮保存阳性细胞株。

筛选方法如下：

(1)包被

A：阳性抗原板的制备：用包被液(碳酸盐缓冲液，0.05mol/L，pH值9.6)将重组p72蛋白稀释至1μg/mL以100μL/孔包被酶联反应板，在2～8℃过夜；

B：阴性抗原板的制备：将商品化His标签蛋白按100μL/孔包被酶联反应板，在2～8℃包被过夜；

(2)洗板：甩去孔内液体，用洗涤液(PBST：含0.05％的Tween-20的PBS)洗涤酶联反应板，250μL/孔，洗涤3次，拍干；

(3)封闭：加入封闭液(含5％BSA的PBST溶液)，200μL/孔，在37℃封闭1h，重复(2)洗板3次，拍干；

(4)上样：取杂交瘤细胞上清作适当稀释，100μL/孔加入阳性抗原和阴性抗原包被的酶标板中，37℃孵育1h，甩干液体，重复(2)洗板3次，拍干；

(5)酶标抗体：加入羊抗鼠IgG酶标抗体(1:10000稀释)，100μL/孔，在37℃孵育1h，重复(2)洗板；

(6)底物：加入底物溶液，100μL/孔，在室温(15～25℃)，避光孵育15min；

(7)终止：加入终止液(2moL/L H₂SO₄)，100μL/孔，轻微震荡混合均匀后，在450nm波长下，用酶标仪读取OD_450nm值(应在加入终止液后15min内完成读数)，并记录结果。

(8)判定：P/N≥2.1，判定为阳性；P/N＜2.1，判定为阴性。依次判定阳性杂交瘤细胞孔。

(9)杂交瘤细胞的筛选：选取针对重组p72蛋白反应阳性且与His标签蛋白反应阴性的细胞克隆株。经过4次筛选，最后筛选出8株分泌非洲猪瘟重组p72蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，12F6、8C10、5G8、5C6、18G4、22H6、30C3、24E7，将8株杂交瘤细胞扩大培养。

4.单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

4.1重组Bacmid-ASFV-p72的构建

根据GenBank中公布的非洲猪瘟黑龙江株(MK333180.1)的p72基因全长序列(1941bp)由北京擎科生物科技有限公司合成，并插入到pFastBac1载体中构建pFastBac1-ASFV-p72重组质粒，将测序正确的阳性重组质粒pFastBac1-ASFV-p72转化至DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑筛选，37℃培养48h后，挑选白色菌落用M13通用引物进行鉴定后扩大培养，随后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名为Bacmid-ASFV-p72。

4.2重组Bacmid-ASFV-p72转染SF9细胞

准备生长良好的SF9细胞，将Bacmid-ASFV-p72转染SF9细胞，包装出重组杆状病毒后，用P3代病毒侵染Hi5细胞，根据细胞数目铺96孔板，继续培养48h后，吸弃培养基上清，PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛室温固定细胞15min；PBS洗三次后，4℃放置备用。

4.3单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

(1)加一抗：在固定好的细胞中每孔加入50μL杂交瘤细胞上清，在37℃孵育1h；

(2)洗涤：用PBST洗涤5次，每次3～5min；

(3)加二抗：加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1:100稀释)，50μL/孔，在37℃避光孵育1h，重复步骤(2)洗涤；

(4)结果观察：用倒置荧光显微镜观察试验结果。

从图5中可以看出阳性对照可以清晰的看到绿色荧光，而阴性对照看不到。

5.杂交瘤细胞的亚克隆

5.1有限稀释法筛选亚克隆：将筛选的阳性杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，计数，用适量含HAT的RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)稀释，5个细胞/mL，将该细胞悬液滴加入96孔细胞板中，200μL/孔，使每孔约为1个细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

5.2单克隆抗体的特异性检测：在克隆后第9～11天，细胞克隆长满培养孔1/3～1/2时取上清按照上述方法进行间接ELISA检测，筛选形态良好、检测呈阳性的细胞孔，继续进行克隆化。阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可转种至平皿中扩大培养，并冻存细胞。

实施例3单克隆抗体的纯化、鉴定及配对试验

1.杂交瘤细胞株腹水的制备

取8～10周龄的经产BALB/c小鼠，腹腔注射腹水专用佐剂0.5mL，12～15天后，将筛选到的杂交瘤细胞株进行扩大培养，收集杂交瘤细胞，1000rpm离心10min，用适量无菌PBS重悬，腹腔注射0.2mL杂交瘤细胞/只小鼠(约含2.5×10⁶个细胞)，约10～15日后，待小鼠腹围增大后，使用无菌注射器针头采集腹水。将收集到腹水以10000r/min离心10min，收集中间层，用0.45μm滤器过滤后即为相应的单克隆抗体(腹水)，分别取上清并按：1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000梯度稀释，用间接ELISA方法测定腹水效价。效价检测结果见表1。

表1单克隆抗体的间接ELISA检测结果

2.单克隆抗体腹水的纯化

2.1辛酸-饱和硫酸铵沉淀：辛酸-饱和硫酸铵纯化抗体的操作步骤如下：

(1)腹水的预处理：将采集的腹水在2～8℃条件下，以8000rpm离心30min，除去细胞残渣以及小颗粒物质。

(2)向1份预处理过的腹水中加4倍体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.06moL/L，pH值5.0)，用0.1moL/L的NaOH调pH值至4.5。

(3)于室温(15～25℃)下边搅拌边逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL辛酸的量加入，滴加完后4℃继续搅拌25min，以6000rpm 4℃离心15min，弃沉淀。

(4)上清经0.45μm滤器过滤至新的离心管中，加入1/l0体积的10×PBS(0.01moL/L，pH值7.2)，用5moL/L的NaOH调pH值至7.4。

(5)上清液在2～8℃冰浴下静置30min，加入0.277g/mL的硫酸铵(45％饱和度)，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，以6000rpm 4℃离心15min，弃上清，收集沉淀。

(6)沉淀溶于1/3腹水体积的1×PBS(0.01moL/L，pH值7.2)中，并于1×PBS缓冲液中2～8℃条件下透析6h，除去残留的硫酸铵。

2.2Protein G(或Protein A)纯化单克隆抗体

按照GE公司Protein G(或Protein A)纯化小柱的说明书进行操作，具体操作步骤如下：

(1)准备收集管，并加入30μL的中和溶液(pH9.0的1M Tris-HCl缓冲液)；注：30μL中和液是说明书给出的，但若加入30μL会使溶液偏碱性，建议可事先测试一下pH值，加入多少中和液合适。最近一次做实验是400μL洗脱液中加入20μL中和液比较合适；

(2)取出柱子，上下颠倒重悬介质，将柱子下面的截留部分掰掉，但是不要扔掉(后面要用)，70-100g离心30s；

(3)平衡：加600μL的结合液(pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液)，100g离心30s；

(4)结合抗体：取600μL单克隆抗体洗脱液。加不超过600μL的抗体液，将上面的帽子旋紧，结合20min以上，中间轻轻的混匀。100g离心30s；

(5)洗涤：加600μL的结合液，100g离心30s，重复一次，再加600μL结合液，100g离心30s；

(6)洗涤抗体：加400μL的洗涤缓冲液(pH2.7 0.1M甘氨酸缓冲液)，上下颠倒混合，将柱子放在收集管上，70g离心30s，收集洗脱液，再结合柱子，上下颠倒混合，将柱子放在(1)准备的收集管上，收集洗脱液。再加400μL的洗涤缓冲液的放在一个新的(1)准备好的收集管上，70g离心30s。

(7)抗体浓缩：在2～8℃条件下采用10KD超滤浓缩管(50mL)用1×PBS进行离心换液3次，将抗体溶液浓缩至合适体积，转移至1.5mL离心管中，以8000rpm离心30min，除去不溶性沉淀，测定浓度后分装备用。

以纯化单抗进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，凝胶成像系统里拍照，记录检测结果。如图6所示，大约在分子量55kDa和25kDa处分别可见抗体重链和轻链两条特异性条带，符合预期的大小。

3.单克隆抗体的特异性鉴定

采用间接ELISA方法测定筛选的纯化的单克隆抗体与猪伪狂犬病病毒(Kartha-K61株)、猪细小病毒(WH-1)、猪圆环病毒2型(LG株)、猪瘟病毒(C株)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN4-F122株)以及293F细胞培养上清是否存在交叉反应性。结果见表2。

表2单克隆抗体特异性检测结果

注：“+”代表阳性；“—”代表阴性。

4.单克隆抗体相对亲和力的测定

用实施例1中试验确定的最佳抗原包被浓度和最佳二抗稀释浓度进行间接ELISA方法测定纯化后单克隆抗体的相对亲和力。将纯化后的单克隆抗体测定浓度后，稀释至1mg/mL，然后用封闭液(5％BSA)分别稀释成300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL后进行间接ELISA检测。反应结束后读取OD450nm值，以单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD450nm值作图，曲线趋于平坦时的OD450nm作为100％，即抗原与单抗的结合已达到饱和状态，取曲线上50％饱和度所对应的单抗浓度，即为该株单克隆抗体的相对亲和力，亲和力越大，所需单克隆抗体的量越低。具体结果见表3。

表3单克隆抗体的相对亲和力结果

5.单克隆抗体抗原结合位点分析

5.1单抗-抗原饱和曲线的测定

用包被液把抗原分别稀释成0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL包被过夜，洗涤后以5％BSA封闭，洗涤后每孔加入100μL杂交瘤细胞上清，37℃孵育1h，洗涤，再加入已确定最佳稀释度的酶标抗体(1:10000)孵育1h，洗涤后，经过TMB显色后读取在450nm下的OD值数据，分析数据得出每株单抗的抗原饱和浓度。

5.2叠加ELISA分析单克隆抗体抗原结合位点

以上述实验得出的每株饱和抗原浓度分别进行包被，4℃过夜，浸泡洗涤3次，每次3min；每孔加入封闭液200μL，37℃孵育1h，洗涤3次，每次3min；分别加入对应的杂交瘤细胞上清，各做3个复孔，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤3次，每次3min；分别加入相对的另一株杂交瘤细胞上清，37℃孵育1h，洗涤3次，每次3min；再加入羊抗鼠HRP抗体(1:10000稀释)，37℃孵育1h，洗涤3次，每次3min；最后加入100μL TMB显色液，反应15min终止并读数，记录OD450nm值。

按照以下公式计算各McAb组合的叠加系数：

其中A1、A2、A(1+2)分别代表McAb-1、McAb-2和两个组合在一起的OD450nm值。结果判断：当两个McAb结合到不同表位时，A(1+2)＝A1+A2，A.I＝100％；当两个McAb结合到相同表位时，

A.I＝0％，考虑到技术误差，当A.I＞40％即可认为两个McAb识别不同表位。

依据叠加ELISA方法计算8株单克隆抗体组合的叠加系数(表4)，结果显示，5C6、18G4、22H6、24E7分别组合的叠加系数A.I均小于40％，证明该4株McAb识别的是相同的抗原位点，而12F6、8C10、5G8、30C3分别组合的叠加系数A.I均大于60％，证明这4株McAb识别的是不同的抗原位点。

表4单克隆抗体组合的叠加系数

6.双抗体夹心法筛选配对抗体

用双抗体夹心ELISA法进行抗体配对实验以选取最佳抗体配对组合。采用本实施例中方法制备筛选到的杂交瘤细胞的腹水并纯化单克隆抗体，主要有12F6、8C10、5G8、5C6、18G4、22H6、30C3、24E7，并以Abcam公司的HRP Conjugation Kit标记试剂盒进行HRP标记，然后两两配对进行双抗体夹心ELISA配对实验。

6.1HRP标记单克隆抗体

按照试剂盒说明书进行操作，50μg单克隆抗体稀释至80μL PBS中，加入9μLModifier reagent，轻轻混匀后，室温静置5min，然后加入10μL含有50μg HRP的PBS溶液，轻轻混匀后，室温避光孵育过夜，次日再加入10μL Quencher reagent轻轻混匀终止反应，室温下30min以后便可以稀释使用。

6.2单克隆抗体配对实验

将标记好的12F6、8C10、5G8、5C6、18G4、22H6、30C3、24E7作为检测抗体，未标记的抗体作为捕获抗体，按照前面确定的ELISA检测方法进行配对检测。方法为：以捕获抗体(1:500稀释)作为包被抗体分别包板，4℃过夜；PBST洗板3次，每次3min；然后每孔加入5％BSA200μL，37℃封闭1h；PBST洗涤3次，每次3min；重组p72抗原(1:100稀释)作为待检抗原，同时设置PBS作为阴性对照，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min；将标记好的12F6、8C10、5G8、5C6、18G4、22H6、30C3、24E7作为检测抗体，1:200稀释后按100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次3min，加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光反应15min，加入50μL/孔终止液终止反应，酶标仪检测OD450nm值。检测完毕记录同一对捕获抗体和检测抗体的P(阳性对照OD450nm值)/N(阴性对照OD450nm值)值，以P/N值最大的作为最佳配对抗体。

经过配对实验，P/N结果如表5所示，5G8和12F6可以配对，配对效果较好，其中5G8作为捕获抗体，12F6标记HRP作为检测抗体。

表5单克隆抗体配对实验设计

7.杂交瘤细胞染色体数的检测

杂交瘤细胞建株后制备染色体，采用秋水仙素法。实验前将杂交瘤细胞传代培养，使其进入对数增殖期；加入适量秋水仙素，使终浓度为0.3mg/L，继续培养1h，吹打细胞移入离心管，1000rpm 10min，弃上清；加入已预温至37℃的0.075moL/L KCL溶液5mL，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20min；向悬液中加入临用前配制的固定液(甲醇与冰醋酸3:1混合)1mL，混匀，1 000rpm 10min，弃上清液；加入固定液5mL，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30min，1 000rpm 10min，弃上清液；重复操作一次；其后加5mL固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，4℃过夜；取出离心管，1 000rpm 5min，轻轻吸弃上清液，根据细胞压积留下约0.2-0.5mL固定液，并悬浮混匀，悬滴在刚从冰水中取出的载玻片上，火焰固定，自然干燥；用新配制的100g/L Giemsa染液染色10-20min，水冲洗去染液，自然干燥，显微镜下观察染色体并计数。

SP2/0细胞的染色体数为62-68条，脾细胞染色体数为40条，而杂交瘤细胞12F6及5G8的染色体数为102-108条，高于任一亲本细胞的染色体数目，见图7。

8.单克隆抗体亚类的测定：将杂交瘤细胞上清5G8和12F6按照Rapid ELISA MousemAb Isotyping Kit说明书进行操作，进行抗体亚类的鉴定。具体操作步骤如下：

8.1试剂配置

(1)TBS配制：将BumH Tristan Buffered Saline试剂加入到500mL超纯水中，充分溶解。

(2)1×Wash Buffer配制：将30mL 30×Wash Buffer加入到870mlL超纯水中，充分溶解。

8.2样品处理

(1)杂交瘤细胞上清处理：用TBS1:10稀释样品。(建议稀释范围为1:1～1:10)。

(2)腹水处理：用TBS1:75000稀释样品。(建议稀释范围为1:50000～1:80000)。

(3)纯化后抗体处理：用TBS1:75000稀释样品。(建议稀释范围为25ng/mL～2μg/mL)

(4)亚类鉴定：将TMB底物和板条平衡至室温，加入50μL稀释好的样品至8孔板条的各个孔中，再加入50μL HRP标记的山羊抗鼠IgG+IGA+IgM至8孔板条的各个孔中，微量震荡器混匀，室温孵育1h。弃去孵育液，每孔加入250μL的洗液洗板一次，然后拍干，重复三次。每孔加入75μL TMB底物，1min后，可观察到蓝色的阳性孔。反应5～15min后，加入75μL终止液，反应孔颜色由蓝色变为黄色。测定OD450nm值，反应孔中的吸光度大于0.2判为阳性。

筛选的2株单克隆抗体(腹水)经免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定，结果如图8所示，12F6株、5G8株的抗体亚类均为IgG1/κ。

9.单克隆抗体序列的测定

9.1杂交瘤细胞RNA的提取

12F6和5G8杂交瘤细胞长至单层时，弃掉培养液并使用3mL无菌PBS吹打并计数，收集1×10⁶个细胞至1.5mL离心管中，800r/min离心5min，弃上清后以RNA提取试剂盒按照说明书操作步骤提取杂交瘤细胞的RNA。

9.2杂交瘤细胞提取RNA的RT-PCR扩增与鉴定

设计简并引物14条(其中VH-F 4条，VH-R 2条，VL-F 6条，VL-R 2条)，总计20对。

表6单克隆抗体重链和轻链RT-PCR扩增引物

引物	序列(5'至3')
		mVL-F1	ATGGAGACAGACTCCTGCTAT(SEQ ID NO:5)
mVL-F2	ATGGATTTTCAGGTGTTTTCAG(SEQ ID NO:6)
		mVL-F3	ATGRAGTCACAKACGGTCTTYRTA(SEQ ID NO:7)
mVL-F4	ATGAGGKCCCHGCTYTYCTKGGR(SEQ ID NO:8)
		mVL-F5	ATGAAGTTGCCTGTGCTGTTG(SEQ ID NO:9)
mVL-F6	ATGATGAGTCCTGCCTTCC(SEQ ID NO:10)
		mVL-R1	ACTGGATGGTGGGAGGA(SEQ ID NO:11)
VL-R2	CCCAAGCTTACTTGGGAAGATGGA(SEQ ID NO:12)
		mVH-F1	ATGGRATGSAGCTGMATSCTCTT(SEQ ID NO:13)
mVH-F2	ATGRACTTCGGGYCTKGGTTTT(SEQ ID NO:14)
		mVH-F3	ATGGCTGTCTTGGGGCTCTTCT(SEQ ID NO:15)
mVH-F4	ATGGRCAGTACHTYY(SEQ ID NO:16)
		mVH-R1	AYCTCCACACRCCAGTGGATAGAC(SEQ ID NO:17)
VH-R2	CCCAAGCTTRCCARKGGATRA(SEQ ID NO:18)

注：R＝A/G，S＝C/G，Y＝C/T，M＝C/A，K＝T/G，H＝A/T，D＝G/T/A

以提取的RNA为模板，引物见表6，反应体系50μL(10×One Step RNA PCR Buffer5μL，MgCl₂(25mM)10μL，dNTP Mixture(10mM)10μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，AMVRTase XL(5U/μL)1μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL，F等量混合引物1.5μL，R等量混合引物1.5μL，模板4μL，ddH₂O 15μL)，反应程序(50℃反转录30min，94℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增35个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察RT-PCR扩增结果，鉴定后选取合适引物对VH和VL进行大量扩增(本步骤重复两次)。使用2％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，然后使用胶回收试剂盒回收VH和VL目的基因。

9.3VH和VL的连接转化与鉴定

将回收纯化的VH和VL目的基因与

连接，反应体系如下：1μL

4μL回收纯化的PCR产物。室温反应30min。

取Trans 5α感受态细胞各50μL于冰上融化后，加入连接产物混匀，冰浴30min，于42℃水浴热激45s，再冰浴2-3min。加入600μL的LB液体培养基，37℃220r/min摇床复苏培养60min后，取100μL菌液均匀涂布于LB固体培养基(AMP抗性)，于37℃温箱中培养12-15h，观察转化单菌落的出现。挑取4-6个单菌落于1.5mL离心管(600μL的AMP抗性LB液体培养基)，于37℃220r/min摇床中培养，并设立对照。

37℃培养4小时后，每个离心管取2.0μL菌液进行菌液PCR鉴定，反应体系20μL(rTaq酶(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5mM)2.0μL，M13-F(10μM)1.0μL，M13-R(10μM)1.0μL，菌液2.0μL，ddH₂O 9.8μL)，反应程序(95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果，选取阳性克隆菌液送至测序。

选择5G8单克隆抗体轻、重链基因克隆经鉴定后的3个阳性克隆为测序样品，获得抗体可变区核苷酸序列，使用DNAStar和IgBLAST软件进行比对，结果显示：3个轻链可变区基因均长354bp，编码118个氨基酸；3个重链可变区基因序列均长393bp，编码131个氨基酸。重链可变区具有如下面SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：

其中，加粗加下划线的部分分别为重链互补决定区CDR1(SEQ ID NO:19)、CDR2(SEQ ID NO:20)、CDR3(SEQ ID NO:21)。

轻链可变区具有如下面SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列：

其中，加粗加下划线的部分分别为轻链互补决定区CDR1(SEQ ID NO:22)、CDR2(SEQ ID NO:23)、CDR3(SEQ ID NO:24)。

选择12F6单克隆抗体轻、重链基因克隆经鉴定后的3个阳性克隆为测序样品，获得抗体可变区核苷酸序列，使用DNAStar和IgBLAST软件进行比对，结果显示：3个轻链可变区基因均长339bp，编码113个氨基酸；3个重链可变区基因序列均长375bp，编码125个氨基酸。重链可变区具有如下面SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列：

其中，加粗加下划线的部分分别为重链互补决定区CDR1(SEQ ID NO:25)、CDR2(SEQ ID NO:26)、CDR3(SEQ ID NO:27)。

轻链可变区具有如下面SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列：

其中，加粗加下划线的部分分别为轻链互补决定区CDR1(SEQ ID NO:28)、CDR2(SEQ ID NO:29)、CDR3(SEQ ID NO:30)。

实施例4基于非洲猪瘟病毒p72基因的双抗体夹心ELISA方法的建立及应用

1.材料

1.1试剂配制

(1)包被液：0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

(2)洗涤液：pH7.4、0.1M PBS，0.05％Tween-20。

(3)封闭液：以洗涤液配制5％BSA溶液。

(4)稀释液：即为封闭液。

(5)TMB：A液：0.02％H₂O₂，用pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠溶液稀释；

B液：0.4‰TMB-HCl，用50mM、pH2.8的柠檬酸钠溶液溶解。

分别取50μL A液、B液混合避光保存，备用。(也可以用商品化的TMB显色液)

(6)终止液：2M H₂SO₄溶液。

1.2样品

150份2009年-2016年间采集的猪血清样品由波兰国家兽医研究所非洲猪瘟国家参考实验室保存。100份ASFV阴性血清由中国检验检疫科学研究院保存。

2.非洲猪瘟双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的建立

2.1最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定

根据实施例3中确定的捕获抗体为5G8，酶标抗体为12F6(HRP-12F6)，建立双抗体夹心ELISA方法，对重组p72蛋白进行检测，同时设立阴性对照，采用棋盘滴定法确定捕获抗体的包被浓度和酶标抗体的稀释度，检测结束后计算P/N值结果见表7，选择P/N值最高的，确定捕获抗体5G8的最佳包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，检测抗体HRP-12F6的最佳稀释度为1:500。

表7最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定

2.2最佳封闭条件的确定

根据已确定的最佳条件，分别以1％BSA、5％BSA、5％马血清、5％脱脂乳作为封闭液，每种封闭液均设立30min、60min、90min、120min的时间梯度，每组设3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD450nm值，计算P/N值。结果见表8，选择P/N值最高的，确定最佳封闭液为5％BSA，最佳封闭时间为60min。

表8最佳封闭液和封闭时间的确定

2.3酶标抗体孵育时间的确定

根据已确定的最佳条件，对酶标抗体HRP-12F6的孵育时间设立30min、60min、90min、120min的时间梯度，每组各做3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD450nm值，计算P/N值，结果见表9，选择P/N值最高的，确定酶标抗体HRP-12F6的最佳孵育时间为60min。

表9酶标抗体最佳孵育时间的确定

2.4显色时间的确定

根据已确定的最佳条件，对底物显色时间设立为5min、10min、15min、20min的梯度，每组各做3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD450nm值，计算P/N值，结果见表10，选择P/N值最高的，确定底物最佳显色时间为15min。

表10最佳显色时间的确定

2.5判定标准的确定

根据已确定的最佳条件，检测100份已经确定为ASFV阴性的猪血清样品，计算OD450nm的平均值

和标准差(SD)，根据公式

即可确定阳性判定标准。

根据检测结果，计算cut-off value＝0.131+3×0.028＝0.214，即当OD450nm＞0.214时，则判定样品为ASFV阳性，当OD450nm＜0.214时，则判定样品为ASFV阴性。

2.6双抗夹心ELISA检测标准曲线的绘制

将重组p72蛋白样品从200ng/mL2倍倍比稀释至100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL、0.78ng/mL，采用上述优化的最佳双抗夹心ELISA程序检测不同浓度p72蛋白标准品的OD值，重复检测6次，通过计算每个浓度的平均值、标准差，并进行差异显著性分析(t检验)(结果见表11)，从而确定该方法的检测范围为1.5625ng/mL～200ng/mL；再以不同浓度p72蛋白标准品所对应的OD值作为横坐标，以标准品的不同浓度作为纵坐标建立标准曲线，利用Excel软件中的LINEST函数进行线性回归分析，推导回归方程(见图9)。

表11不同浓度p72蛋白标准品的OD值

2.7重复性与稳定性试验

以倍比稀释的重组p72蛋白标准品为检测样品，以同一批制备的抗体包被板子，同一批制备的酶标抗体作为二抗，每个蛋白稀释度设置3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，计算该方法的批内重复性试验变异系数。用不同批次制备的抗体包被板子、不同批制备的酶标抗体作为二抗进行双抗夹心ELISA检测倍比稀释的蛋白标准品，计算该方法的批间重复性试验变异系数。结果显示(见表12)，批内变异系数为0.46％～5.04％，批间变异系数为0.29％～8.43％，批内和批间变异系数均小于10％。表明该方法的重复性较好，稳定性较高。

表12双抗体夹心ELISA重复性试验结果

2.8特异性试验

采用所建立的双抗体夹心ELISA检测猪伪狂犬病病毒(Kartha-K61株)、猪细小病毒(WH-1)、猪圆环病毒2型(LG株)、猪瘟病毒(C株)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN4-F122株)、重组p72蛋白，同时设立阴性对照，进行特异性检测。结果显示(表13)，其余病毒均无交叉反应，表明该双抗夹心ELISA方法特异性较好。

表13双抗夹心ELISA特异性检测结果

2.9样品检测

采用所建立的双抗体夹心ELISA检测由波兰国家兽医研究所非洲猪瘟国家参考实验室保存的150份猪血清，检测结果见表14。同时将该ELISA检测结果与IDVet公司的qPCR-Duplex Qualitative(IDASF-100)和QIAgen公司的Virotype ASFV PCR Kit(281905)两荧光PCR试剂盒进行比较，结果显示，本发明与两种试剂盒的符合率可达到98.7％。

表14双抗夹心ELISA和荧光PCR的样品检测结果

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用

<130> RYP2011017.2

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ala Ser Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Ala

35 40 45

Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ala Asn Cys Thr Gly Asn Ser Lys Phe

50 55 60

Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ala Ala Asp Thr Ser Ser

65 70 75 80

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Leu Ser Asp Thr Tyr Tyr Gly Lys Tyr Glu

100 105 110

Gly Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Pro Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Glu

20 25 30

Ser Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

35 40 45

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Val Pro Ser Thr Arg Glu

50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

65 70 75 80

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Arg Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys His Gln Tyr Tyr Thr Ser Val Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly

100 105 110

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115

<210> 3

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Met Phe Thr

20 25 30

Thr Ala Gly Met Glu Trp Val Gln Lys Lys Pro Gly Lys Gly Leu Lys

35 40 45

Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Leu Gln Gly Val Thr Lys Asn

50 55 60

Gly Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala

65 70 75 80

Ser Thr Thr Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Asn Tyr His Asn Ala Asp Gly Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asp Thr

20 25 30

Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Gln Leu Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr

85 90 95

Pro Gln Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagacag actcctgcta t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggattttc aggtgttttc ag 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgragtcac akacggtctt yrta 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaggkccc hgctytyctk ggr 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaagttgc ctgtgctgtt g 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgatgagtc ctgccttcc 19

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actggatggt gggagga 17

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccaagctta cttgggaaga tgga 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggratgsa gctgmatsct ctt 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgracttcg ggyctkggtt tt 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggctgtct tggggctctt ct 22

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggrcagta chtyy 15

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ayctccacac rccagtggat agac 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaagcttr ccarkggatr a 21

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Phe Asn Ala Ser Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ile Asp Pro Ala Asn Cys Thr Gly Asn Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Gly Leu Ser Asp Thr Tyr Tyr Gly Lys Tyr Glu Gly Asp Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Cys

20

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ser Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Trp Ala Val Pro Ser Thr

1 5

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

His Gln Tyr Tyr Thr Ser Val Tyr Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gly Tyr Ile Ser Met Phe Thr Thr Ala Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Ile Asn Thr His Ser Leu Gln Gly Val Thr

1 5 10

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ala Arg Trp Gly Asn Tyr His Asn Ala Asp Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gln Asn Ile Asn Asp Thr Val Trp

1 5

<210> 29

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Arg Thr Ser Gln Leu Asn

1 5

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Gln Gly Thr Pro Gln Ser Tyr Pro Leu Thr Phe

1 5 10

<210> 31

<211> 2109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480

tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140

tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc ggtggtggtg gtggtggttc ccccattgaa 1320

tatatgttta taggattaaa acctacctgg aacatctccg atcaaaatcc tcatcaacac 1380

cgagattggc acaagttcgg acatgttgtt aacgccatta tgcagcccac tcaccacgca 1440

gagataagct ttcaggatag agatacagct cttccagacg catgttcatc tatatctgat 1500

attagccccg ttacgtatcc gatcacatta cctattatta aaaacatttc cgtaactgct 1560

catggtggtg gtggtggtgg ttcccccatt gaatatatgt ttataggatt aaaacctacc 1620

tggaacatct ccgatcaaaa tcctcatcaa caccgagatt ggcacaagtt cggacatgtt 1680

gttaacgcca ttatgcagcc cactcaccac gcagagataa gctttcagga tagagataca 1740

gctcttccag acgcatgttc atctatatct gatattagcc ccgttacgta tccgatcaca 1800

ttacctatta ttaaaaacat ttccgtaact gctcatggtg gtggtggtgg tggttccccc 1860

attgaatata tgtttatagg attaaaacct acctggaaca tctccgatca aaatcctcat 1920

caacaccgag attggcacaa gttcggacat gttgttaacg ccattatgca gcccactcac 1980

cacgcagaga taagctttca ggatagagat acagctcttc cagacgcatg ttcatctata 2040

tctgatatta gccccgttac gtatccgatc acattaccta ttattaaaaa catttccgta 2100

actgctcat 2109

Claims

1.一种重组p72蛋白，其特征在于，编码所述重组p72蛋白的核苷酸序列

如SEQ ID NO:31所示。

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包含权利要求2所述的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统为感受态细胞。

5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌。

6.权利要求1的重组p72蛋白、权利要求2的表达载体、或者权利要求3-5任一项的表达系统在制备针对p72蛋白的抗体或其抗原结合片段中的用途。

7.权利要求1的重组p72蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒感染的诊断试剂或试剂盒中的用途。

8.非洲猪瘟病毒感染的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1的重组p72蛋白。

9.权利要求1的重组p72蛋白在非洲猪瘟病毒感染的检测试剂盒的质量控制中的应用。

10.权利要求1的重组p72蛋白在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。