CN112111005B - 一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒b646l抗原的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能特异性与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，包括所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒敏感性高，特异性好，可以用于非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测。该竞争ELISA检测试剂盒可以特异性竞争血清中与B646L抗原结合的抗体，在非洲猪瘟抗体的临床检测中具有快速、简便、灵敏、特异等优点。

Description

一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的单克 隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的单克隆抗体及其在竞争ELISA检测方法中检测非洲猪瘟病毒抗体的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种猪的急性、高致死性传染病。ASF在1921年发现于肯尼亚，之后一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，随后造成西欧和拉美一些国家广泛流行，给社会经济带来严重损失。我国自2018年8月在沈阳首次报道以后，迅速波及山东、河南、江苏、河北、安徽、北京等地，截至2019年10月16日，我国共报告发生157起非洲猪瘟疫情，共扑杀生猪119.2万头，给我国生猪产业带来巨大的经济损失。
非洲猪瘟病毒是目前已知唯一的DNA虫媒病毒，病毒有囊膜。ASFV基因组大小为170-190Kb，可以编码150-200种蛋白质，这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。其中B646L基因编码的蛋白是非洲猪瘟病毒的一种主要衣壳结构蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％。非洲猪瘟不能引起中和反应，但有研究表明B646L基因编码蛋白有一个构象中和表位，能够诱导机体产生中和抗体，但遗憾的是该中和抗体不能保护动物免受病毒攻击。但是B646L基因编码蛋白是ASFV衣壳的主要结构蛋白，可诱导机体产生特异性的体液免疫应答，是一种免疫原性抗原，具有很强的抗原稳定性，是ASFV血清学诊断的理想抗原。ASFV常用的实验室诊断方法包括PCR、病原学和血清学等，这其中ELISA方法和Western Blot方法是世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测方式，因此研发更有效的抗体对ASFV血清学诊断试剂的开发具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的单克隆抗体，含所述单克隆抗体的竞争ELISA检测试剂及其检测试剂盒，以及利用所述检测试剂或检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒的方法，以解决现有检测技术的弊端。
第一方面，本发明提供一种抗原多肽，所述抗原多肽的序列选自以下中的一种或多种：
RRNIRFKPWFIPGVIN(SEQ ID NO:19)；
ALWIKLRFWFNENVNL(SEQ ID NO:20)；
FVTPEIHNLFVKRVRF(SEQ ID NO:21)；
RFIAGRPSRRNIRFKP(SEQ ID NO:22)；
PGVINEISLTNNELYI(SEQ ID NO:23)；
QVTHTNNNHHDEKLMS(SEQ ID NO:24)；
SVSIPFGERFITIKLA(SEQ ID NO:25)；
MSALKWPIEYMFIGLK(SEQ ID NO:26)；
ERFITIKLASQKDLVN(SEQ ID NO:27)；和
SLTNNELYINNLFVTP(SEQ ID NO:28)。
第二方面，本发明提供一种能特异性与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；以及所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
其中，
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATEWSFGVPTSDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCATEGPFMSQVGTLVTVSA；
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKYSLLLVYNAKSLAEGVPSRFSGSGAGTQFSLKISSLQTEDFGSYYCQHHYGTPYTFGGGPKLEIK。
优选地，所述抗原的序列选自以下中的一种或多种：
RRNIRFKPWFIPGVIN(SEQ ID NO:19)；
ALWIKLRFWFNENVNL(SEQ ID NO:20)；
FVTPEIHNLFVKRVRF(SEQ ID NO:21)；
RFIAGRPSRRNIRFKP(SEQ ID NO:22)；
PGVINEISLTNNELYI(SEQ ID NO:23)；
QVTHTNNNHHDEKLMS(SEQ ID NO:24)；
SVSIPFGERFITIKLA(SEQ ID NO:25)；
MSALKWPIEYMFIGLK(SEQ ID NO:26)；
ERFITIKLASQKDLVN(SEQ ID NO:27)；和
SLTNNELYINNLFVTP(SEQ ID NO:28)。
第三方面，本发明提供一种特异性竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗体或活性片段，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
优选地，所述抗原的序列选自以下中的一种或多种：
RRNIRFKPWFIPGVIN(SEQ ID NO:19)；
ALWIKLRFWFNENVNL(SEQ ID NO:20)；
FVTPEIHNLFVKRVRF(SEQ ID NO:21)；
RFIAGRPSRRNIRFKP(SEQ ID NO:22)；
PGVINEISLTNNELYI(SEQ ID NO:23)；
QVTHTNNNHHDEKLMS(SEQ ID NO:24)；
SVSIPFGERFITIKLA(SEQ ID NO:25)；
MSALKWPIEYMFIGLK(SEQ ID NO:26)；
ERFITIKLASQKDLVN(SEQ ID NO:27)；和
SLTNNELYINNLFVTP(SEQ ID NO:28)。
优选地，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
进一步优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体T-2。
第四方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述特异性竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白、抗体或活性片段。
优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体T-2。
更优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段为经标记物标记的抗原结合蛋白、抗体或活性片段；进一步优选地，所述标记物选自酶、荧光基团和化学发光基团。
作为本发明的优选方案，本发明提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒包括包被ASFV B646L抗原的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体T-2。
优选地，所述B646L抗原的包被量为0.1-8μg/mL；所述酶标的鼠单克隆抗体T-2使用时进行1:(2000-40000)的体积稀释，优选地，所述B646L抗原经真核表达获得。
进一步地，本发明的试剂盒还可以包括样品稀释液、封闭液、洗涤液、显色液、终止液和ASFV标准阳性血清、阴性血清。
第五方面，本发明提供所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，其中，酶标板的制备是用碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被微孔酶标板，过夜；洗涤，加入5％BSA，封闭，洗涤，干燥。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：其中，酶标板的制备是用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被微孔酶标板，4℃过夜；洗涤液洗涤3次，每孔加入5％BSA 200μL，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次，干燥，真空包装。
第六方面，本发明提供所述特异性结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，或所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒在样品中检测非洲猪瘟病毒的应用。
优选地，所述样品为血清样品或血液样品。
第七方面，本发明提供利用所述特异性结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，或所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒体外检测样品中非洲猪瘟病毒的方法。
优选地，所述样品为血清样品或血液样品。
作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：
(1)将待检样品加入到酶标微孔板中；(2)在酶标微孔板中加入用稀释液稀释的经酶标的所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段并孵育；(3)显色后测定OD450nm值，并计算PI值；以及(4)当被检血清的PI≥50％时，可判定为阳性；当被检样品PI≤40％时，可判定为阴性；当被检样品40％＜PI＜50％，可判定为可疑。
作为本发明的优选方案，利用所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒血清、血液样品的方法包括以下步骤：
步骤(1)取出酶标板，使其恢复至室温；
步骤(2)用稀释液2倍稀释待检样品，每孔50μL加入酶标微孔板中，用稀释液1:20000稀释酶标单抗T-2，50μL/孔，混匀后，37℃孵育30min；
步骤(3)弃掉待检样品，用洗涤液洗涤5次，拍干或抽干；
步骤(4)每孔加入100μLTMB底物显色液，显色15min；
步骤(5)每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止显色，测定OD450nm值，计算PI值。
步骤(6)结果判定：当被检血清的PI≥50％时，可判定为阳性；当被检血清的PI≤40％时，可判定为阴性；当被检血清的PI范围为40％＜PI＜50％时，可判定为可疑。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的针对ASFV B646L抗原的单克隆抗体效价高，性质稳定，可利用小鼠腹水制备抗体，适于大量生产；
(2)酶标后的T-2抗体效价高，以此建立的非洲猪瘟竞争ELISA方法的重复性好，特异性好，敏感性高，与进口的同类商品化试剂盒相比，检测结果阴阳性区分更好；
(3)本发明提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒，包被抗原B646L抗原可以通过真核表达获得，生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于试剂盒的大量生产；
(4)本发明所提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA方法具有快捷、灵敏、简便、特异等优点，在弱阳性样品的检测上相较于现有进口商品化试剂盒更具有优势，在非洲猪瘟的临床检测中具有广泛的应用。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下面表1：
表1
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表2：
表2
Figure BDA0002673340070000071
Figure BDA0002673340070000081
附图说明
图1示出纯化的B646L蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图2示出单克隆抗体T-2与灭活病毒的Western blot结果。
具体实施方式
下面对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例
1.材料
胎牛血清、DMEM、HAT和HT均为美国Gibco公司产品；pcv3阳性血清、蓝耳病阳性血清、塞内卡阳性血清、伪狂犬阳性血清等由本实验室保存。50份灭活非洲猪瘟阳性血清和200份ASFV阴性血清由波兰国家兽医研究所和意大利撒丁岛动物卫生研究所非洲猪瘟国家参考实验室馈赠。疫区15份灭活猪阳性血清和非疫区美国进口的100份猪阴性血清由意大利撒丁岛动物卫生研究所非洲猪瘟国家参考实验室提供。B646L标准抗体检测试剂盒(Ingezim PPA Compac)购自西班牙雅雷萨INGENASA公司。骨髓瘤细胞SP2/0系为本实验室保存，Vero细胞为本实验室保存；Trizol购自Thermo公司，One step RNA RT-PCR Kit和rTaq购自TaKaRa公司，其他化学试剂均为分析纯。HRP Conjugation Kit购自abcam公司。
Figure BDA0002673340070000091
-T1 Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司。
SPF级6～8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SPF仔猪购自北京市SPF猪育种管理中心；IgG亚类鉴定试剂盒为美国Sigma公司产品。
2.非洲猪瘟B646L抗原的获得与纯化
2.1引物设计
根据GenBank公布的B646L基因的参考序列利用Primer5.0软件设计了一对PCR扩增引物，并分别在上下游引物中引入了EcoRI和BamHI酶切位点，命名为B646L-U、B646L-L。
B646L-U：
5’-CGCGAATTCATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATG-3’(SEQ ID NO:3)
B646L-L：
5’-ATAGGATTCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTAG-3’(SEQ ID NO:4)
扩增产物长度为1527bp，上述引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
2.2重组表达质粒的构建及B646L抗原的原核表达与纯化
按照常规方法获得重组质粒pET30a-B646L，把重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落于含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃、225r/min摇床培养至对数生长期(OD600＝0.6～1.0)时，加入IPTG转入16℃，过夜诱导表达目的蛋白。表达的重组B646L抗原采用Ni-NTA琼脂糖树脂常规的纯化方法进行纯化，最后用250mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，并用10ku超滤管浓缩洗脱液，将蛋白换液至PBS中，取10μL蛋白溶液进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE电泳结果(图1)显示，纯化后的目的蛋白大小为52kD，纯化后的蛋白呈单一条带，说明蛋白纯度较高。同时以BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度为2mg/mL，将B646L抗原分装后，-80℃保存备用。
3.针对B646L抗原的单克隆抗体的制备与测序
3.1多肽的分析合成与小鼠免疫
利用在线抗原表位分析工具ABCpred Prediction(https://webs.iiitd.edu.in/ raghava/abcpred/)、Scratch(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)、IEDB(http://tools.immuneepitope.org/main/)等分析B646L基因的氨基酸序列，筛选出10条B细胞抗原表位如下：
表3人工合成多肽序列
编号 序列 位置 打分
1. RRNIRFKPWFIPGVIN(SEQ ID NO:19) 388-403 0.9
2. ALWIKLRFWFNENVNL(SEQ ID NO:20) 328-343 0.9
3. FVTPEIHNLFVKRVRF(SEQ ID NO:21) 418-433 0.88
4. RFIAGRPSRRNIRFKP(SEQ ID NO:22) 380-395 0.86
5. PGVINEISLTNNELYI(SEQ ID NO:23) 399-414 0.82
6. QVTHTNNNHHDEKLMS(SEQ ID NO:24) 442-457 0.81
7. SVSIPFGERFITIKLA(SEQ ID NO:25) 347-362 0.79
8. MSALKWPIEYMFIGLK(SEQ ID NO:26) 456-471 0.78
9. ERFITIKLASQKDLVN(SEQ ID NO:27) 354-369 0.70
10. SLTNNELYINNLFVTP(SEQ ID NO:28) 406-421 0.65
上述10条多肽由北京擎科生物科技有限公司人工合成，用PBS稀释至1mg/mL，按照软件对多肽的打分情况设置一定的比例(打分高的比例大，打分低的比例低)混合后作为免疫原，按照常规方法免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照常规方法融合。
3.2间接ELISA检测方法的建立
采用方阵滴定法确定间接ELISA所用包被抗原和抗体的最适工作浓度。将纯化的B646L原核表达抗原稀释至1mg/mL后，用包被缓冲液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液)分别作1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200和1:1400稀释，然后每孔100μL抗原稀释液包被ELISA板，4℃过夜，BALB/c小鼠阳性血清和阴性血清均分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍比稀释，同时设立sp2/0细胞培养上清及空白对照，选择OD450值在1.0左右，P/N比值最大的抗原稀释浓度为最适工作浓度。结果显示，抗原的最佳稀释度为1:1000(蛋白终浓度为1μg/mL)。
3.3抗B646L抗原的单克隆抗体(m Ab)杂交瘤细胞株的建立
以原核表达的B646L抗原为包被抗原，采用建立的间接ELISA方法检测融合细胞上清中的特异性抗体。选择抗体效价高，呈单个克隆生长，细胞状态良好的细胞进行亚克隆培养，直至抗体分泌稳定，阳性孔的比例大于95％时，进行扩大培养。
3.4腹水的制备及效价测定
通过间接ELISA方法共筛选得到3株单克隆抗体细胞，选择其中一株效价最高的杂交瘤细胞T-2扩大培养，常规处理后腹腔注射经不完全弗氏佐剂处理的Balb/c小鼠制备腹水，应用间接ELISA方法测定腹水的效价可以达到1:106。采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水中的mAb。以灭活细胞毒进行SDS-PAGE检测，以T2作为一抗，以羊抗鼠HRP作为二抗，采用WesternBlot测定mAb的反应原性。Western blot结果(图2)表明，T-2与ASFV之间存在反应原性。
3.5 T-2单克隆抗体的稳定性鉴定
应用间接ELISA对筛选到的T-2杂交瘤细胞第10代、第20代、第30代、第40代和第50代培养上清的效价进行测定，确定杂交瘤细胞的稳定性。结果显示，T-2杂交瘤细胞能稳定分泌单抗，且效价基本保持在同一水平。
3.6单克隆抗体的亚型鉴定
应用Sigma公司的亚类鉴定试剂盒鉴定单抗腹水的IgG亚类，具体操作按照试剂盒说明书进行。经亚型鉴定，T-2单克隆抗体的亚类为IgG2b型。
3.7单克隆抗体序列的测定
3.7.1杂交瘤细胞RNA的提取
T-2杂交瘤细胞长至单层时，弃掉培养液并使用3mL无菌PBS吹打并计数，收集1×106个细胞至1.5mL离心管中，800r/min离心5min，弃上清后以RNA提取试剂盒按照说明书操作步骤提取杂交瘤细胞的RNA。
3.7.2杂交瘤细胞提取RNA的RT-PCR扩增与鉴定
设计简并引物14条(其中VH-F 4条，VH-R 2条，VL-F 6条，VL-R 2条)，总计20对。
表4单克隆抗体重链和轻链RT-PCR扩增引物
Figure BDA0002673340070000121
Figure BDA0002673340070000131
注：R＝A/G，S＝C/G，Y＝C/T，M＝C/A，K＝T/G，H＝A/T，D＝G/T/A
以提取的RNA为模板，引物见表4，反应体系50μL(10×One Step RNA PCR Buffer5μL，MgCl2(25mM)10μL，dNTP Mixture(10mM)10μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，AMVRTase XL(5U/μL)1μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL，F等量混合引物1.5μL，R等量混合引物1.5μL，模板4μL，ddH2O 15μL)，反应程序(50℃反转录30min，94℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增35个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察RT-PCR扩增结果，鉴定后选取合适引物对VH和VL进行大量扩增(本步骤重复两次)。使用2％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，然后使用胶回收试剂盒回收VH和VL目的基因。
3.7.3 VH和VL的连接转化与鉴定
将回收纯化的VH和VL目的基因与
Figure BDA0002673340070000133
-T1连接，反应体系如下：1μL
Figure BDA0002673340070000132
-T1，4μL回收纯化的PCR产物。室温反应30min。
取Trans 5α感受态细胞各50μL于冰上融化后，加入连接产物混匀，冰浴30min，于42℃水浴热激45s，再冰浴2-3min。加入600μL的LB液体培养基，37℃220r/min摇床复苏培养60min后，取100μL菌液均匀涂布于LB固体培养基(AMP抗性)，于37℃温箱中培养12-15h，观察转化单菌落的出现。挑取4-6个单菌落于1.5mL离心管(600μL的AMP抗性LB液体培养基)，于37℃220r/min摇床中培养，并设立对照。
37℃培养4小时后，每个离心管取2.0μL菌液进行菌液PCR鉴定，反应体系20μL(rTaq酶(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5mM)2.0μL，M13-F(10μM)1.0μL，M13-R(10μM)1.0μL，菌液2.0μL，ddH2O 9.8μL)，反应程序(95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果，选取阳性克隆菌液送至测序。
选择T-2单克隆抗体轻、重链基因克隆经鉴定后的3个阳性克隆为测序样品，获得抗体可变区核苷酸序列，使用DNAStar和IgBLAST软件进行比对，结果显示：3个轻链可变区基因均长321bp，编码107个氨基酸；3个重链可变区基因序列均长336bp，编码112个氨基酸。重链可变区具有如下面SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATEWSFGVPTSDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCATEGPFMSQVGTLVTVSA。
轻链可变区具有如下面SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKYSLLLVYNAKSLAEGVPSRFSGSGAGTQFSLKISSLQTEDFGSYYCQHHYGTPYTFGGGPKLEIK。
4.ASFV B646L单抗竞争ELISA方法的建立
4.1试剂配制
(1)包被液：0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
(2)洗涤液：pH7.4、0.1M PBS，0.05％Tween-20。
(3)封闭液：以洗涤液配制5％BSA溶液。
(4)稀释液：即为封闭液。
(5)TMB：A液：0.02％H2O2，用pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠溶液稀释；
B液：0.4‰TMB-HCl，用50mM、pH2.8的柠檬酸钠溶液溶解。
分别取50μL A液、B液混合避光保存，备用。(也可以用商品化的TMB显色液)
(6)终止液：2M H2SO4溶液。
4.2 ASFV B646L包被抗原的制备
4.2.1基因合成及Bacmid提取
委托北京擎科生物科技有限公司人工合成B646L和B602L基因序列(GenBank：MK333180.1)，并构建至pCDN4.1载体上。
4.2.2将B646L和B602L基因的两质粒共转染293F细胞
1)预先准备好生长状态良好的293F细胞接种于6孔板，并加入2ml不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达70～80％。
2)将10μg DNA(B646L和B602L质粒1：1)稀释于500μL无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将20μLfreestyle稀释于500μL无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5min；5min后将上述两种混合液混合，轻轻混匀，室温孵育20min；(总时间不能超过25min)。
3)吸弃培养皿中的培养液，每皿加入700μL无血清无抗生素培养液；将复合物加入培养皿，前后摇动培养皿使其分布均匀，37℃培养箱内孵育4～6h后，弃掉培养液，加入新鲜10mL含有10％FBS的293F细胞培养液，继续培养72h。
4.2.3收集表达蛋白
收集表达蛋白的293F细胞，添加20mM hepes buffer，pH7.4，300mM的NaCl溶液和PMSF蛋白酶抑制剂，冰上超声3min。16000rpm，4℃离心20min，取上清与his-NTA beads结合1h；采用20mM咪唑的buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.5)洗脱杂蛋白，用200mM咪唑(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，200mM咪唑，pH7.5)洗脱目标蛋白。用10KD超滤浓缩管浓缩目的蛋白，取适量样品进行SDS-PAGE检测，纯度达到要求后，测定蛋白浓度，该蛋白即为本试剂盒的抗原，分装后-80℃保存备用。
4.3标准ASFV阳性血清及标准ASFV阴性血清的制备
为减少ELISA试剂盒实际检测过程中不同操作人员和不同检测批次间的误差，本发明制备了标准ASFV抗体阳性对照血清和标准ASFV抗体阴性对照血清，用于检测方法的优化和结果判定标准的确定。
4.3.1标准阳性血清的制备
选择6周龄SPF仔猪，用碘酒消毒注射部位皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)5ml与等量纯化后的真核表达B646L抗原(2mg/mL)进行乳化，采用肌肉注射的方式对仔猪进行多点免疫。间隔10-14天后，进行第二次免疫，吸取8ml弗氏不完全佐剂与等量纯化后的真核表达B646L抗原乳化后，以同样的方式多点肌肉注射免疫仔猪。间隔7-10天后，前腔静脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，抗体效价可达到1:100以上时，心脏采血，分离到的血清即为阳性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐，0.5ml分装后，-20℃保存备用。
4.3.2标准阴性血清的制备
取经检验合格的SPF猪，心脏采血，分离的血清即为阴性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分装于无菌管中，-20℃保存备用。
4.4酶标抗体的制备及抗原最佳包被浓度和待检样品最佳稀释度的确定
采用abcam公司的HRP conjugation Kit，按照试剂盒操作步骤对纯化的B646L单抗T-2进行HRP标记，获得所需酶标抗体。按照棋盘滴定法，将B646L真核表达抗原分别以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的包被浓度每孔100μL抗原包被液，4℃过夜，次日倒掉包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，每孔加入200μL洗涤液配制的5％BSA溶液，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次，将标准阴、阳性血清进行倍比稀释，从0、1:2稀释至1:32，自上而下分别加入96孔酶标微孔板中，每孔50μL，同时每孔加入相同体积1:10000稀释的酶标抗体，震荡混匀后，37℃孵育30min；洗涤液洗涤5次，拍干；每孔加入100μL TMB显色液，室温显色15min；每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪在450nm读数。根据P/N值选择最佳抗原包被浓度和最佳酶标抗体稀释度。
结果显示，当抗原包被浓度为1μg/mL，血清稀释度为1:2时，P/N值最大，且在10以上，因此确定抗原最佳包被浓度为1μg/mL，样品的最佳稀释度为1:2。
4.5酶标抗体最佳稀释度的优化
方法同4.4，将酶标抗体进行稀释1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000。以标准阴、阳性血清按照确定的最佳抗原包被浓度和最佳待检样品稀释度，在其他条件相同的情况下进行最佳酶标抗体稀释度的优化实验，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算P/N值，根据P/N值确定酶标抗体的最佳稀释度为1:20000。
4.6最佳封闭液的确定
方法同上，分别使用10％牛血清、5％BSA、5％脱脂奶粉、1％明胶作为封闭液于37℃封闭1h，其他条件按照已确定的最佳条件进行试验，检测待检血清样品，计算各已知背景待检血清的抑制率(PI)，根据PI值确定最佳封闭液为5％BSA于37℃封闭1h。
Figure BDA0002673340070000171
4.7最佳显色时间的确定
按照上述确定的最佳反应条件进行试验，加入TMB显色溶液后，室温分别避光显色5min、10min、15min和20min，其他条件不变的情况下，检测各种待检血清，根据各已知背景血清的抑制率(PI)确定TMB最佳作用时间为室温作用15min。
4.8竞争ELISA方法阴阳性血清判定标准的确定
c-ELISA阴阳性血清界限的确定将已知阳性血清(来源于意大利撒丁岛动物卫生研究所和波兰国家兽医研究所)和非疫区种猪的血清作为已知阴性血清，使用所建立的单抗c-ELISA方法对已知的50份阳性血清和200份阴性血清分别检测3次，计算各血清样品的抑制率。
检测结果显示，50份阳性血清的PI％值均大于50％，200份阴性血清的PI％值均小于40％。因此，确定本研究所建立的单抗c-ELISA阴阳性血清样品的判定标准为：血清PI≥50％时，可判定为阳性；血清PI≤40％时，可判定为阴性；血清PI范围为40％＜PI＜50％时，可判定为可疑。
4.9重复性检测
根据批内和批间的变异系数来评价c-ELISA方法的稳定性。批内误差：使用同一批次包被的酶标板对10份血清做检测，每份血清设置3个重复，计算其变异系数表示批内误差。批间误差：取3次不同时间包被的酶标板，同时对10份血清进行检测，每个样品设置两个重复孔，计算其批间变异系数表示批间误差。
批内重复实验和批间重复实验结果显示，批内变异系数及批间变异系数均小于10％，由此判断本发明单抗c-ELISA方法具有较好稳定性和可重复性。
4.10单抗c-ELISA的特异性评价
按照前面确定的c-ELISA操作程序，分别检测ASFV标准阳性血清、pcv3阳性血清、蓝耳病阳性血清、塞内卡阳性血清、伪狂犬阳性血清，根据显色结果和公式计算抑制率，由抑制率的高低来评价单抗c-ELISA的特异性。
检测结果显示pcv3阳性血清、蓝耳病阳性血清、塞内卡阳性血清、伪狂犬阳性血清的PI％值均低于50％，ASFV标准阳性血清和ASFV阳性血清的PI％都高于50％(表5)。由此可以判定T-2单抗竞争性ELISA方法能够将猪的几种常见病与ASFV相区分。
表5单抗c-ELISA特异性检测结果
血清种类 抑制率(PI％)
ASFV标准阳性血清 100
pcv3阳性血清 9.32
蓝耳病阳性血清 9.69
塞内卡阳性血清 10.56
伪狂犬阳性血清 9.23
ASFV标准阴性血清 0
4.11临床样品的检测
使用优化后的c-ELISA反应条件，对疫区15份灭活猪阳性血清和非疫区美国进口的100份猪阴性血清进行检测，并与标准c-ELISA试剂盒检测结果进行比较。
两试剂盒的检测结果见表6和表7，阴性样品的检测结果一致，但是弱阳性样品本研究所研发的试剂盒可以检出，而进口商品化试剂盒未检出，并且本研究的试剂盒从检测数值上看对阴阳性区分的更明显，相较于商品化试剂盒在弱阳性样品的检测上更具有优势。
表6 c-ELISA与进口试剂盒阳性样品检测结果
Figure BDA0002673340070000191
Figure BDA0002673340070000201
表7 c-ELISA与进口试剂盒阴性样品检测结果
Figure BDA0002673340070000202
4.12酶标板的制备
将B646L真核表达抗原用包被液按最佳包被浓度(1μg/mL)稀释，每孔100μL加入96孔酶标微孔板中，4℃过夜；次日倒掉孔中液体，洗涤液洗涤3次，最后一次拍干，然后每孔加入200μL封闭液(5％BSA)，37℃封闭1h。洗涤液洗涤3次，干燥，真空包装。
4.13 ASFVc-ELISA检测试剂盒的操作步骤
4.13.1将待检样品用样品稀释液1:2稀释，每孔加入50μL稀释后的待检血清，再加入50μL 1:20000稀释的酶标单抗，同时设置标准阴性、阳性对照，37℃孵育30min，洗涤液洗涤5次后每孔加入100μL TMB底物显色液，室温显色15min，2mol/L H2SO4 50μL/孔终止显色，测定OD450nm值并根据公式计算血清抑制率。
4.13.2结果判定：当被检血清的PI≥50％时，可判定为阳性；当被检血清PI≤40％时，可判定为阴性；当被检血清的PI范围为40％＜PI＜50％时，可判定为可疑。
Figure BDA0002673340070000221
Figure BDA0002673340070000231
Figure BDA0002673340070000241
Figure BDA0002673340070000251
Figure BDA0002673340070000261
Figure BDA0002673340070000271
Figure BDA0002673340070000281
Figure BDA0002673340070000291
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种能与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的单克隆抗体及其应用
<130> RYP2010595.2
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠单克隆抗体T-2的重链可变区()
<400> 1
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Glu Trp Ser Phe Gly Val Pro Thr Ser Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr
85 90 95
Glu Gly Pro Phe Met Ser Gln Val Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠单克隆抗体T-2的轻链可变区()
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Tyr Ser Leu Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> B646L-U
<400> 3
cgcgaattca tggcatcagg aggagctttt tgtcttattg ctaacgatg 49
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> B646L-L
<400> 4
ataggattcc tgaaagctta tctctgcgtg gtgagtag 38
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> mVL-F1
<400> 5
atggagacag actcctgcta t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> mVL-F2
<400> 6
atggattttc aggtgttttc ag 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> mVL-F3
<400> 7
atgragtcac akacggtctt yrta 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> mVL-F4
<400> 8
atgaggkccc hgctytyctk ggr 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> mVL-F5
<400> 9
atgaagttgc ctgtgctgtt g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> mVL-F6
<400> 10
atgatgagtc ctgccttcc 19
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> mVL-R1
<400> 11
actggatggt gggagga 17
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> VL-R2
<400> 12
cccaagctta cttgggaaga tgga 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> mVH-F1
<400> 13
atggratgsa gctgmatsct ctt 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> mVH-F2
<400> 14
atgracttcg ggyctkggtt tt 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> mVH-F3
<400> 15
atggctgtct tggggctctt ct 22
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> mVH-F4
<400> 16
atggrcagta chtyy 15
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> mVH-R1
<400> 17
ayctccacac rccagtggat agac 24
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> VH-R2
<400> 18
cccaagcttr ccarkggatr a 21
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 19
Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 20
Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 21
Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 22
Arg Phe Ile Ala Gly Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 23
Pro Gly Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile
1 5 10 15
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 24
Gln Val Thr His Thr Asn Asn Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 25
Ser Val Ser Ile Pro Phe Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 26
Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 27
Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val Asn
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 28
Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val Thr Pro
1 5 10 15

Claims (14)

1.能特异性与阳性血清竞争结合非洲猪瘟病毒B646L抗原的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白为抗体或活性片段。
3.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
4.根据权利要求3所述的抗原结合蛋白，其中，所述抗体为鼠单克隆抗体。
5.非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为抗体或活性片段。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述抗体为鼠单克隆抗体。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述抗体或活性片段为经标记物标记的抗体或活性片段。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述标记物选自酶、荧光基团和化学发光基团。
9.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被ASFV B646L抗原的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述B646L抗原的包被量为0.1-8μg/mL；所述酶标的鼠单克隆抗体使用时进行1:(2000-40000)的体积稀释。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述B646L抗原经真核表达获得。
12.权利要求1-4中任一项的抗原结合蛋白，或权利要求5-11中任一项所述的试剂盒在样品中检测非洲猪瘟病毒的应用，所述应用为非诊断目的。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述样品为血清样品或血液样品。
14.利用权利要求1-4中任一项的抗原结合蛋白，或权利要求5-11中任一项所述的试剂盒体外检测样品中非洲猪瘟病毒的方法，所述方法为非诊断目的，所述样品为血清样品或血液样品；
其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将待检样品加入到酶标微孔板中；(2)在酶标微孔板中加入用稀释液稀释的经酶标的权利要求1的抗原结合蛋白，权利要求2或3的抗体或活性片段并孵育；(3)显色后测定OD450nm值并计算PI值；以及(4)当被检血清的PI≥50％时，判定为阳性；当被检样品PI≤40％时，判定为阴性；当被检样品40％＜PI＜50％，判定为可疑。
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