CN114527273A - 一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法，涉及疫苗检测技术领域，包括以下步骤：以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品抗原组分的相对含量，计算相对效力RP值，RP值≥1.0为合格品。采用本发明ELISA方法进行相对效力的检测，与免疫攻毒法检测结果一致，而检测时间只需要1～2天，相比于免疫攻毒法极大地缩短了检测周期，还不使用靶动物，节约了检测成本，而且不需要P3实验室条件，不具有生物安全风险。因此，对于市场潜力巨大的猪瘟亚单位疫苗的成品检验而言，具有非常好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗检测技术领域，更具体的说是涉及一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法。
背景技术
猪瘟(slassical swine fever，CFS)以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局列为A类动物传染病。目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。分子生物学技术的兴起和发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础。亚单位疫苗和活载体疫苗是目前研究的热点。
猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗属于灭活疫苗，无法像猪瘟活疫苗一样，可以通过检测成品中猪瘟活病毒的病毒含量进行成品效力评价，往往需要利用靶动物免疫接种－攻毒或通过测定中和抗体的方法进行成品效力评价。免疫攻毒试验整个周期约50天，而且因用到了猪瘟强毒，还需要用P3动物舍进行；中和抗体测定法尽管不需要攻毒，但需要给猪免疫后采血测定，试验也需30天左右。以上两种采用靶动物的方法不仅具有检测周期长，检测成本高的不足，且免疫攻毒还会带来生物安全风险。
因此，建立一种简单可行的不使用猪甚至替代动物、或其它方法用于猪瘟灭活疫苗的成品效力检验方法，以解决目前方法中存在的检测周期长、使用猪造成检测成本高以及免疫攻毒带来的生物安全风险等问题，在目前猪瘟亚单位疫苗生产中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，该方法以参考疫苗为参照，采用ELISA方法检测待测品疫苗的相对效力，从而确定待测品疫苗的效力是否合格，本发明方法无需用猪或其他动物进行效力的检验，从而缩短检测周期，减少检测成本，并降低检验带来的生物安全风险。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，包括以下步骤：
以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品中抗原组分的相对含量，计算相对效力RP值，RP值≥1.0为合格品。
作为本发明优选的技术方案，所述参考品疫苗的制备方法包括：根据免疫原性研究的结果确定参考品中的抗原添加量，据此添加量制备成待检参考品疫苗，并经免疫攻毒保护试验检验合格，确定为参考品疫苗。
更优选的，所述抗原添加量为在免疫原性研究中经免疫攻毒保护试验确定的抗原最低添加量。
作为本发明优选的技术方案，所述以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品中抗原组分的相对含量。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用ELISA方法检测猪瘟基因工程亚单位疫苗效力的方法。采用本发明ELISA方法进行相对效力的检测，与免疫攻毒法检测结果一致，而检测时间只需要1～2天，相比于免疫攻毒法极大地缩短了检测周期，节约了检测成本，还不使用靶动物进行攻毒试验，不需要P3实验室条件，不具有生物安全风险。因此，对于市场潜在大量猪瘟亚单位疫苗的检测而言，具有非常好的应用价值。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，包括以下步骤：
以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品中抗原组分的相对含量，计算相对效力RP值，RP值≥1.0为合格品。
作为本发明优选的技术方案，所述参考品疫苗的制备方法包括：根据免疫原性研究的结果确定参考品中的抗原添加量，据此添加量制备成待检参考品疫苗，并经免疫攻毒保护试验检验合格，确定为参考品疫苗。
更优选的，所述抗原添加量为在免疫原性研究中经免疫攻毒保护试验确定的抗原最低添加量。
作为本发明优选的技术方案，所述以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品抗原组分的相对含量。
作为本发明优选的技术方案，所述以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品抗原组分的相对含量包括：(1)将参考品疫苗和待测品以1:4稀释后，再进行倍比稀释，加入反应板中，孵育；同时设置安慰剂最为空白对照；(2)封闭反应板；(3)取出反应板，洗板后，加入阳性血清，孵育；(4)取出反应板，洗板后，加入酶标二抗，孵育；(5)取出反应板，洗板后，加入底物反应5分钟后终止，测定OD450nm值，并计算相对含量。
实施例1
制备参考品疫苗
1、制备
量取猪瘟E2抗原(批号20180409，E2蛋白含量为200μg/ml)240ml，补充PBS至2000ml，加入PGA佐剂(PGA佐剂：水相＝1：5体积比)，充分搅拌混匀，以10ml/支的规格进行分装，得待检参考品疫苗。置于2～8℃条件保存。
2、检验
对待检参考品疫苗的性状、无菌检验、安全性进行检验，性状、无菌检验方法依据现行中国兽药典标准，安全检验按表1方法进行，检验结果见表1。
对待检参考品疫苗的效力进行检验，方法为：
选取28～35日龄健康易感仔猪(猪瘟病毒中和抗体效价不高于1:2)5头，颈部肌肉注射待检参考品疫苗1.0ml/头。一免后21日，以相同剂量、相同途径进行二免。二免后21日，各颈部肌肉注射猪瘟石门系血毒1ml(不低于105最小致死量)，连续观察16日(同时设置对照猪5头，每次注射生理盐水1ml/头)，检验结果见表1。
表1参考品疫苗检测结果
3、分装
将检验合格的参考品疫苗以1.5ml/支的装量分装，批号为E2-Ref201905，冻存于－70℃条件下备用。
实施例2
ELISA法检测待测品的相对含量，计算相对效力RP值，以间接ELISA为例，但不限于间接ELISA法。
1、样品准备
参考品疫苗为实施例1所得批号为E2-Ref201905的参考品疫苗。
待测品为201901(待测品1)、201902(待测品2)、201903(待测品3)三个批次的猪瘟E2抗原亚单位疫苗。
2、ELISA检测待测品的相对效力
(1)抗原包被将经适当工艺处理后的参考品、待检品和安慰剂(用培养基代替抗原制成的疫苗)分别以1:4比例进行稀释后，按照如下方式稀释后加入反应板中，50μl/孔，置37～38℃过夜孵育(16～24小时)。
表2ELISA反应板样品排列示意
(2)封闭取出反应板，PBST洗板3次，每孔加入5％脱脂乳溶液250μl，置室温(20～25℃)作用60～75分钟。
(3)加入阳性血清取出反应板，弃去孔内脱脂乳溶液，PBST洗板3次，加入1：200稀释的的阳性血清，100μl/孔，孵育45±5分钟。注意E1-H1及E2-H2作为检测空白孔，不加阳性血清，只加入5％脱脂乳溶液。
(4)加入酶标二抗取出反应板，弃去孔内液体，用PBST洗板5次，加入1：1000稀释倍数的羊抗兔IgG二抗，100μl/孔。置37℃培养箱孵育20±5分钟。
(5)加入底物及读板取出反应板，弃液，用PBST洗板10次，加入反应底物，100μl/孔。反应5分钟后加入终止液，100μl/孔。在450nm波长进行读板，记录OD450值。E1-H1及E2-H2孔为空白孔，整块反应板的实际值为所有孔的读数OD值会减去空白孔的平均值(见表3-a、3-b、3-c)。
表3-a 201901批疫苗间接ELISA检测OD450nm值
表3-b 201902批疫苗间接ELISA检测OD450nm值
表3-c 201903批疫苗间接ELISA检测OD450nm值
(6)检验有效的标准
安慰剂(A1至D1以及A2至D2)OD450平均值减去空白孔(E1至H1和E2至H2)空白孔平均值)应＜0.150；参考品最高浓度孔(A3-A7)OD450平均值减去空白孔(E1至H1和E2至H2)平均值应为0.600～2.600；参考品最高浓度孔(A3-A7)OD450平均值除以安慰剂样品孔(A1-D1和A2-D2)的OD450平均值，应≥10。
(7)相对效力的计算
使用软件SoftMax Pro(SMP)进行评估和计算相对效力。当待检疫苗OD450值曲线应与参考疫苗的OD450值曲线呈现平行，且RP值应≥1.0。
本实施例经软件计算，待测品1RP＝1.413，待测品2RP＝2.115，待测品3RP＝3.565，均判定为合格。
(8)免疫攻毒法检验亚单位疫苗效力的结果
选取28～35日龄健康易感仔猪(猪瘟病毒中和抗体效价不高于1:2)20头，随机平均分为4组(3个试验组一个对照组)，试验组依次颈部肌肉注射201901(待测品1)、201902(待测品2)、201903(待测品3)三批亚单位疫苗1.0ml/头，对照组给予生理盐水1.0ml/头。一免后21日，以相同剂量、相同途径进行二免。二免后21日，连同对照组，各颈部肌肉注射猪瘟石门系血毒1ml(不低于105最小致死量)。连续观察16日。读取结果见表4.
表4
由表4结果可知，经计算，三个待测品的相对效力值≥1.0，符合标准。经免疫攻毒试验进行效力检测的结果也表明，三个待测品免疫效力合格。两种检测方法结果一致。但相对于免疫攻毒法进行效力检测而言，采用本发明ELISA方法进行相对效力的检测，检测时间只需要1～2天，相比于免疫攻毒法极大地缩短了检测周期，并且不需要P3实验室条件，节约了检测成本，不具有生物安全风险。因此，对于市场潜力巨大的猪瘟亚单位疫苗的成品效力检测而言，具有非常好的应用价值。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品中抗原组分的相对含量，计算相对效力RP值，RP值≥1.0为合格品。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，其特征在于，所述参考品疫苗的制备方法包括：根据免疫原性研究的结果确定参考品中的抗原添加量，据此添加量制备成待检参考品疫苗，并经免疫攻毒保护试验检验合格，确定为参考品疫苗。
3.根据权利要求2所述的一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，其特征在于，所述抗原添加量为在免疫原性研究中经免疫攻毒保护试验确定的抗原最低添加量。
4.根据权利要求1所述的一种猪瘟基因工程亚单位疫苗成品效力检验方法，其特征在于，所述以参考品疫苗为基准，利用ELISA方法检测待测品中抗原组分的相对含量。
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