CN103505724A - 猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原，其中二种抗原之间配合良好、免疫效果优异、甚至二种抗原可以相互促进。本发明预防猪瘟和猪伪狂犬病的二联疫苗，制备方法简单，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗，且安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应。此外，本发明还提供了采用间接免疫荧光方法测定二联疫苗中的猪瘟效力的一种简便的检验方法，保证了各批次二联活疫苗的质量，经济效益明显增加。

Description

猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，特别是指一种使用特定比例配合的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗。 

背景技术

猪瘟(Classical Swine fever，简称CSF)，又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型猪瘟(European swine fever)，是一种猪只急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只，一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪只危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是多种动物共患的传染病，引起家畜和野生动物急性致死性的传染病，以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状，猪是其自然易感宿主，主要引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，仔猪感染主要是神经症状，成年猪则以隐性感染为主，该病已成为种猪繁殖障碍综合症的主要病因。 

免疫接种是猪瘟和猪伪狂犬病防制的重要措施，但目前市场上仅有猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗单苗，为有效预防猪瘟和猪伪狂犬病的发生，需单独免疫上述两种活疫苗。单独免疫猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗存在繁琐、费时、费力、增加成本等问题，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。 

台湾大学赖秀穗做了大量猪瘟兔化弱毒疫苗超前免疫试验，取得了免疫的成功并推广使用。但同时指出，PR可干扰CSF抗体的产生，这种干扰现象是由于PR病毒破坏免疫系统引起的(《家畜传 染病学》【M】北京：农业出版社，1989.428)。1996年，费流芳等(《发生伪狂犬病猪场的猪瘟与伪狂犬病免疫试验》，[J].中国兽医杂志，1996，22(7)：9-10)在发生伪狂犬病的猪场做了猪瘟和伪狂犬的免疫相关试验，也得出了猪场发生PR后，免疫猪瘟疫苗后猪群产生的猪瘟(CSF)抗体整体水平很低的结论。2004年，宁宜宝等做了PPV、PRV、PRRSV 3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响的试验，结果表明猪场中PPV、PRV、PRRSV非猪瘟病毒的感染可直接干扰猪瘟疫苗的免疫效力，导致猪瘟野毒感染后在免疫猪体内滞留、种猪长期带毒排毒，造成CSFV持续感染(《3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响》，[J].2004，24(2)：112-114)。中国专利CN 101690808A虽然也尝试使用猪瘟、伪狂犬病二联疫苗，但所述二联疫苗至少需要每头份含CSF病毒大于500,000个家兔感染量，PRV大于10⁸TCID₅₀，需要制备大量的高滴度病毒液，其商业利用可能性很小，而且对该二联疫苗的对猪攻毒的免疫效果和PR的毒种来源并没有描述。硕士论文《猪瘟和猪伪狂犬病二联苗免疫干扰现象的研究》(贺卫洁，2010年)也发现了PR对CSF抗原的抑制作用，不仅干扰CSF的前期抗体，而且二联苗的免疫峰值也比单苗的低。作者虽然也配制了一种猪瘟和猪伪狂犬病二联苗，但为了克服二种抗原之间的干扰，还需要加入转移因子，其本身有一定的副作用，不利于在生产实践中应用。因此，虽然一直以来人们希望获得安全可靠、免疫效果良好的猪瘟和猪伪狂犬病二联苗，但由于二种抗原之间的干扰，至今还未能见到符合要求、适合工业化生产的猪瘟和猪伪狂犬病二联疫苗。 

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，其中二种抗原之间具有适合的形式和比例，以获得抗原配合良好、免疫效果优异、甚至二种抗原可以相互促进的二联疫苗，简言之，本发明的主要目的在于提供一种相对于单苗而言，提高免疫效果的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗。 

技术方案

优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，为包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原的二联疫苗。 

优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟活病毒、改良/嵌合的猪瘟活病毒、至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒，至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分的一种或任意几种的组合。更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；更优选地，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2亚单位抗原。 

优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，至少含有猪伪狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒、猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。优选地，所述的猪伪狂犬病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏编号V200002)、Ea株(CGMCC，保藏编号N0.0907)、WKQ-001株(CCTCC，保藏号V200511)或伪狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha-K61株、Bucharest株、BUK株、H株(GCMCC，保藏号为No.5013)和C株(CCTCC，保藏编号V201114)的一种或任意几种的组合。 

优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株，所述的猪瘟兔化弱毒株的含量为≥3.0×10^3.0TCID₅₀/头份，优选地为0.6～1.5×10^4.0TCID₅₀/头份，更优选的为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份；所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量为≥5.0×10^5.0TCID₅₀/头份，优选地为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。 

更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，还包括冻干保护剂。 

优选地，本发明所述的冻干保护剂，可以是乳糖、脱脂牛奶、明 胶、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸钠中一种或几种。 

优选的，本发明所述的冻干保护剂是乳糖和脱脂牛奶。 

优选的，本发明所述的冻干保护剂所含的乳糖的浓度为5％(W/V)，所含脱脂牛奶的浓度为10％(W/V)。 

本发明的另一目的在于提供上述猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法，包括以下步骤：分别培养猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，获得猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，优选的比例为1∶1(V/V)，如使得猪瘟病毒液的含量为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份，制备成二联疫苗。 

更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中，可以使用猪瘟E2蛋白代替培养猪瘟病毒液的步骤，并将猪瘟E2蛋白与培养的猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，优选的比例为3∶1(V/V)，如使得猪瘟E2蛋白的含量为50μg/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份，制备成二联疫苗。 

更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中，还包括加入冻干保护剂的步骤。 

本发明的又一目的在于提供猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的效力检验方法，所述方法采用间接免疫荧光方法，包括以下步骤：将病毒接种于细胞，待细胞长至单层后用丙酮溶液固定，然后加入一抗和二抗，最后根据荧光数计算疫苗效价。 

优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的细胞优选传代细胞，更优选ST传代细胞。 

优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的固定用丙酮溶液优选80％浓度。 

优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的一抗优选猪抗猪瘟病毒血清。 

优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的二抗优 选兔抗猪IgG(IgG-FITC)。 

由上可以看出，本发明的二联疫苗提供了在治疗和预防猪瘟和猪伪狂犬病的疫苗中应用。 

技术效果

本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗至少有以下优点： 

1、本发明猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗能有效解决猪瘟疫苗前期效价不高的问题。 

2、本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟、猪伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用，优于现有技术中免疫接种的猪瘟和猪伪狂犬病活疫苗。 

3、猪瘟和猪伪狂犬病均为免疫抑制病，免疫剂量不合理会引起相互干扰，且容易造成漏种，直接影响预防效果。用本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，达到了“一针防两病”。 

因此，本发明预防猪瘟和猪伪狂犬病的二联疫苗，制备方法简单，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。而且，发明人通过优化猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的配苗比例，制备的二联疫苗与单苗免疫仔猪的安全性和效力比较显示，本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗，且安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应。此外，申请人通过采用间接免疫荧光方法测定二联疫苗中的猪瘟效力，简化了检验方法，保证了各批次二联活疫苗的质量，经济效益明显增加。 

附图说明

图1为猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备工艺图； 

图2为重组CSFV E2基因PCR扩增结果图； 

图3为间接免疫荧光法鉴定重组蛋白在昆虫细胞中的表达图； 

图4为Westernblot进行鉴定重组蛋白的表达图。 

图5为猪瘟E2蛋白免疫仔猪后的抗体情况。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗的制备 

1.猪瘟、猪伪狂犬病毒抗原的制备 

1.1生产用毒种的制备 

猪瘟兔化弱毒株的制备：将猪瘟兔化弱毒株(购自中国兽医药品监察所，保藏号为AV1412)用病毒稀释液(无血清的DMEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M.O.I)为0.1接种于ST细胞单层(购自CCTCC，编号GDC0060)培养，37℃吸附30min，加入含3％(v/v)犊牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养3～5日，冻融2～3次，收获病毒，病毒效价≥10^6.5TCID₅₀/ml。 

猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)的制备：将猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株，为TK^-/gE^-/gI^-三基因缺失，公开于中国专利CN101186902，该毒株以保藏编号V200002保藏于CCTCC)用病毒稀释液(无血清的DMEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M.O.I)为0.1接种于ST细胞(购自CCTCC，编号GDC0060)培养，37℃吸附30min，加入含3％(v/v)犊牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养2～4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒效价≥10^8.5TCID₅₀/ml。 

1.2病毒液的培养制备 

猪瘟兔化弱毒株的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M.O.I＝0.1的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30min，加入细胞维持液，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养3～5日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。 

猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M.O.I＝0.1的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30min，加入细胞维持液，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养2～4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。 

1.3病毒液的处理 

猪瘟兔化弱毒株病毒液的处理：将病毒液用中空纤维滤柱(孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。 

猪伪狂犬病毒基因缺失株病毒液的处理：将病毒液用中空纤维滤柱(孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。 

1.4含量测定 

1.4.1猪瘟兔化弱毒株病毒含量测定 

将病毒用含2％羊血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从10^-1到10^-6。每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养48～72h，80％(v/v)丙酮固定，用间接免疫荧光抗体(IFA)方法测定每个稀释度含有猪瘟病毒阳性细胞(绿色荧 光)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，结果为病毒的含量≥10^6.5TCID₅₀/ml。 

1.4.2猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒含量测定 

将收获的病毒液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-95个稀释度，分别接种ST细胞单层的96孔细胞培养板上，每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养48～72h，观察细胞病变(CPE)，根据Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，结果为病毒的含量≥10^8.5TCID₅₀/ml。 

1.4.3抗原含量测定结果 

按上述的方法生产了猪瘟兔化弱毒株和猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒抗原，根据Reed-Muench法计算，结果猪瘟兔化弱毒株病毒液含量为10^6.7TCID₅₀/ml，根据Reed-Muench法计算，猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒液含量为10^8.7TCID₅₀/ml。 

2.猪瘟病毒E2蛋白的制备 

2.1.猪瘟病毒E2基因的获得 

2.1.1猪瘟C株弱毒疫苗株病毒基因组RNA的提取： 

将猪瘟兔化弱毒株(AV1412)用生理盐水稀释后，按照天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp病毒RNA提取试剂盒说明书进行CSFV基因组RNA的提取。 

2.1.2猪瘟C株弱毒疫苗株基因的克隆 

1.根据GenBank登记的猪瘟C株弱毒株的序列(Classical swine fever virus strain C-ZJ-2008，GenBank登录号为HM175885)设计一对引物用于扩增E2基因，上游引物命名为CSFVE2U，其序列信息为 

5`-CGCGGATCCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAA-3`，下游引物 命名为CSFVE2D，其序列信息为 

5`-CCCAAGCTTTCAAAATTCTGCGAAGTAATCTG-3`，上游引物的5`端引入BamHI限制性内切酶识别位点序列“G↓GATCC”，下游引物的5`端引入HindIII限制性内切酶识别位点序列“A↓AGCTT”。下面的步骤(一)中提取的RNA用于反转录，利用宝生物工程(大连)有限公司的Reverse Transcriptase XL(AMV)(货号：D2620)进行第一链的合成，在0.2ml的PCR管中加入含1μg步骤(一)中提取的RNA，加入1μl(10pm/μl)下游引物CSFVE2D作为反转录引物，加入4μl5×Reverse Transcriptase XL Buffer和1μl Reverse Transcriptase XL(5U/μl)，然后补加双蒸水至20μl，42℃水浴作用60分钟，即获得重组CSFV E2基因的cDNA链。 

2.以CSFVE2U和CSFVE2D为上下游引物，以上述cDNA为模板，利用宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRaEx 

(货号：DRR001A)进行PCR扩增E2基因，反应程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，72℃保温延伸10min。PCR产物进行测序测定重组E2基因的序列信息。3.利用核酸限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤3中所述的PCR产物，并克隆入供体质粒pFastBacI的BamHI和HindIII的位点中，获得重组载体pFastBac-E2，并对重组载体中的E2基因进行序列分析。图2本发明提供的重组CSFV E2基因PCR扩增结果。 

2.2.猪瘟E2蛋白的表达 

步骤(一)：将以上所述获得的重组载体pFastBac-E2转化入含有杆状病毒全长基因组穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞 

DH10Bac(Invitrogen，Catalog：10361012)中，在大肠杆菌细胞内重组， 通过蓝白斑进行筛选重组穿梭载体，重组穿梭载体命名为Bacmid-E2。 

步骤(二)：将步骤(一)所述的重组穿梭载体Bacmid-E2转染昆虫sf9，在细胞内产生重组杆状病毒，命名为vBac-E2：准备5×10⁵cells/ml的sf9细胞悬液，在6孔细胞培养板中接入sf9细胞2ml/孔，27℃静置1h以上使细胞贴壁。取一个无菌的1.5ml的离心管，加入1μg重组穿梭质粒Bacmid-E2，用100μL的SF900II SFM培养基进行稀释混匀，室温静置30min，取另一个无菌的1.5ml离心管加入8μL转染试剂 II Reagent(Invitrogen，货号：10362100)，用100μL的SF900II SFM培养基进行稀释混匀，室温静置30min，混合上述两个离心管中的转染试剂稀释液和重组穿梭质粒稀释液，用移液器轻轻混匀，室温静置10min。弃去准备好的6孔板中的sf9细胞的培养上清，加入上述混合转染液，并补加SF900II SFM至1ml，27℃培养箱培养6h，然后弃去转染液，加入新鲜的SF900II SFM培养基，继续培养5天后收集细胞培养上清，然后再通过感染昆虫sf9细胞来扩增重组病毒，重组病毒命名为VBac-E2，对照病毒命名为VBac。 

通过间接免疫荧光法鉴定重组蛋白在昆虫细胞中的表达，在重组病毒感染sf9细胞后48小时，弃去细胞培养上清，用无水乙醇固定10分钟，PBS(0.01M，pH＝7.4)洗涤5遍，再加入CSFV阳性血清，37℃孵育30分钟，PBS洗涤5遍，加入FITC标记的兔抗猪二抗，37℃孵育30分钟，PBS洗涤5遍，显微镜下观察荧光结果。结果如图3，重组病毒VBac-E2感染sf9细胞能够观察到荧光，而对照病毒VBac则观察不到，证明重组病毒VBac-E2在昆虫细胞中能够 表达CSFV E2蛋白。 

(三)用步骤(二)所述的重组昆虫核型多角体病毒感染家蚕幼虫(或蛹)，生产CSFV E2蛋白。 

准备病毒滴度为5×10⁷pfu/ml的重组昆虫核型多角体病毒，用25μL微量注射器于家蚕(品种为大造，购自中国农业科学院蚕业研究所)5日龄幼虫皮下节间膜接种上述重组病毒，每条蚕接种5μL，于接种后第3-8天收集蚕体血淋巴。通过猪瘟病毒(CSFV-Ag)抗原ELISA检测试剂盒(购自韩国Jeno Biotech公司)进行定量测定重组CSFV E2蛋白的表达，如表1所示，ELISA检测结果表明，在接种后第5天蚕体血淋巴中重组蛋白的含量达到最高表达。 

表1.ELISA法测定重组蛋白含量 

通过Westernblot进行鉴定重组蛋白的表达，将上述收获的蚕血淋巴利用PBS(0.01M，pH＝7.4)进行500倍稀释后，通过12％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，使用5％的脱脂奶粉的PBST液封闭12小时，然后用PBST洗涤，加入CSFV E2蛋白的单克隆抗体(购自韩国Jeno Biotech公司)于37℃孵育1个小时，再用PBST洗涤，最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠二抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)进行孵育45分钟，再用PBST洗涤干净，然后通过DAB显色试剂盒进行显色(购自：北京世纪康为生物科技有限公司)，结果显示如图4所示，在45-60KDa的范围内出现特异性着色条带。 

2.3猪瘟E2蛋白效力评估 

筛选4周龄的CSFV血清抗体阴性的仔猪5头，用上述制备的蛋白肌肉注射每猪只1个剂量(20μg/剂量)，2周后再注射1剂量。对第一次注射后各猪只每周采血，利用猪瘟病毒抗体检测ELISA试剂盒(购自美国IDEXX公司)进行血清中相应抗体检测，通过抗体阻断率来评价疫苗的免疫效果和抗体持续时间。如图5所示，自第2次免疫后2周5头猪均能产生不同程度的免疫反应，且抗体阻断率均能够达到50％以上。 

3.配苗 

3.1猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒二联疫苗配制 

将猪瘟病毒(病毒含量为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份)和猪伪狂犬病毒(病毒含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份)，混合后于同一容器内，按1∶1(V/V)比例加入冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，充分摇均，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得疫苗成品，制备出猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗(即猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗)(批号为试Z001)。 

猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗的制备方法可参照图1。 

3.2猪瘟病毒E2蛋白、猪伪狂犬病毒二联疫苗配制 

将猪瘟病毒E2蛋白(蛋白含量为20μg/头份)和猪伪狂犬病毒(病毒含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份)，混合后于同一容器内，按1∶1(V/V)比例加入冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，充分摇均，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得疫苗成品，制备出猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒二联疫苗(即猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病毒二联组合疫苗)(批号为ZH001)。 

实施例2猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗免疫仔猪后的抗体效果比较 

1.材料 

猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗，选用实施例1中的疫苗制品(批号为试Z001)；猪瘟活疫苗(猪瘟单苗)，选用实施例1中的猪瘟病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份；猪伪狂犬活疫苗(猪伪狂犬单苗)，选用实施例1中的猪伪狂犬病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪35头，分为4组，第1～3组为试验组，10头/组，第4组为对照组(5头/组)。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗(批号001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟活疫苗1ml，第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪伪狂犬病活疫苗1ml，第4组不接种。在免疫后28，采集各组仔猪血清，采用ELISA方法测定猪瘟和猪伪狂犬病毒抗体效价。 

猪瘟抗体结果判定标准：群体总体阳性率90％～100％赋值3分，群体总体阳性率70％～89％赋值2分，群体总体阳性率50％～69％赋值1分，群体总体阳性率50％以下赋值0分。仔猪个体抗体阻断率80％以上赋值3分，仔猪个体抗体阻断率60％～79％赋值2分，仔猪个体抗体阻断率40％～69％赋值1分，仔猪个体抗体阻断率40％以下赋值0分。 

猪伪狂犬病毒抗体结果判定标准：群体总体阳性率90％～100％赋值3分，群体总体阳性率70％～89％赋值2分，群体总体阳性率50％～69％赋值1分，群体总体阳性率50％以下赋值0分。仔猪个体抗体值0.0～0.19赋值3分，仔猪个体抗体值0.2～0.39赋值2分，仔猪个体抗体值0.4～0.6赋值1分，仔猪个体抗体值0.61以上赋值0分。 

3.试验结果 

猪瘟病毒抗体试验结果如表2。二联活疫苗免疫仔猪后，猪群中 猪瘟的抗体阳性率为100％(10/10)，而猪瘟单苗阳性率为80％(8/10)；二联活疫苗免疫的仔猪抗体水平比猪瘟单苗免疫的仔猪水平高，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.02)，因此，猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗免疫仔猪后的猪瘟抗体明显优于猪瘟单苗免疫效果，即从表2可知，猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗中两种抗原不仅相互并不干扰，可以保持原抗原的免疫效力，而且意外地发现对猪瘟病毒的免疫效力得到了显著地增强。 

表2二联活疫苗与猪瘟单苗免疫仔猪后的抗体检测结果 

猪伪狂犬病毒抗体试验结果如表3。二联活疫苗免疫仔猪后，猪群中猪伪狂犬的抗体阳性率为100％(10/10)，而猪瘟单苗阳性率为80％(8/10)；二联活疫苗免疫的仔猪抗体水平比猪伪狂犬单苗免疫的仔猪水平高，通过t-test检验分析，两者之间差异极显著(P值0.005)，因此，猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗免疫仔猪后的猪伪狂犬抗体明显优于猪伪狂犬单苗免疫效果，即从表3可知，猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗中两种抗原不仅相互并不干扰，可以保持原抗原的免疫效力，而且意外地发现对其中的猪伪狂犬病毒感染的免疫效力得到了显著地增强。 

表3二联活疫苗与猪伪狂犬单苗免疫仔猪后的抗体检测结果 

实施例3猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗免疫仔猪后猪瘟强毒株攻毒保护效果比较 

1.材料 

猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗，选用实施例1中的疫苗制品(批号为试Z001)；猪瘟活疫苗，选用实施例1中的猪瘟病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪15头，分为3组，5头/组，第1～2组为试验组，第3组为对照组。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗(批号001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟活疫苗1ml，第3组不接种。在免疫后14，以10^5.0最小致死量(MLD)的猪瘟石门系强毒株病毒进行攻毒试验，连续观察16日，测量仔猪体温、观察仔猪临床症状和记录仔猪死亡情况。 

仔猪体温结果判定标准：根据仔猪体温超过40.5℃的天数赋分，0～1天赋值0分，2～3天赋值1分，3天以上赋值2分。 

仔猪临床症状结果判定标准：仔猪无临床症赋值0分，无明显的临床症状赋值1分，出现明显的临床症状赋值2分。无明显的临床症状表现为精神较差，但食欲没有明显的变化，2～3日内恢复正常；明显的临床症状表现为精神萎靡，食欲减退，出现扎堆、呼吸急促等明显的临床症状，持续3日以上。 

仔猪死亡结果判定标准：仔猪存活赋值0分，仔猪死亡赋值2分。 

3.试验结果 

仔猪体温试验结果如表4。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后体温升高0～1日，而猪瘟单苗免疫的仔猪强毒攻击后体温一般升高2～3日，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.016)。 

表4猪瘟强毒攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较 

仔猪临床症状观察结果如表5。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无临床症状或轻微的临床症状，而猪瘟单苗免疫的仔猪强毒攻击后均出现轻微甚至严重的临床症状，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.016)。 

表5猪瘟强毒攻毒后各组试验猪临床症状比较 

备注：“-”表示无临床症状；“+”表示轻微的临床症状；“++”表示严重的临床症状。 

仔猪死亡情况如表6。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无仔猪死亡(保护率为100％)，而猪瘟单苗免疫的仔猪有1头死亡(保护率为80％)，因此，二联活疫苗免疫的保护率比猪瘟单苗明显高。虽然t-test检验显示二联活疫苗和猪瘟单苗之间无明显差异(P值0.37)，但相对对照组(4头仔猪死亡)，二联活疫苗与对照组之间存在显著差异(P值0.016)，而猪瘟单苗与对照组之间不存在显著差异(P值0.21)，因此，二联活疫苗的保护效果优于猪瘟单苗。 

表6猪瘟强毒攻毒后各组试验猪死亡情况比较 

备注：“-”表示无死亡；“+”表示死亡。 

二联活疫苗免疫仔猪后的攻毒结果见表7。从表7可看出，二联活疫苗免疫仔猪后14天进行攻毒保护，能有效的为免疫猪提供保护，而猪瘟单苗在仔猪的体温、临床症状和死亡情况等方面均劣于二联活疫苗，通过t-test检验分析，二联活疫苗与猪瘟单苗之间存在显著差异(P值0.04)。因此，二联活疫苗免疫仔猪能提供良好的免疫效果，且保留了猪瘟成份的良好的免疫效力，而且效果优于单独的猪瘟活疫苗。 

表7二联活疫苗和猪瘟单苗免疫仔猪后的攻毒结果 

即从上面的结果可知，本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中不仅对猪瘟病毒的免疫效力得到了显著地增强，而且在猪瘟病毒的强毒攻毒情况下，表现出更佳的免疫效力。 

实施例4猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗免疫仔猪后猪伪狂犬强毒株攻毒保护效果比较 

1.材料 

猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗，选用实施例1中的疫苗制品(批号为试Z001)；猪伪狂犬活疫苗，选用实施例1中的猪伪狂犬病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪15头，分为3组，5头/组，第1～2组为试验组，第3组为对照组。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗(批号001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪伪狂犬病活疫苗1ml，第3组不接种。在免疫后28天，以10^7.0PFU猪伪狂犬病毒强毒株(Fa株)进行攻毒试验，连续观察14日，测量仔猪体温、观察仔猪临床症状和记录仔猪死亡情况。 

仔猪体温结果判定标准：根据仔猪体温超过40.5℃的天数赋分，0～1天赋值0分，2～3天赋值1分，3天以上赋值2分。 

仔猪临床症状结果判定标准：仔猪无临床症赋值0分，无明显的临床症状赋值1分，出现明显的临床症状赋值2分。无明显的临床症状表现为精神较差，但食欲没有明显的变化，2～3日内恢复正常；明显的临床症状表现为精神萎靡，食欲减退，出现扎堆、呼吸急促等明显的临床症状，持续3日以上。 

仔猪死亡结果判定标准：仔猪存活赋值0分，仔猪死亡赋值2分。 

3.试验结果 

仔猪体温试验结果如表8。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后体温升高均在3日以内，而猪伪狂犬单苗免疫的仔猪强毒攻击后体温一般升高3～5日，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.033)。 

表8猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较 

仔猪临床症状观察结果如表9。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无临床症状或轻微的临床症状，而猪伪狂犬单苗免疫的仔猪强毒攻击后均出现轻微甚至严重的临床症状，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.034)。 

表9猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪临床症状比较 

备注：“-”表示无临床症状；“+”表示轻微的临床症状；“++”表示严重的临床症状。 

仔猪死亡情况如表10。二联活疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无仔猪死亡(保护率为100％)，而猪伪狂犬单苗免疫的仔猪有1头死亡(保护率为80％)，因此，二联活疫苗免疫的保护率比猪伪狂犬单苗明显高。虽然t-test检验显示二联活疫苗和猪伪狂犬单苗之间无明显差异(P值0.37)，但相对对照组(4头仔猪死亡)，二联活疫苗与对照组之间存在显著差异(P值0.016)，而猪伪狂犬单苗与对照组之间不存在显著差异(P值0.21)，因此，二联活疫苗的保护效果优于猪伪狂犬单苗。 

表10猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪死亡情况比较 

备注：“-”表示无死亡；“+”表示死亡。 

二联活疫苗免疫仔猪后的攻毒结果见表11。从表11可看出，二联活疫苗免疫仔猪后28天进行攻毒保护，能有效的为免疫猪提供保护，而猪伪狂犬单苗在仔猪的体温、临床症状和死亡情况等方面均劣于二联活疫苗，虽然t-test检验显示二联活疫苗和猪伪狂犬单苗之 间无明显差异(P值0.07)，但相对对照组，二联活疫苗与对照组之间存在极显著差异(P值0.002)，而猪伪狂犬单苗与对照组之间不存在显著差异(P值0.15)，因此，二联活疫苗的保护效果优于猪伪狂犬单苗。 

表12二联活疫苗和猪伪狂犬单苗免疫仔猪后的攻毒结果 

即从上述结果可知，本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中不仅对的猪伪狂犬病毒的免疫效力得到了显著地增强，而且在猪伪狂犬病毒的强毒攻毒情况下，表现出更佳的免疫效力。 

实施例5猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗与单独使用两种活疫苗(猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗)免疫仔猪的效果比较 

1.材料 

猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗，选用实施例1中的疫苗制品(批号为试Z001)；猪瘟活疫苗，选用实施例1中的猪瘟病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份；猪伪狂犬病活疫苗，选用实施例1中的猪伪狂犬病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪25头，分为3组，第1～2组为试验组，10头/组，第3组为对照组(5头/组)。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗(批号001)1ml，第2组每头猪分别 左侧颈部肌肉注射猪瘟活疫苗1ml，右侧颈部肌肉注射猪伪狂犬病活疫苗1ml，第3组不接种。疫苗免疫后逐日观察仔猪临床症状和注射局部反应。 

疫苗的便捷性判定标准：每头仔猪注射1针赋值0分，每头仔猪注射2针赋值1分。 

仔猪临床安全性的判定标准：仔猪接种疫苗后无任何反应赋值0分，仔猪接种疫苗后出现不良反应赋值1分，不良反应包括惊厥、呕吐、抽搐、死亡等情况。 

仔猪接种局部反应的判定标准：仔猪接种疫苗后，局部无任何反应赋值0分，仔猪接种疫苗后，局部出现反应赋值1分，局部反应包括发红、肿胀、脓肿等情况。 

3.试验结果 

试验结果如表13，可见二联苗无副反应，而两种单苗同时使用，却有3/10的仔猪出现副反应出现，症状表现为呕吐、抽搐、精神不振，2/10的仔猪注射局部表现为发红、肿胀、脓肿。 

表13二联活疫苗与单苗联用的对比试验结果 

本实施例表明从接种剂量比较而言，二联疫苗打1针，共1ml，两种单苗联用需打2针，共2ml，显而易见的效果是二联疫苗使用更 为方便，省时省力；此外，发明人还意外地发现，使用二种抗原的二联疫苗的安全性反而对猪体的局部刺激更小、使用后的副作用也更小，即本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗更加安全。而单苗联用有3/10的试验猪有不良反应，因为注射的剂量相对比二联疫苗要增加1倍；综合述之，二联疫苗不仅要使用方便，而且更为安全。 

实施例6猪瘟E2重组蛋白与猪伪狂犬病二联组合疫苗免疫仔猪后猪瘟强毒株攻毒保护效果比较 

1.材料 

如前述实施例1制备猪瘟、猪伪狂犬病毒病二联组合疫苗：在无菌容器中依次加入猪瘟病毒E2蛋白(20μg/头份)、猪伪狂犬病毒抗原(1.0×10^6.0TCID₅₀/头份)和冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，真空冻干(疫苗批号为ZH001)。猪瘟病毒E2蛋白疫苗的制备步骤如下：在无菌容器中依次加入猪瘟病毒E2蛋白(50μg/头份)和冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，真空冻干。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪15头，分为3组，5头/组，第1～2组为试验组，第3组为对照组。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联组合疫苗(批号ZH001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟病毒E2蛋白1ml，第3组不接种。在免疫后14，以10^5.0最小致死量(MLD)的猪瘟石门系强毒株病毒进行攻毒试验，连续观察16日，测量仔猪体温、观察仔猪临床症状和记录仔猪死亡情况。 

仔猪体温结果判定标准：根据仔猪体温超过40.5℃的天数赋分，0～1天赋值0分，2～3天赋值1分，3天以上赋值2分。 

仔猪临床症状结果判定标准：仔猪无临床症赋值0分，无明显的临床症状赋值1分，出现明显的临床症状赋值2分。无明显的临床症状表现为精神较差，但食欲没有明显的变化，2～3日内恢复正常；明显的临床症状表现为精神萎靡，食欲减退，出现扎堆、呼吸 急促等明显的临床症状，持续3日以上。 

仔猪死亡结果判定标准：仔猪存活赋值0分，仔猪死亡赋值2分。 

3.试验结果 

仔猪体温试验结果如表14。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后体温升高0～1日，而猪瘟E2蛋白免疫的仔猪强毒攻击后体温一般升高2～3日，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.016)。 

表14猪瘟强毒攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较 

仔猪临床症状观察结果如表15。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无临床症状或轻微的临床症状，而猪瘟E2蛋白免疫的仔猪强毒攻击后均出现轻微甚至严重的临床症状，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.016)。 

表15猪瘟强毒攻毒后各组试验猪临床症状比较 

备注：“-”表示无临床症状；“+”表示轻微的临床症状；“++”表示严重的临床症状。 

仔猪死亡情况如表16。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无仔猪死亡(保护率为100％)，而猪瘟E2蛋白免疫的仔猪有1头死亡(保护率为80％)，因此，二联组合疫苗免疫的保护率比猪瘟E2蛋白明显高。虽然t-test检验显示二联组合疫苗和猪瘟E2蛋白之间无明显差异(P值0.37)，但相对对照组(4头仔猪死亡)，二联活疫苗与对照组之间存在显著差异(P值0.016)，而猪瘟E2蛋白与对照组之间不存在显著差异(P值0.21)，因此，二联组合疫苗的保护效果优于猪瘟E2蛋白。 

表16猪瘟强毒攻毒后各组试验猪死亡情况比较 

备注：“-”表示无死亡；“+”表示死亡。 

二联组合疫苗免疫仔猪后的攻毒结果见表17。从表17可看出，二联组合疫苗免疫仔猪后14天进行攻毒保护，能有效的为免疫猪提 供保护，而猪瘟E2蛋白在仔猪的体温、临床症状和死亡情况等方面均劣于二联组合疫苗。通过t-test检验显示，二联组合疫苗和猪瘟E2蛋白之间存在明显差异(P值0.04)，本研究的结果表明二联组合疫苗免疫仔猪能提供良好的免疫效果，且保留了猪瘟成份的良好的免疫效力，而且效果优于单独的猪瘟E2蛋白。 

表17二联组合疫苗和猪瘟E2蛋白免疫仔猪后的攻毒结果 

因此，由上可见，在使用了猪瘟E2蛋白代替猪瘟活病毒作为抗原的情况下，本发明的猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病联合疫苗(即猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗)也可以表现出与实施例2-5的猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗类似的保护力，不仅保留了单独使用猪瘟E2蛋白的免疫效力，而且本发明的猪瘟E2蛋白、猪伪狂犬病联合疫苗的免疫效力比原来的单独使用猪瘟E2蛋白的免疫效力更佳。 

实施例7猪瘟E2重组蛋白与猪伪狂犬病二联组合疫苗免疫仔猪后猪伪狂犬强毒株攻毒保护效果比较

1.材料 

如前述实施例1制备猪瘟、猪伪狂犬病毒病二联组合疫苗：在无菌容器中依次加入猪瘟病毒E2蛋白(20μg/头份)、猪伪狂犬病毒抗原(1.0×10^6.0TCID₅₀/头份)和冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，真空冻干(疫苗批号为ZH001)。猪伪狂犬病活疫苗，选用实施例1中的猪伪狂犬病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪15头，分为3组，5头/组，第1～2组为试验组，第3组为对照组。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联组合疫苗(批号ZH001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪伪狂犬病活疫苗1ml，第3组不接种。在免疫后28天，以10^7.0PFU猪伪狂犬病毒强毒株(Fa株)进行攻毒试验，连续观察14日，测量仔猪体温、观察仔猪临床症状和记录仔猪死亡情况。 

仔猪体温结果判定标准：根据仔猪体温超过40.5℃的天数赋分，0～1天赋值0分，2～3天赋值1分，3天以上赋值2分。 

仔猪临床症状结果判定标准：仔猪无临床症赋值0分，无明显的临床症状赋值1分，出现明显的临床症状赋值2分。无明显的临床症状表现为精神较差，但食欲没有明显的变化，2～3日内恢复正常；明显的临床症状表现为精神萎靡，食欲减退，出现扎堆、呼吸急促等明显的临床症状，持续3日以上。 

仔猪死亡结果判定标准：仔猪存活赋值0分，仔猪死亡赋值2分。 

3.试验结果 

仔猪体温试验结果如表18。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后体温升高均在3日以内，而猪伪狂犬单苗免疫的仔猪强毒攻击后体温一般升高3～5日，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.034)。 

表18猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较 

仔猪临床症状观察结果如表19。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无临床症状或轻微的临床症状，而猪位狂犬单苗免疫的仔猪强毒攻击后均出现轻微甚至严重的临床症状，通过t-test检验分析，两者之间差异显著(P值0.016)。 

表19猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪临床症状比较 

备注：“-”表示无临床症状；“+”表示轻微的临床症状；“++”表示严重的临床症状。 

仔猪死亡情况如表20。二联组合疫苗免疫的仔猪强毒攻击后无仔猪死亡(保护率为100％)，而猪伪狂犬单苗免疫的仔猪有1头死亡(保护率为80％)，因此，二联组合疫苗免疫的保护率比猪伪狂犬单苗明显高。虽然t-test检验显示二联组合疫苗和猪伪狂犬单苗之间无明显差异(P值0.37)，但相对对照组(4头仔猪死亡)，二联组合疫苗与对照组之间存在显著差异(P值0.016)，而猪伪狂犬单苗与对照组之间不存在显著差异(P值0.21)，因此，二联组合疫苗的保护效果优于猪伪狂犬单苗。 

表20猪伪狂犬强毒攻毒后各组试验猪死亡情况比较 

备注：“-”表示无死亡；“+”表示死亡。 

二联组合疫苗免疫仔猪后的攻毒结果见表21。从表21可看出，二联组合疫苗免疫仔猪后28天进行攻毒保护，能有效的为免疫猪提供保护，而猪伪狂犬单苗在仔猪的体温、临床症状和死亡情况等方面均劣于二联组合疫苗。虽然t-test检验显示二联组合疫苗和猪伪狂犬单苗之间无明显差异(P值0.053)，但相对对照组，二联组合疫苗与对照组之间存在极显著差异(P值0.002)，而猪伪狂犬单苗与对照组之间不存在显著差异(P值0.09)。 

表21二联组合疫苗和猪伪狂犬单苗免疫仔猪后的攻毒结果 

因此，本发明的二联组合疫苗的保护效果优于猪伪狂犬单苗。本 研究的结果令人意外：二联组合疫苗免疫仔猪能提供良好的免疫效果，不仅保留了原猪伪狂犬成份的良好的免疫效力，而且效果优于单独的猪伪狂犬活疫苗。 

实施例8猪瘟、猪伪狂犬病二联活(组合)疫苗免疫仔猪后的生长情况比较 

1.材料 

猪瘟、猪伪狂犬病毒病二联活疫苗(批号为试Z001)和猪瘟、猪伪狂犬病毒病二联组合疫苗(批号为ZH001)来源于实施例1。猪瘟活疫苗，选用实施例1中的猪瘟病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份。猪伪狂犬活疫苗，选用实施例1中的猪伪狂犬病毒抗原，其病毒含量与二联活疫苗相同，为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。猪瘟病毒E2蛋白疫苗的制备步骤如下：在无菌容器中依次加入猪瘟病毒E2蛋白(20μg/头份)和冻干保护剂(含5％乳糖、10％脱脂牛奶水溶液)，真空冻干。 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪60头，分为6组，10头/组，第1～5组为试验组，第6组为对照组。第1组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗(批号试ZH001)1ml，第2组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟、猪伪狂犬病二联组合疫苗(批号ZH001)1ml，第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟活疫苗1m，第4组每头猪分别颈部肌肉注射猪瘟E2蛋白疫苗1ml，第5组每头猪分别颈部肌肉注射猪伪狂犬病活疫苗1ml，第6组不接种。疫苗接种前和疫苗接种后30天逐头测量仔猪体重，并连续观察30日，观察仔猪临床症状和记录仔猪死亡情况。 

仔猪临床判定标准：在30天观察期内，仔猪出现发热、食欲减退、呼吸急促等临床症状赋值1分，无临床症状赋值0分。 

仔猪死亡结果判定标准：仔猪死亡赋值1分，仔猪存活赋值0分。 

仔猪体重增重结果判定标准：仔猪日增重小于5.0％赋值1分，仔猪日增重大于5.0％赋值0分。 

3.试验结果 

二联活(组合)疫苗免疫仔猪后的生长情况见表22。从表22可看出，二联活(组合)疫苗免疫仔猪后30天内，能有效的预防仔猪的临床症状且降低仔猪的死亡，通过t-test检验分析，二联活(组合)疫苗与对照组之间存在极显著的差异(P值均为0.035)，而单苗与对照组之间无显著差异。本研究的结果表明二联活(组合)疫苗免疫仔猪后能显著提高仔猪的生产性能，降低仔猪的发病和死亡情况，增加日增重。 

表22二联活(组合)疫苗免疫仔猪后的生长情况结果 

实施例9猪瘟、猪伪狂犬病二联活(组合)疫苗中猪瘟效力检验比较 

猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗效力检验中涉及猪瘟病毒的效力检验，传统的猪瘟病毒效力检验为兔体发热法，本发明采用间接免疫荧光法测定病毒含量，两种方法具体的操作及判断如下。 

1、兔体发热法 

将疫苗用灭菌生理盐水稀释成1/7500头份/ml，耳静脉注射体重1.5～3.0kg兔2只，每只1.0ml。接种后，上、下午各测体温1次，48小时后，每隔6小时测体温1次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。 

接种疫苗后，兔的体温反应标准如下： 

定型热反应(++)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次升高1℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，则必须攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)，攻毒后如果无反应，可判为定型热。 

轻热反应(+)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次升高0.5℃以上，并稽留12～36小时。 

可疑反应(±)潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。 

体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔的热反应 可判为定型热或轻热反应。 

无反应(-)体温正常。 

结果判定： 

接种疫苗后，当2只兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。 

接种疫苗后，当1只兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)；或2只兔均呈轻热反应(+)时，可在接种后7～10日攻毒。 

攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂。每只兔耳静脉注射1.0ml。 

攻毒后的体温反应标准如下： 

热反应(+)潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，升高1℃以上，稽留12～36小时。 

可疑反应(±)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。 

无反应(-)体温正常。 

攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只接种疫苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。 

接种疫苗后，如果有1只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(土)或无热反应(-)，可对可疑反应兔或无反应兔采用扑杀剖检或采心血分离病毒的方法，判明是否隐性感染；或接种疫苗后，2只兔均呈轻热反应，亦可对其中1只兔分离病毒。方法是：接种疫苗后96～120小时之间，将兔扑杀，采取脾脏，用 灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂(脾脏乳剂应无菌)，或采取心血(全血)，耳静脉注射2只兔，每只1.0ml。凡有1只兔潜伏期24～72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判为合格。 

接种疫苗后，由于出现其他反应情况而无法判定时，可重检。用兔做效力检检，应不超过3次。 

2、间接免疫荧光法测定病毒含量 

将病毒接种于96孔细胞板ST细胞，每个样品4孔，每孔100μL，同时设立阴性对照，放入5％CO2温箱中37℃培养48～72h；弃去生长液，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤细胞3次，然后加入100μL预冷的80％(v/v)丙酮溶液，4℃固定30min。然后用PBS洗涤3次后，每孔加入100μL用PBS 1∶400稀释的猪抗CSFV血清，37℃作用1h；用PBS洗涤3次，每次10min后；加入用PBS 1∶500稀释的荧光标记的兔抗猪IgG(IgG-FITC)，每孔100μL，37℃作用1h；用PBS洗涤3次，每次10min，在荧光显微镜下观察。细胞对照孔应无特异性黄绿色荧光出现，而病毒接种细胞孔应有大量特异性黄绿色荧光出现。

通过对兔体发热法和间接免疫荧光法的操作和结果判定可以得出，兔体发热法操作繁琐，结果判定困难，试验易受家兔来源的影响，而间接免疫荧光法具有如下优点：1)检测时间短，只需要3天，而兔体发热法检测至少需要11天；2)用细胞感染病毒，操作简单，成本低，不需要买大量的实验动物，同时不需要专人测定动物体温；3)利用细胞感染病毒，条件均一、稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著。 

实施例10猪瘟、猪伪狂犬病二联活(组合)疫苗的制备 

1.疫苗制备 

将实施例1中所制备的猪瘟兔化弱毒株病毒液含量为 

10^6.7TCID₅₀/ml，猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒液含量为10^8.7TCID₅₀/ml，按照如下配方制备二联苗。 

表23猪瘟、猪伪狂犬病二联活(组合)疫苗不同配方的制备 

2.动物试验设计 

选21日龄仔猪25头，分为5组，5头/组，第1-4组分别用疫苗1-疫苗4颈部肌肉注射，第5组做对照组，不接种。在免疫后14日，以10^5.0最小致死量(MLD)的猪瘟石门系强毒株病毒进行攻毒试验， 连续观察16日，记录仔猪死亡情况。 

3.实验结果 

表24猪瘟、猪伪狂犬病二联活(组合)疫苗不同配方的攻毒试验 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (16)

1.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原。

2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟活病毒、改良/嵌合的猪瘟活病毒、至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒，至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分的一种或任意几种的组合。

3.根据权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株。

4.根据权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2亚单位抗原。

5.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，至少含有猪伪狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒、猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。

6.根据权利要求5所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏编号V200002)、Ea株(CGMCC，保藏编号N0.0907)、WKQ-001株(CCTCC，保藏号V200511)或伪狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha-K61株、Bucharest株、BUK株、H株(GCMCC，保藏号为No.5013)和C株(CCTCC，保藏编号V201114)的一种或任意几种的组合。

7.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株，所述的猪瘟兔化弱毒株的含量为≥3.0×10^3.0TCID₅₀/头份，优选地为0.6～1.5×10^4.0TCID₅₀/头份，更优选的为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份。

8.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量为≥5.0×10^5.0TCID₅₀/头份，优选地为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的二联疫苗，其特征在于，还包括冻干保护剂。

10.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别培养猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，获得猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，制备成二联疫苗。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按如下比例配制，使得猪瘟病毒液的含量为1.0×10^4.0TCID₅₀/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，使用猪瘟E2蛋白代替培养猪瘟病毒液的步骤，并将猪瘟E2蛋白与培养的猪伪狂犬病毒液按如下比例配制，使得猪瘟E2蛋白的含量20μg/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0×10^6.0TCID₅₀/头份，制备成二联疫苗。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法在将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制之后，还包括加入冻干保护剂的步骤。

14.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的效力检验方法，其特征在于，所述方法采用间接免疫荧光方法，包括以下步骤：将病毒接种于细胞，待细胞长至单层后用丙酮溶液固定，然后加入一抗和二抗，最后根据荧光数计算疫苗效价。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的细胞为传代细胞，更优选ST传代细胞；所述的固定用丙酮溶液优选80％浓度；所述的一抗优选猪抗猪瘟病毒血清；所述的二抗优选兔抗猪IgG(IgG-FITC)。

16.一种权利要求1-9任意一项所述的二联疫苗在治疗和预防猪瘟和猪伪狂犬病的疫苗中应用。

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