CN103059132B - 抗h9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO: C2012152的杂交瘤细胞株4D10所分泌的。本发明还公开了一种H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及检测方法。本发明试剂盒以抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体为二抗，公开了H9亚型流感病毒的分离、扩增、灭活和纯化方法及H9亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及纯化方法。本发明的试剂盒和检测方法能直接对H9亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽等特点。

Description

抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于动物病毒与动物传染病学检测技术领域，具体地说，本发明涉及抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，本发明还涉及抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体在在制备H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒中的应用及双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒和检测方法。

背景技术

1975年，Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb），简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展起到了巨大的推动作用，已经成为生物技术领域的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。

禽流感( Avian influenza, AI)是由 A 型流感病毒( Avianinfluenza virus, AIV) 引起的病毒性烈性传染病,是目前危害世界及我国养禽业最重要的疫病之一。H9亚型禽流感病毒最早由Hommeeand Easterday(1970)从火鸡体内分离到。1994年，陈伯伦等(陈伯伦等，1994)从病蛋鸡体内分离到H9亚型AIV。此后，H9亚型AIV在我国广泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势。至 1997 年,H9 亚型 AIV 广泛分布于各大洲。韩国、 爱尔兰、 意大利等国都有H9 禽流感暴发的报道, 说明其已在家禽中建立了稳定的种系。1998年从香港的家猪体内分离到2株H9亚型流感病毒，这是首次从哺乳动物体内分离到H9亚型流感病毒。1999从香港患流感的女孩体内分离到两株H9流感病毒，对这两株病毒的分析表明其所有的基因片段与AIV—A／Quail／Hong Kong／G1／97(H9)高度同源，是典型的禽源流感病毒，该毒株是香港人感染H5N1和H9亚型密切相关的分支代表株。2000-2001年，对中国南方地区的水禽(主要是家鸭) 进行流感病毒监测发现约10%水禽被H9 感染，感染率是20 世纪70 年代的4 倍。同样对这些 H9 毒株的基因片段进行克隆和测序分析, 结果证明,对于 HA 和 NA 基因片段大多数与DK/ Y280/ 97 亚群毒株关系密切从而证明这些毒株HA 和NA 基因片段的陆禽起源。而其6 个内部基因片段遗传演化上则证实来自水禽并且这6 个内部基因片段与2001 年香港暴发的H5N1 病毒内部基因片段关系紧密。据报道，A/ Quail/ Hong Kong / G1/ 97 株很可能参与了H9 亚型之间的基因重排从而产生了可感染人类的新型毒株。在猪体内也曾分离出了类人型的和类禽亚型的毒株, 二者很有可能在猪体内发生基因重排, 从而产生更加适应人源和禽源的毒株从而能突破种间屏障感染人。尽管还没有充分的证据表明 H9 亚型流感病毒能在人与人之间传播但其已经成为目前严重危害人类健康的重要传染病之一。

藏鸡是世界上独一无二的宝贵遗传资源, 近年来,随着西藏农牧业产业结构的调整,藏鸡场集约化程度不断提高, 藏鸡养殖已经成为西藏地区农牧民增收致富的重要途径之一。但由于缺乏全面、 系统的鸡病防治技术,致使鸡的各种传染性疾病发病率很高,尤其是全球流感暴发和流行, 给藏鸡养殖业带来很大的经济损失, 严重挫伤了农牧民养殖的积极性。西藏地处我国西南边疆, 边境线漫长,与多个国家接壤,处在鸟类迁徙路线上,是我国野生鸟类重要聚集地之一, 其中有的国家的野鸟中已经检测到 AIV,这对西藏地区养禽业带来了严重的威胁。因此, 对藏鸡、 鸭等禽类进行H9亚型AIV 分子流行病学调查及生物特性研究为AIV 的预测预警提供理论依据是非常必要的。

1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosrbent Assay，简称ELISA方法）。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速、非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。（焦奎等.酶联免疫分析技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2004,84～141；李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003,4（6）:65～69）

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是提供抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的应用。

本发明的第三个目的是提供一种包含所述的单克隆抗体的H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法。

本发明是这样实现的：

申请人所在的华中农业大学农业微生物国家重点实验室动物病原分离室从鸡群中分离得到的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，并制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）的单克隆抗体,分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10，已于2012年11月8日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：C C2012152。

申请人利用所述的单克隆抗体制备成双抗体夹心ELISA核心试剂，建立了一种H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法，并且组装了一种用于快速检测H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的：辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体；用保藏号为CCTCC  NO：C2012152的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及样品处理液、洗涤液、底物显色A液、底物显色B液、终止液，阳性对照样品和阴性对照样品组成。

更详细的技术方案如下所述。

抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备，它包括下列步骤：

1）以从西藏病鸡中分离得到的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet/ S1/2009毒株为抗原，经过扩增和纯化，对5-8周龄BALB/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）进行免疫。

2）细胞融合，取经加强免疫后的BALB/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）的脾脏，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞（购自卫生部武汉生物制品所）融合。

3）利用血凝抑制法（HI）（肖金晖等. RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学,2005,5:401～402），筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）的抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法（但汉并等. H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展,2006,27（8）:67～69）进行克隆、筛选。经过3～5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素（HA）蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10（保藏编号为CCTCC NO：C2012152）。

4）腹水的制备，取5-6周龄雌性BABL/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）腹腔注射弗氏完全佐剂0.5ml/只，5天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制（HI）法检测腹水效价，-70℃保存。

5）将单克隆抗体进行纯化和标记。

上述抗体经过纯化和标记后可用于制备检测H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。

一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体；用杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及底物显色A液、底物显色B液、终止液、10倍洗涤液、样品处理液A和样品处理液B，所述杂交瘤细胞株4D10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: C2012152，其中：

底物显色A液：0.06%H₂O₂缓冲液；

底物显色B液：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用ddH₂O定容至500ml，配成0.1mol·L 磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0，按终浓度为20mg/L添加联苯二胺；

终止液：40%氢氟酸 625μL，用ddH₂O定容至100mL；

10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5mL，用ddH₂O定容至1000mL，pH7.4；

样品处理液A：取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl 8.5g，ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织；

样品处理液B：取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl8.5g, ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。

本发明进一步提供了一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

（1）用H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009作为免疫原；

（2）用步骤（1）的免疫原制备保藏号为CCTCC NO: C2012152的杂交瘤细胞株4D10；

（3）用步骤（2）的杂交瘤细胞株4D10制备单克隆抗体；

（4）用辣根过氧化物酶标记步骤（3）得到的单克隆抗体，作为酶标抗体；

（5）将待检测样品用样品处理液A或B进行处理得到待检测物；

（6）对步骤（5）所述的待检测物进行双抗体夹心酶联免疫检测，

其中：

样品处理液A的配制：取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl 8.5g, ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织；

样品处理液B的配制：取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl 8.5g, ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。

与现有技术相比本发明具有如下优点：

1、本发明的试剂盒和检测方法能直接对H9亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽（鸡胚尿囊液、内脏组织匀浆液）的特点。

2、本发明的试剂盒和检测方法适用于对H9亚型流感病毒进行检测，而对其它亚型的流感病毒，如：经典H1亚型、H3亚型、H5亚型的流感病毒则不反应，具有很好的特异性。

3、本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性。

4、本发明一次能同时处理多个样本，非常适合H9亚型禽流感病毒的临床大规模检测。并能够满足试验要求，也可作为科研使用。

5、目前市场上还没有检测H9亚型禽流感病毒抗原的试剂盒。酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产研制的抗H9亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶（简称HRP）标记，具有很高的酶活性，产量高及成本低。

附图说明

图1：是本发明总体技术路线图。

图2：是SP2/0细胞染色体计数。

图3：4D10细胞染色体计数。

图4：抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）单克隆抗体间接免疫荧光检测图。其中图4A为抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）单克隆抗体间接免疫荧光检测图；图4B为阴性对照。

具体实施方式

实施例1   H9亚型流感病毒的制备

一、H9亚型流感病毒的分离

1、分离过程:用灭菌的咽拭子采集病鸡样，置于灭菌磷酸盐缓冲液（简称PBS，配方：Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g, 用ddH₂O定容至1000ml）中，随后将咽拭子样本液0.2ml接种9日龄无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）鸡胚（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），置35℃下孵育72h，收获尿囊液做血凝定性试验，血凝试验为阳性的样本，再经过RT-PCR试验定型。

2、鉴定依据：RT-PCR检测为阳性的样本，扩增HA，送上海生工生物工程有限公司测序，对所得DNA序列与网上公布的序列（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ）进行比对，以确定病毒亚型。

3、H9亚型流感病毒株的病毒学特征：经过HA-DNA序列比对，得出与藏鸡HA-NA 核酸的同源性为99 %，氨基酸同源达99%，因此确定了我们获得的流感病毒为H9亚型流感病毒。

二、H9亚型流感病毒的扩增、灭活及纯化

1、将H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009进行扩增；

（1）严格筛选9～10日龄无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）鸡胚（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司）

每批鸡胚经过严格筛选。外检共4项： 白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项：去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。

（2）接种病毒（A/Chicken / Tibet / S1/2009）于鸡胚尿囊腔

选用9～10日龄SPF鸡胚，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒，用钢锥穿一小孔，随后将1ml注射器针头沿此小孔插入(避开血管)，接种H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009。最后用石蜡封口，并置35℃下孵育72h。每天检查鸡胚生长情况，每12h翻卵并检卵一次。24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡并弃去，72h收取鸡胚，4℃下放置过夜。

（3）含H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009尿囊液的收获

用75％浓度的酒精消毒鸡胚气室端，用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。将鸡胚收获液3000r/min离心5min去除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，确定鸡胚尿囊液血凝效价。

2、H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009的灭活

将含病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀， 37℃灭活24小时，每隔6小时振摇1次。每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。灭活容器的H9亚型流感病毒的尿囊液经检定合格。8000r/min，离心10min。弃去沉淀，上清备用。

3、H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009浓缩及纯化

（1）将H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009进行浓缩，方法是：将H9亚型流感病毒鸡胚尿囊液于27000r/min，离心2h，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，充分混匀备用。

（2）H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009纯化

在超速离心管中依次加入60%、45％、30％、20％浓度蔗糖溶液形成密度梯度。将重悬好的病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009样品平铺于最上层，于32000r/min，离心1h。离心后取出45％、30％之间层面样品，用PBS重悬45%、30%之间层面样品取出样品，32000r/min，离心1h，取沉淀（即得所述的病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009）进行蛋白质含量测定。以此作为免疫原。

实施例2 抗H9亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的制备

1、以纯化并灭活的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009原毒株为抗原，加弗氏佐剂乳化（首免选用弗氏完全佐剂，二、三免选用弗氏不完全佐剂）免疫5-8周龄BALB/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）。首免剂量为20μg/只，每只小鼠颈背部皮下多点注射。二周后用相同剂量加强免疫一次，二周后再加强免疫一次，剂量为40μg/只，二周后断尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法检测小鼠抗体效价。待小鼠抗体达到试验要求，再经腹腔注射灭活及纯化的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，注射剂量为40μg/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞（购自卫生部武汉生物制品所）按实验室常规方法进行融合。

2、细胞融合，取经过加强免疫的BALB/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%浓度酒精中浸泡10min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞（购自卫生部武汉生物制品所）按1×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(个数比1:10)的比例于50ml离心管中混匀，1500r/min，离心10min。弃去上清，管壁用灭菌的滤纸吸干，轻震管底，使细胞沉淀略有松动。将装有细胞混合物的离心管放置于37℃恒温水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50% 聚乙二醇（PEG）0.8ml（购自sigma公司），边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1min。然后慢慢加入预温至37℃的1640（购自sigma公司）细胞培养液40ml。

融合具体步骤如下：

第一分钟逐滴滴入50% 聚乙二醇（PEG）0.8 ml，静置0.5min；第二分钟加1640细胞培养液1ml，静置0.5min（重复一次）；第四分钟加1.5ml，静置0.5min（重复一次）；第六分钟加5ml，静置0.5min（重复一次）；第八分钟加10ml，静置0.5min（重复一次）；每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。静置1min，1000r/min离心10min，弃上清，于37℃环境中放置8min。用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约200μl/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5% CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察96孔板内细胞有无污染，于第4天用HT培养基换HAT培养基100μl。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。采用灭活H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009作为筛选抗原，利用血凝抑制法（肖金晖等. RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学,2005,5:401～402）筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法（但汉并等. H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展,2006,27（8）:67～69）进行克隆、筛选。经过3～5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白（HA）的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10，于2012年11月8日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2012152。

3、腹水的制备，选用5-6周龄雌BABL/c小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）腹腔注射弗氏完全佐剂0.5ml/只，5天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法（HI）检测腹水效价，-70℃保存。

4、腹水抗体的纯化：辛酸-硫酸铵法

具体步骤如下：

（1）将上述步骤3制备的腹水1000r/min离心10 min，用0.45μm滤膜过滤，滤液边搅拌边加入用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液（pH=4.5）；

（2）边搅拌边逐滴加入正辛酸至终浓度为33μl/ml，室温条件下搅拌30min，8000r/min离心30min，弃沉淀收集上清；

（3）将步骤（2）的上清液经滤纸过滤一次，滤液pH调制7.4；

（4）向步骤（3）所得的滤液边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液（硫酸铵体积/总体积≦45%），待滤液呈白色浑浊液时，继续搅拌30min，然后于4℃静置5h。再于4℃条件12000r/min下离心30min；

（5）弃上清，沉淀用10mmol pH=9.0 Tris-HCl 重悬；在100倍体积的10mmol pH=9.0 的Tris-HCl中, 于4℃条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次（12h/次）更换新鲜Tris-HCl液。透析结束后，取上清，用SDS-PAGE电泳的方法鉴定抗体的纯度，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装、冻存。

上述纯化抗体试验中所用试剂按照以下配方配制：

醋酸缓冲液（60mmol/L）：C₂H₃NaO₂ 2.463g，用ddH₂O定容至500ml（pH=4.5）；

饱和硫酸铵溶液：每100ml ddH₂O中加(NH₄)₂SO₄ 90g，加热至80℃溶解，趁热滤纸过滤，降至室温即有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7.2，备用。

5、辣根过氧化物酶（HRP）标记单克隆抗体

（1）取辣根过氧化物酶（HRP）5.0㎎溶于5 ml ddH₂O,溶液呈棕红色；随后滴加NaIO₄（60mmol/L）0.5ml，使溶液呈草绿色，4℃条件放置30min；滴加乙二醇（160mmol/L）0.5ml，终止氧化反应，室温下避光放置30min，溶液呈棕黄色；

（2）取本发明制备的单克隆抗体5ml（㎎/ml）与上述步骤（1）所处理好的液体混合，10mmol pH=9.5碳酸盐缓冲液，4℃条件下磁力搅拌透析过夜。

（3）向完成透析液体中加新鲜配制的浓度为5㎎/ml的 NaBH₄0.2ml，于4℃下放置2h；然后等体积加入饱和硫酸铵，于4℃下静置30min，7000r/min离心10min，弃去上清。PB溶液（20mmol/L pH=7.4，配制方法如后所述）3ml重悬，在1000倍体积的PB（20mmol/L pH=7.4）中，4℃条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次（12h/次）换液。

（4）标记抗体完成透析后，加PB（20mmol/L pH=7.4）、甘油（终浓度30%）定容至5ml，于-20℃保存。

标记抗体试验中所用试剂按以下配方配制：

NaIO₄（60mmol/L）：NaIO₄ 1.283g，用ddH₂O定容至100ml；

乙二醇（160mmol/L）：乙二醇 13.4μl，用ddH₂O稀释至1.5ml；

碳酸盐缓冲液10mmol pH=9.5：Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g,用ddH₂O定容至1000ml(pH=9.5)；

NaBH₄（5㎎/ml）：NaBH₄0.05g，用ddH₂O定容至10ml，现配现用；

饱和硫酸铵溶液：每100ml ddH₂O中加(NH₄)₂SO₄ 90g，加热至80℃溶解，趁热滤纸过滤，降至室温即有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7.2，备用；

PB（20mmol/L pH=7.4）：Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaH₂PO₄ 1.56g，用ddH₂O定容至1000ml(pH=7.4)；

醋酸缓冲液（60mmol/L）：C₂H₃NAO₂2.463g，用ddH2O定容至500ml(pH=4.5)。

实施例3  抗H9亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的鉴定

1、 HI效价的鉴定

采用本发明分离得到的H9亚型流感病毒作为抗原用血凝抑制法测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价。结果见表1。

表1：利用血凝抑制法（HI）测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价

	细胞培养上清	小鼠腹水
			血凝抑制（HI）效价	29	218

2、单克隆抗体的Ig亚类（型）的鉴定

用鼠源单抗亚型鉴定试剂盒（Mouse Mab Isotyping Test Kit，购自THERMO公司）对本发明所得到的单克隆抗体进行鉴定，确定本发明制备的单克隆抗体为IgG₁亚类。

3、单克隆抗体的特异性鉴定

采用血凝抑制法（HI）分别测定抗H9亚型流感血凝素蛋白（HA）单克隆抗体与经典H1亚型、H3亚型、H5亚型的流感病毒，结果均显示为阴性，说明获得的抗H9亚型流感血凝素蛋白（HA）单克隆抗体具有很好的特异性。结果见表2。

表2：血凝抑制法测定单克隆抗体与经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒结果

流感病毒亚型	H1	H3	H5	H9	H10
						血凝抑制（HI）价	－	－	－	+	－

4、染色体计数

按常规方法进行杂交瘤染色体计数（章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社,1987:281~406），所有获得的杂交瘤细胞染色体众数位于85-97之间（SP2/0骨髓瘤细胞染色体众数为70，BALB/c鼠脾细胞染色体数为40），均高于两亲本细胞的染色体数目，证明所有获得的杂交瘤细胞确为SP2/0细胞与免疫脾细胞的杂合体。

实施例4      H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法

1、核心试剂配制：

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g, 用ddH₂O定容至1000ml(pH9.6)。

10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5ml，用ddH₂O定容至1000ml (pH=7.4)。

封闭液：5g脱脂乳溶于100ml洗涤液。

底物液：分为底物液A和底物液B。具体组成如下：

底物液A：0.06%浓度的H₂O₂缓冲液。

底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用ddH₂O定容至500m配成0.1ml磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH=5.0)，然后按终浓度为20mg/L添加联苯二胺(TMB)（使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用）。

终止液：0.25%氢氟酸（HF）；HF(40%) 625μL，用ddH₂O定容至100mL。

2、ELISA检测方法步骤：

（1）包被抗体：最佳包被浓度和辣根过氧化物酶标记抗体最佳稀释浓度比采用方阵滴定法（李海燕等.禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究，2000, 22( 3):182~185）来确定。检测抗原为灭活的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009尿囊液。试验结果显示包被抗体最佳包被浓度为2μg/ml，辣根过氧化物酶标记抗体最佳稀释浓度比为1:400。

（2）酶标反应板的制备：纯化抗体用包被液按照体积比为1：800比例稀释，100μl/孔加入到酶标板中，37℃放置1h后置4℃冷藏过夜；拍干包被液，用洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干洗涤液；加封闭液200μl/孔到酶标板中，于37℃封闭2h，拍干封闭液。于4℃冷藏过夜，自然干燥。

3、结果判定值的确定：

通过对176份已知背景的H9亚型流感病毒阴性样品进行检测，得到结果，求其平均值X＝0.08；标准偏差SD＝0.04；确定阴阳性临界点为X＋3SD＝0.08+3×0.04=0.21。即待测样品的OD₆₃₀值≤0.21则判定为阴性，OD₆₃₀值＞0.21则判定为阳性。

4、阴、阳性对照试剂的制备：

将含病毒尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀， 37℃灭活24小时，每隔6小时振摇1次。加入0.02％NaN₃防腐，并作为阳性对照样品4℃保存。

空白鸡胚尿囊液加入0.02％NaN₃防腐作为阴性对照样品4℃保存。

5、H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的使用步骤：

（1）包被:以纯化抗体最佳包被浓度包被酶标板为100μl/孔，37℃孵育1h后置4℃过夜。

（2）洗板：弃包被液，PBST洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次3min。

（3）封闭：拍干酶标板，加入封闭液，200μl/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点。

（4）洗板：弃封闭液，同步骤（2）。

（5）加待检样品：拍干酶标板，加入待检样品，100μl/孔，设阴性对照，37℃孵育30min。

（6）洗板：弃待检样品液，同步骤（2）。

（7）加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体，体积比为1:400倍稀释，100μl/孔，37℃放置30min。

（8）洗板：弃酶标抗体，同步骤（2）。

（9）显色：每孔加入新配的底物A液、底物B液各50μl，室温避光显色10min。

（10）终止反应：每孔加入50μl终止液终止反应；

（11）测定OD₆₃₀值：酶标仪测定波长为630nm时OD值。

实施例5 H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的敏感性试验和特异性试验

1、H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的敏感性试验

通过本发明敏感性试验，表明本发明的ELISA方法最低可检测的病毒含量为TCID₅₀=10^-2.3（约200个TCID₅₀）（殷震等.动物病毒学（第2版）[M].北京:科学出版社,1997）。结果见表3。

表3：本发明敏感性试验

2、H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的特异性试验

（1）将经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H10亚型的流感病毒分别用本发明的方法进行检测，OD₆₃₀结果值均≤0.21，判定为阴性，说明本发明对流感各亚型具有很好的特异性。其结果见表4所述。

表4：本发明对经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒的检测结果

流感病毒亚型	H1	H3	H5	H10	H9	空白尿囊液
							OD630值	0.0590	0.0450	0.0480	0.0580	1.9180	0.0730

（2）将畜禽类主要病毒如：将猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、细小病毒（PPV)伪狂犬病病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、鸡乙脑病毒、鸡新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡减蛋综合症病毒（EDSV）、SPF鸡胚尿囊液等样本分别用本发明的方法进行检测，OD₆₃₀结果值均≤0.21，判定为阴性，说明本发明对以上各种病毒具有很好的特异性。其结果见表5所述。

表5：本发明对畜禽类主要病毒的检测效果

病毒类型	PRRSV	CSFV	PRV	PPV	JEV	NDV	IBDV	EDSV	阴性对照
										OD630值	0.1420	0.1430	0.1220	0.1360	0.1450	0.1320	0.1210	0.1650	0.1120

实施例6  H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法与PCR方法的比较

1、检测尿囊液样本：将本实验室保存的5株H9亚型流感病毒鸡胚尿囊液同时用本发明方法和RT-PCR方法检测并进行比较。其结果见表6所述。

表6显示：本发明方法共检出5份阳性样本，0份阴性样本，检出率100%（5/5）；RT-PCR方法共检测出5份阳性样品，0份为阴性样品，检出率100%（5/5）；本发明方法和RT-PCR方法符合率100%（5/5）。

表6：本发明ELISA检测方法与RT-PCR方法的结果比较

2、检测组织样本：将已知背景为阳性的样本35份（包含心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、气管和气管冲洗液）、阴性样本25份（包含心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、气管和气管冲洗液）共60份样同时用本发明方法和RT-PCR方法检测并进行比较。其结果见表7所述。

表7显示：本发明共检出33份样本为阳性，25份样本为阴性。通过RT-PCR方法共检出35份为阳性，25份为阴性。本发明对阳性样本的检出率为94.3%（33/35），两种方法的符合率94.3%（33/35）；本发明对阴性样本的检出率为100%（25/25），两种方法的符合率100%（25/25）。

表7：本发明与RT-PCR方法的检出率的比较

3、检测临床样本：将各地所采集样本共258份样本用双抗体夹心ELISA检测方法试验。结果显示：本发明检测方法检出阳性样本3份，阳性率为1.16%（3/258）。

实施例7 H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装

1、H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒包括：

2、相关试剂的配制

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g，用ddH₂O定容至1000mL(pH9.6)。

10倍洗涤液： NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5ml，用ddH₂O定容至1000ml (pH=7.4)。

封闭液：5g脱脂乳溶于100ml洗涤液。

底物液：底物A液：0.06%（体积）H₂O₂缓冲液；底物B液：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g,用ddH₂O定容至500ml，配成0.1ml磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH=5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将底物 A液和底物B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

终止液：0.25%（体积）氢氟酸（HF）；HF(40%) 625μL，用ddH₂O定容至100mL。

样品处理液A的配制： 称取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g , H₃BO₃ 16.08g, NaCl 8.5g, ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml。在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织。

样品处理液B的配制：称取Na₂B₄O₇ ·10H₂O 13.3g , H₃BO₃ 16.08g, NaCl 8.5g, ddH₂O 800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml。在121℃高压蒸汽下灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。

阳性对照的配制：将含病毒尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀， 37℃灭活24小时，每隔6小时振摇1次。加入0.02％NaN₃防腐，并作为阳性对照样品分装成0.5ml/管，置4℃下保存。

阴性对照的配制： 无菌收取SPF鸡胚尿囊液，4℃，12000r/min离心30min后加入0.02％NaN₃防腐。分装成0.5ml/管，置4℃下保存。

实施例8 H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的操作步骤

1）取酶标板（根据样品多少可拆开分次使用），将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后，洗板一次（200μl/孔,放置室温5min）后拍干；

2）加入待检样品，100μl/孔，设阴性对照，37℃孵育30min；

3）弃待检样品液，

4）拍干酶标板后加入HRP标记抗体，1:400倍稀释，100μl/孔，37℃放置30min；

5）弃酶标抗体，加入洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次3min；

6）每孔加入新配的底物A、B液各50μl，室温避光显色10min；

7）终止反应：每孔加入50μl终止液终止反应；

8）测定OD630值：酶标仪测定波长为630nm时OD值。

9）结果判定：阴、阳性对照的OD值是反应试剂盒质量和试验操作规范的重要标志，我们选择灭活的H9亚型流感病毒作为阳性对照，SPF鸡胚空白尿囊液作为阴性对照。ELISA试验成立的条件是阳性对照OD值大于0.8，阴性对照OD值小于0.2。阳性对照、阴性对照必须控制在这个范围内，否则检测结果无效。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体,它是由保藏号为CCTCC NO:C2012152的杂交瘤细胞株4D10所分泌的。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株4D10，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO∶C2012152。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒。

5.一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体、用杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及底物显色A液、底物显色B液、终止液、10倍洗涤液、样品处理液A和样品处理液B，所述杂交瘤细胞株4D10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2012152，其中：

底物显色A液：0.06%H₂O₂缓冲液；

底物显色B液：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用ddH₂O定容至500ml，配成0.1mol/L磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0，按终浓度为20mg/L添加联苯二胺；

终止液：40%氢氟酸625μL，用ddH₂O定容至100mL；

10倍洗涤液：NaCl80g，KCl2g，Na₂HPO₄·12H₂O29g，KH₂PO₄2g，Tween-205mL，用ddH₂O定容至1000mL，pH7.4；

样品处理液A：取Na₂B₄O₇·10H₂O13.3g，H₃BO₃16.08g，NaCl8.5g，ddH₂O800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织；

样品处理液B：取Na₂B₄O₇·10H₂O13.3g，H₃BO₃16.08g，NaCl8.5g,ddH₂O800ml，调pH值为8.4后用蒸馏水定容至1000ml，在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。