CN106699879A - 一种a型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用 - Google Patents

一种a型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用。本发明提供了一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法包括：以杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6制备A型禽流感病毒单克隆抗体等步骤。其中，细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010。本发明还提供包括上述A型禽流感病毒单克隆抗体溶液、样品稀释液等的A型禽流感免疫检测试剂盒。本发明的单克隆抗体效价高、特异性强，用其制备免疫检测试剂盒，可克服交叉反应问题；而且可以分别与禽流感H9亚型、H5亚型产生特异性免疫反应，因此能够扩大了检测效力，同时减少了检测成本。该禽流感ELISA免疫检测试剂盒，灵敏、准确、操作简便。

Description

一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种A型禽流感特异性单克隆抗体的建立方法及应用。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)全名是鸟禽类流行性感冒，是由禽流感病毒(AvianInfluenza virus，AIV)引起的动物传染病。通常只传染鸟类和禽类，但在罕有情况下也会传染猪，甚至传染人。禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽、鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸症状，食量减低，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感也称A型禽流感很严重，发病率、死亡率均很高。不仅在禽类间流行，也会传染给人和畜类。家禽感染高致病性禽流感死亡率几乎是100％；人类感染禽流感死亡率达60％。
禽流感的传播途径有三条，一是通过空气传播，二是通过食物经消化道传播，三是通过损伤的皮肤和眼结膜传播。禽流感感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌肉酸痛等，严重者伴有肺炎，心、肾等多器官功能衰竭，导致死亡。禽流感病毒变异较频繁，所以人类至今仍未找到特异的防禽流感的手段。在治疗方面至今未找到特异性杀死禽流感病毒的新药，只是采取一些对症治疗的方法，如用解热药降低体温，用缓解鼻粘膜充血药减轻呼吸困难，用止咳祛痰药舒缓呼吸道等。在预防方面，虽然产生了疫苗，但因禽流感病毒变异很快，往往逃脱了疫苗产生抗体的捕杀。
禽流感的诊断试剂有琼脂扩散(AGP)试剂，ELISA免疫检测试剂，PCR基因诊断试剂。琼脂扩散检测试剂灵敏度较低，其检测对象是抗体，不能做早期诊断，因为感染后10天左右才能产生可检测抗体，检测到抗体也不能判定为当次感染所致，因为历次感染产生抗体在体内可存留半年时间。PCR检测试剂灵敏而准确，但需要较昂贵的PCR仪和较专门的技术人才，不便于推广应用。ELISA免疫检测试剂不需要附加设备，可在现场进行检测，免疫反应比较精准，操作简便而不需要专门人才。ELISA免疫检测试剂可分两种，一种是查抗体的，另一种是查抗原的。查抗体最大的缺点是不能做早期诊断，也不能判定为是当次感染所致，所以其检测结果对指导治疗意义不大。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)以H9亚型禽流感免疫原，免疫小鼠；
2)取免疫小鼠脾脏，制备免疫脾细胞悬液；
3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
4)对所述杂交瘤细胞进行筛选阳性克隆细胞；
5)对阳性克隆进行克隆化培养，获得A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
优选地，本发明所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6；最优选地，所述杂交瘤细胞株为1H7。
禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010；分类命名：禽流感病(H9)亚型单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期2013年07月24日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
优选地，本发明所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述H9亚型禽流感免疫原为H9亚型禽流感疫苗。
优选地，本发明所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述小鼠骨髓瘤细胞为Sp20小鼠骨髓瘤细胞株。
优选地，本发明所述A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法中，所述步骤3)中小鼠免疫脾细胞的浓度为1x108个/ml，所述小鼠骨髓瘤细胞的浓度为2～3x107个/ml。
本发明的另一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体，其中所述A型禽流感病毒单克隆抗体由禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1H7、1A7或1G6所分泌。
本发明的再一目的在于提供一种A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7，所述杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010。
本发明的又一目的在于提供一种A型禽流感免疫检测试剂盒，其中所述免疫试剂盒包括上述A型禽流感病毒单克隆抗体溶液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标抗体液、显色剂及洗涤液。因此，本发明提供了A型禽流感病毒单克隆抗体在禽流感临床检测中的应用。
我国迄今生产的畜禽病ELISA检测试剂盒，绝大部分都是查抗体的，禽流感ELISA检测试剂盒也不例外。用单克隆抗体建立禽流感ELISA免疫检测试剂盒更是未见报道。令人意外地，本申请的发明人成功制备了禽流感单克隆抗体，该抗体能和禽流感H9亚型和H5亚型产生免疫反应，由上以及后续实施例可知，本发明的A型禽流感病毒单克隆抗体及其制备方法，至少具有以下优点：
1)目前国内已有禽流感免疫检测试剂盒，但却是检测抗体的，不可避免存在以下缺点：a.不能做早期诊断。因为禽流感病毒感染后10天左右才能产生可检测抗体。b.检测阳性结果不能判定为当次感染，因为历次感染抗体可在体内存留半年左右。c.交叉反应不可避免。而本发明制备了效价高、特异性强的单克隆抗体，用其制备免疫检测试剂盒，可克服交叉反应问题；因为试剂盒检测对象是抗原，一旦感染即可检出，所以可做早期诊断；因为它检测对象是抗原，所以其阳性检测结果可判定为当次感染，或是带毒。
2)本发明虽然以H9亚型禽流感病毒抗原为免疫原，但是意想不到地，发明人发现本发明筛选获得的A型禽流感病毒单克隆抗体可以分别与禽流感H9亚型以及H5亚型产生特异性免疫反应，因此能够扩大了检测效力，能同时检测A型禽流感的几种亚型，减少了检测成本。
3)相比于ELISA检测试剂盒，以本发明的A型禽流感病毒单克隆抗体建立的禽流感ELISA免疫检测试剂盒，主要特点是灵敏、准确、操作简便，很快可报结果，无需任何附加设备，可做现场检测，采样无需抽血，不给动物造成损害。
附图说明
图1本发明实验例1A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图；
图2本发明实验例2A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图；
图3本发明实验例3A型禽流感免疫检测试剂盒的检测结果图.
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1A型禽流感病毒单克隆抗体的制备
1、用免疫原来免疫动物
选用H9亚型禽流感疫苗(兽药生字(2011)150132066)作免疫原，以Balb/C小鼠作为免疫动物，取雄性8周龄的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml禽流感疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次。
2、免疫脾细胞悬液的制备
①免疫第31天取免疫小鼠的脾细胞，放入盛有5ml不完全培养液(不加小牛血清的1640培养液)的平皿中，置200目的不锈钢网上，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃上清。
③用不完全培养液30ml倒入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动，使脾细胞重新变成悬液，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清。用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为1x108个/ml。
3、Sp20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备
选用Sp20小鼠骨髓瘤细胞株，购自第四军医大学细胞工程中心，按照以下步骤进行制备小鼠骨髓瘤细胞悬液：
①将SP20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养。
②将4瓶扩增培养的骨髓细胞收集到50ml离心管内。
③1000rpm离心5分钟，弃去上清。
④加入30ml不完全培养液，轻轻震动，使细胞重新垂悬于液体中，再经1000rpm离心5分钟，弃去上清。用不完全培养液将沉淀细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调至2～3x107。
4、免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合
按照下面步骤进行细胞融合：
①分别吸取含1x108个脾细胞悬液和2～3x107个小鼠骨髓瘤细胞悬液，加到50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇匀。
②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
③加体积浓度50％的融合剂聚乙二醇(PEG)溶液0.7ml。
④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
⑥加20ml的HAT培养液(含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的选择性培养液)，轻轻吸取沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
⑦将细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，将培养板放到37℃含CO2的体积浓度为5％的孵箱中培养。
5、抗体阳性孔检测阳性克隆抗体细胞
采用间接ELISA法，按照下面步骤进行筛选：
①用禽流感H9亚型病原体包被。
②加有克隆生长的孔中的培养上清100ul。
③加酶标抗鼠IgG抗体100ul。
④加底物100ul，室温避光显色10～20分钟。
⑤结果判定：在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆。
获得了3株能稳定分泌禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1H7,1A7和1G6。
6.阳性克隆细胞的克隆化培养
采用有限稀释法，按照下面步骤培养阳性克隆细胞株
将96孔培养板中被检测为抗体阳性的孔标记出来。用加样器将将孔内杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养，观察克隆生长，记录单克隆孔。并及时进行阳性检测。将阳性克隆孔的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞培养瓶中进行扩大培养。
将呈对数生长期的杂交瘤细胞收集于离心管，1000rpm离心10分钟，弃去上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，在﹣70℃低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。
7、腹水型单克隆抗体的制备
将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清备用。加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞浓度为1×106个/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，接种杂交瘤细胞后，7—14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清，即为腹水型单克隆抗体，分装后置于﹣20℃冰箱，冻存备用。
8.单克隆抗体的鉴定(采用ELISA法)
将所述步骤获得的三株能稳定分泌禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株1H7,1A7和1G6，分泌制备的腹水型单克隆抗体经效价检测，以上3种腹水型单克隆抗体的效价为1×10﹣4～1×10﹣6。结果见表1.
表1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体效价的检测结果
细胞株分泌的单抗 效价检测方法 检测结果
1H7 ELISA 10-4
1A7 ELISA 10-5
1G6 ELISA 10-5
特异性检测显示，1A7杂交瘤细胞产生的腹水型单克隆抗体除了禽流感病毒外，不和新城疫、鸡传染性支气管炎、鸭瘟、鸡支原体病的病原体发生交叉反应。说明其具有较强的特异性，可用其建立禽流感病的ELISA检测试剂盒。
另外，1A7杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，除了和H9亚型产生免疫反应外，还能和H5亚型发生免疫反应(效价为10-5)。用该抗体制备的免疫检测试剂盒能同时检出A型禽流感不同亚型禽流感病，即扩大了检测效力还降低了检测成本。结果见表2。
表2杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的交叉试验结果
其中，“+”表示阳性结果(即有特异性反应)，“-”表示阴性结果(即无交叉反应)。
实施例2A型禽流感免疫检测试剂盒的制备
1、按照以下组成制备A型禽流感免疫检测试剂盒
24孔培养板 一块
采样管 22只
滴管 25只
棉拭子 22只
检测液如下：
①样本稀释液(0.85M，PH9.6的碳酸缓冲液)25ml
②阳性对照液(含H9和H5亚型疫苗的样本稀释液)0.5ml～1ml
③阴性对照液(含有非相关蛋白，如正常牛血清，的样本稀释液)0.5ml～1ml
④禽流感单克隆抗体(含有1：3000至1：5000 1A7杂交瘤细胞产生的腹水型单克隆抗体的PBS)液体2.5ml～3ml
⑤酶标抗体液(含1：100的酶标抗体的PBS)2.5ml～3ml
⑥显色剂A(含有0.045％过氧化氢的PH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)2.5ml～3ml
⑦显色剂B 5mg邻苯二胺干粉
⑧洗涤液(含有0.05％Tween-20的PH7.4的PBS)35ml×4
2、A型禽流感免疫检测试剂盒的检测方法
1样本采集用棉拭子采集病禽的分泌物(口、鼻、泄殖腔分泌物)，放入采样管内，加入20滴样本稀释液，充分搅动棉拭子，使样本充分游离到稀释液中，然后按后续操做步骤操作。(如无条件进行后续步骤操作，可将样本置于2-8℃冷藏保存，24小时可用，或是﹣20℃冷冻保存，4周内可用)。
2 ELISA反应操作步骤
a.将采集有样本的小管按顺序从1到22写上编号。
b.取出24孔培养板，用滴管将样本管的样本液按顺序分别加到培养板的小孔内，每个小孔分别加两滴样本液，从1～22小孔，一次可加22个样本。第23号小孔加入①液(阳性对照液)两滴，第24号小孔加②液(阴性对照液)两滴。在常温下静置40·60分钟，甩去孔内液体。
c.向培养板各小孔加入⑦号液(洗涤液)每孔5滴，静置2～3分钟，甩去孔内液体，再重复两次，最后拍干孔内残留液体。
d.向各小孔加④液(禽流感单克隆抗体液)两滴，在常温下静置20～40分钟，甩去孔内液体。
e.重复c步骤。
f.向各小孔加⑤液(酶标抗体液)各两滴，在常温下静置30～40分钟，甩去孔内液体。
g.同c步骤，但共重复5次。
h.将⑥A液倒入⑥B管，拧紧盖子，震荡B管，待粉剂完全溶解后，加到培养板各小孔内，每孔两滴。加液后，常温下避光静置15～20分钟。
3结果判定
在白色背景下，观察小孔颜色。如果操作无误，第23号小孔为阳性对照孔应呈橙黄色，第24号小孔为阴性对照孔，应呈无色或接近无色。第1～22号小孔，如呈橙黄色，表明样本为禽流感阳性反应，若为无色或接近无色，表明样本为阴性反应。
以下以三个不同鸡场检测结果说明该试剂盒在临床检测中应用：
实验例1.西安市蓝田县某鸡场500只无病毒携带雏鸡，随机抽取22羽雏鸡口腔粘液，按实施例1制备试剂盒使用方法进行检测，结果如图1所示：
如图1的结果显示：23号阳性对照空呈黄色为阳性反应，24号阴性对照孔不显色，呈阴性反应。说明试剂盒性能正常，操作正确。1～22号孔呈无色为阴性反应，说明刚引进的雏鸡无禽流感感染。
实例2.西安市长安区某肉鸡养殖场于2012年秋天突然发现鸡群不吃东西，继而发现有鸡死亡，经确定100只患禽流感鸡群，按照本发明实施例1方法检测是否是禽流感。
随机抽取22例鸡的口腔粘液按实施例1制备试剂盒的使用方法进行操作，结果如下：
如图2的结果所示，23号阳性对照孔呈黄色为阳性反应，24号阴性对照孔呈无色为阴性反应，说明操作正确。1～22孔中除了5号和12号孔外，均呈黄色为禽流感阳性反应。说明该鸡群已感染禽流感，建议按政策进行处置。
实验例3.西安市户县一蛋鸡养殖场，2015年春，发现鸡群食量减少，产蛋量下降，经过病毒检验发现为新城疫感染，随机抽取22羽鸡口腔粘液，按实施例1的试剂盒使用方法进行操作。
如图3的结果所示：23号阳性对照孔呈黄色为阳性反应，24号阴性对照孔呈无色为阴性反应，说明操作及试剂盒反应正确。1～22孔也呈无色为阴性反应，说明蛋鸡群不是禽流感感染，符合病毒检验结果。。
附相关试剂生产厂家及购买渠道：
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以H9亚型禽流感免疫原，免疫小鼠；
2)取免疫小鼠脾脏，制备免疫脾细胞悬液；
3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
4)对所述杂交瘤细胞进行筛选阳性克隆细胞；
5)对阳性克隆进行克隆化培养，获得A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
2.根据权利要求1所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株1H7、1A7和1G6。
3.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为1H7。
4.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述H9亚型禽流感免疫原为H9亚型禽流感疫苗。
5.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞为Sp20小鼠骨髓瘤细胞株。
6.根据权利要求2所述的A型禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中小鼠免疫脾细胞的浓度为1x108个/ml，所述小鼠骨髓瘤细胞的浓度为2～3x107个/ml。
7.一种A型禽流感病毒单克隆抗体，其特征在于，所述A型禽流感病毒单克隆抗体由禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7所分泌，所述禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010。
8.一种A型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7，其特征在于，所述禽流感单克隆抗体杂交瘤细胞株1A7的生物保藏号为CGMCC NO.8010。
9.一种A型禽流感免疫检测试剂盒，其特征在于，所述免疫试剂盒包括如权利要求1所述的A型禽流感病毒单克隆抗体溶液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标抗体液、显色剂及洗涤液。
10.一种如权利要求7所述的A型禽流感病毒单克隆抗体在禽流感临床检测中的应用。
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