CN104250304A - 一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用。该融合蛋白包括假单胞杆菌毒素A结构域I与II、禽流感病毒HA2蛋白及羧基末端部分。其中，所述HA2蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7；所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列可为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13。本发明还公开了含免疫量的禽流感融合蛋白的疫苗组合物及其在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感药物中的应用。该禽流感疫苗组合物能同时产生细胞免疫和体液免疫；还对H9亚型的禽流感均能产生保护性免疫，具有广谱性。

Description

一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品，特别是涉及一种融合蛋白及其编码的疫苗组合物与应用。

背景技术

禽流感（Avian influenza，AI）是禽流行性感冒的简称，由禽流感（Avian influenza virus，AIV）引起的多种禽类感染的急性呼吸道传染病，也能感染人类，被国际兽医局（OIE）和我国《家畜家禽防疫条例》列为A类烈性传染病。

流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，含有囊膜、为多形态的负链RNA病毒。根据流感病毒内部核蛋白（Nucleoprotein，NP）和基质蛋白（Matrix protein，MP）抗原及其基因特性的不同，可将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三种类型，其中，能够引起大流行的流感病毒主要是甲型。禽流感即为甲型流感病毒，其基因组共由8个单独的负链RNA片段组成，由片段1至片段8依次为PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS。根据位于禽流感囊膜上的血凝素HA（Hemagglutinins，由禽流感基因组的第4个片段编码）和神经氨酸酶NA（Neuraminidase，由禽流感基因组的第6个片段编码）抗原性的不同，禽流感可分为若干个亚型，目前已知的HA有16个亚型（H1-H16）、NA有9个亚型（N1-N9），这两种不同的亚型之间可以进行自由组配，从而形成一个庞大而复杂的禽流感家族。正是由于流感病毒基因组自身的特点决定了其不断发生抗原漂移和抗原转换，从而使得新的流行毒株不断出现。目前，禽流感主要以H9亚型最为流行，感染后的舍饲禽（包括家禽）可表现为亚临床症状、轻的呼吸系统感染到无症状带毒等多种流行形式，不仅使家禽业遭受危机，还导致预防、控制禽流感疫情面临严峻的挑战。

截止到目前，接种疫苗仍然是预防和/或控制禽流感大流行的最有效手段。而且，面对禽流感的不断变异，制备H9亚型通用流感疫苗已博得世界各国科学家和疫苗生产公司的青睐，所谓的H9亚型通用流感疫苗是指一种能够预防H9亚型所有流感病毒毒株，并可诱导持久性和保护性免疫的流感疫苗。

发明内容

本发明提供了一种新型的禽流感融合蛋白，以及含免疫量的禽流感融合蛋白的疫苗组合物及其应用。该疫苗组合物既能同时产生细胞免疫和体液免疫，又能对H9亚型禽流感病毒产生保护性免疫，具有广谱性。

本发明的主要目的在于提供一种禽流感融合蛋白，所述禽流感融合蛋白包含：

（1）假单胞杆菌毒素A结构域I，

（2）假单胞杆菌毒素A结构域II，

（3）禽流感病毒HA2蛋白，以及

（4）羧基末端部分；

其中，所述禽流感病毒HA2蛋白位于假单胞菌外毒素A结构域II与羧基末端部分之间，且假单胞杆菌毒素A结构域II位于假单胞杆菌毒素A结构域I与所述禽流感病毒HA2蛋白之间。

优选地，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列与序列SEQ IDNO.3具有至少90%的同源性，或者至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

本发明所用术语“同源性”是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸（或核苷酸）序列与参比氨基酸（或核苷酸）序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核苷酸）数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核苷酸）序列之间相同氨基酸（或核苷酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件（在美国国立生物技术信息中心NCBI的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990);Stephen F.et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)），ClustalW2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，或者见，例如，Higgins D.G.et al.,Methods in Enzymology,266:383-402(1996);LarkinM.A.et al.,Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-2948(2007)）；和Tcoffee软件（在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al.,Nucleic Acids Res.,31(13):3503-3506(2003);Notredame C.et al.,J.Mol.Boil.,302(1):205-217(2000)）等。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

进一步优选地，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列可为SEQID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。

更优选地，所述禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列依次为SEQID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8。

优选地，所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列可为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQID NO.12或SEQ ID NO.13。

本发明所述的羧基末端部分为KDEL家族蛋白中的成员。所用术语“KDEL家族蛋白”是指一组蛋白质，其具有与细胞内质网膜结合的相似羧基端，并进一步具有可将该蛋白质留存于内质网腔中以实现醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片段。通常，该羧基端的长度介于4-16个残基之间。根据针对存在于不同分子中且执行特定生物机能的相似序列所做的研究显示：一种可在内质网中留存新形成蛋白的序列为Lys Asp Glu Leu（KDEL）（SEQ ID NO.9）。从而说明：根据这一发明的融合抗原的羧基端上的序列可作为某种类型的识别序列，协助融合抗原从内吞区室易位至内质网内，并将其留置于内质网腔内。在一个较佳的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL的序列如SEQ ID NO.9所示。在一个更理想的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL（SEQ ID NO.10）或KKDL-RDEL-KDEL的序列（SEQ ID NO.11）、KKDELRDELKDEL的序列（SEQ ID NO.12）或KKDELRVELKDEL的序列（SEQ ID NO.13），其中R为D或V。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述的禽流感融合蛋白的方法，所述制备方法包括：通过基因工程手段分别获得所述PEA基因、所述HA2基因，将其分别连接至克隆载体以获得PEA克隆载体、HA2克隆载体；通过PCR方法在构建的所述HA2基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并连接至克隆载体以获得HA2-KDEL克隆载体；将构建的所述HA2-KDEL克隆载体、所述PEA克隆载体通过酶切，构建同时包含PEA、HA2-KDEL基因的克隆载体，即禽流感融合蛋白的克隆载体；将构建的所述禽流感融合蛋白的克隆载体、表达载体通过酶切，构建同时包含PEA、HA2-KDEL基因的表达载体，即禽流感融合蛋白的表达载体；将所述禽流感融合蛋白的表达载体导入受体菌进行诱导表达，并对表达的禽流感融合蛋白进行纯化和鉴定以获得禽流感融合蛋白。

优选地，所述基因工程手段是指运用分子生物学方法获得所述PEA基因、所述HA基因，进一步优选为通过PCR方法扩增PEA基因，通过RT-PCR方法扩增HA2基因；优选地，所述克隆载体为分子生物学可接受的克隆载体，进一步优选为pMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、pBR322；优选地，所述表达载体为pET，进一步优选为pET-28a、pET-32a；所述受体菌为大肠杆菌，进一步优选为Bal21。

本发明的再一目的在于提供一种用于预防H9亚型禽流感感染的疫苗组合物，包括一免疫量的所述禽流感融合蛋白和/或一兽医学上可接受的佐剂。

优选地，所述禽流感疫苗组合物单位剂量中含所述禽流感融合蛋白组分的含量为5-50μg，优选为10-40μg。

本发明所述禽流感疫苗组合物中，较佳地还可包括一兽医学上可接受的佐剂，所适用的免疫佐剂不限，可以是任何一种常用于疫苗的佐剂，包括油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、丙烯酸聚合物佐剂、水性佐剂、脂质体中的一种或几种。

本发明所用术语“丙烯酸聚合物佐剂”为至少含有丙烯酸聚合物的佐剂溶液；优选地，所述丙烯酸聚合物还可为丙烯酸聚合物、可代谢油的混合物；更优选地，所述丙烯酸聚合物为均聚物或共聚物，进一步优选为Carbopol。

本发明所用术语“水性佐剂”又称“水佐剂”、“水基佐剂”或“水溶性佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，滴入水中能迅速与水混溶。

本发明还提供了所述禽流感融合蛋白及所述禽流感疫苗组合物在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感药物中的应用。

本发明在制备用于保护动物免患H9亚型禽流感所引起疾病的禽流感疫苗组合物中的应用时，所用禽流感疫苗组合物的免疫量为0.3mL/羽。

所述的禽流感疫苗组合物在给予免疫动物时，可以通过肌肉注射、皮下注射、口服途径、静脉注射或点眼、滴鼻途径，优选为通过皮下注射或肌肉注射。

基于此，本发明具有以下突出的优点：

（1）本发明所述的禽流感融合蛋白是通过基因工程手段获得的，易于大规模生产，便于储存；

（2）本发明所述禽流感疫苗组合物所含抗原的主要组分为禽流感融合蛋白，而该融合蛋白包含HA2蛋白，能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫；

（3）本发明所述的禽流感疫苗组合物具有广谱性，能抗H9亚型的禽流感，免疫动物后可诱导动物产生抗H9亚型禽流感的抗体。

序列表中：

序列1为假单胞杆菌毒素A结构域I与II的氨基酸序列；

序列2为假单胞杆菌毒素A结构域I与II的核苷酸序列；

序列3为禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列1；

序列4为禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列1；

序列5为禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列2；

序列6为禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列2；

序列7为禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列3；

序列8为禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列3；

序列9为羧基末端部分的氨基酸序列1；

序列10为羧基末端部分的氨基酸序列2；

序列11为羧基末端部分的氨基酸序列3；

序列12为羧基末端部分的氨基酸序列4；

序列13为羧基末端部分的氨基酸序列5；

序列14为羧基末端部分的核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所用术语“假单胞杆菌毒素A结构域I”是指与假单胞杆菌毒素A的氨基末端细胞受体结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。

本发明所用术语“假单胞杆菌毒素A结构域II”是指与假单胞杆菌毒素A的中间易位结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。

本发明所用术语“免疫量”是指提供针对禽流感疫苗组合物的免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。

本实施例中所用的禽流感HA2蛋白的序列，来源于已报道的禽流感H9亚型分离株，在NCBI中的登录号为DQ064366.1、CY102744.1、CY144539.1。

本实施例通过基因工程手段，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，从而获得禽流感融合蛋白，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例以油佐剂作为佐剂制备禽流感疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本实施例中所用的攻毒毒株为H9亚型禽流感抗原HL株（见文献：孙进忠等，禽流感病毒（H9N2亚型，HL株）与国内部分省禽流感病毒（H9亚型）流行株抗原相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38）、禽流感病毒SZ株（Avian influenzavirus(H9 subtype)strain SZ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，保藏编号为CCTCCNO:V201240）。

下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 禽流感病毒融合蛋白克隆载体的构建

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）报道的假单胞杆菌毒素A（Pseudomonas aeruginosa PAO1，登录号：AE004091）、禽流感中国分离株中的HA蛋白（登录号为DQ064366.1）中的基因序列（详情依次见SEQ ID No.2、SEQ ID NO.4），用PCR方法扩增假单胞杆菌毒素A（PEA）结构域I与II，用RT-PCR方法扩增禽流感HA2蛋白；并用连续PCR的方法扩增羧基末端部分含KDEL多肽的基因（SEQ ID NO.12）。克隆完成后，通过基因工程手段将它们串联起来，作为禽流感病毒的融合蛋白。

1.1 PEA结构域I与II、HA2基因克隆载体的构建及鉴定

根据选取的PEA结构域I与II、HA2蛋白的核苷酸序列，即SEQID No.2、SEQ ID NO.4，用PCR方法对其进行扩增。其中，PEA基因的上、下游引物分别添加BamHI和SalI酶切位点，引物设计如下：

上游引物：5′-CGGGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3′，

下游引物：5′-GCGTCGACGCCGTCGCCGAGGAACT-3′；

HA2基因上、下游引物分别添加SalI和SphI酶切位点，引物设计如下：

上游引物：5′-GCGTCGACGGACTATTTGGTGCCATAGC-3′，

下游引物：5′-ACATGCATGCTATACAAACGTTGCATCTGCAAGAT-3′。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，52℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。

将获得的PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果显示：分别在1200bp、660bp附近出现相应的目的条带，与PEA结构域I与II片段、HA2片段的大小相符。

将目的片段分别使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并将回收后的目的基因片段分别连接至pMD18-T载体，以构建pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2克隆载体，连接体系为：目的基因20μL、pMD18-T载体0.5μL、连接酶缓冲液2.0μL、T4DNA连接酶1.0μL、灭菌双蒸水8.5μL；反应条件为：16℃、30min。将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰上放置30min，然后42℃加热45s，置冰上1min，加入890μL的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板，37℃培养过夜。观察结果显示：LB固体培养基均出现白色小菌落。

挑典型菌落，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，200rpm培养10h。使用质粒回收试剂盒提取各转化菌质粒，分别命名为pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2，并进行酶切鉴定。酶切鉴定结果显示：pMD18-T-PEA酶切后，出现2600bp左右的载体片段和1200bp左右的PEA片段；pMD18-T-HA2酶切后，出现2600bp左右的载体片段和660bp左右的HA2片段。

将酶切正确的质粒送基因公司测序，测序结果表明：扩增序列分别为PEA基因和HA2基因，且目的基因和载体连接正确。

1.2 pMD18-T-HA2-KDEL克隆载体的构建及鉴定

通过连续的PCR，将SEQ ID NO.14（编码KKDELRVELKDEL，即SEQ ID NO.13）中的基因连接至HA2基因末端，构建SphI位点-KKDELRVELKDEL-终止密码子-HindIII序列的多核苷酸。将该多核苷酸序列克隆至pMD18-T载体，获得pMD18-T-HA2-KDEL。使用SalI、HindIII双酶切鉴定，并送基因公司进行测序，表明pMD18-T-HA2-KDEL构建正确。

1.3 pMD18-T-PEA-HA2-KDEL克隆载体的构建和鉴定

构建的pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2-KDEL分别使用SalI和HindIII进行双酶切，使用DNA凝胶回收试剂盒，将pMD18-T-PEA、HA2-KDEL片段回收，使用DNA连接试剂盒将pMD18-T-PEA、HA2-KDEL进行连接，构建pMD18-T-PEA-HA2-KDEL。将构建载体使用BamHI、HindIII双酶切鉴定，鉴定结果显示：酶切后，出现2600bp的载体片段和1900bp左右的目的条带；并将阳性质粒送基因公司进行测序分析，测序结果表明：禽流感融合蛋白pMD18-T-PEA-HA2-KDEL连接成功。

实施例2 禽流感融合蛋白表达载体的构建及鉴定

将pMD18-T-PEA-HA2-KDEL、pET-28a，分别使用BamHI、HindIII双酶切，回收PEA-HA2-KDEL、pET-28a载体片段，连接，构建pET-28a-PEA-HA2-KDEL表达载体。然后，将pET-28a-PEA-HA2-KDEL载体导入Bal21感受态细胞，并使用BamHI、HindIII双酶切鉴定，鉴定结果显示：酶切后，出现5300bp左右的载体片段和1900bp左右的目的条带；并将阳性质粒送基因公司进行测序分析，测序结果表明：禽流感融合蛋白pET-28a-PEA-HA2-KDEL构建正确。

实施例3 禽流感融合蛋白的表达、鉴定及纯化

3.1 禽流感融合蛋白的表达及鉴定

将含pET-28a-PEA-HA2-KDEL质粒的Bal21菌，按1%（V/V）接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养5h，取样进行SDS-PAGE电泳，使用鸡抗H9亚型禽流感病毒阳性血清进行Western blot鉴定。

结果显示：相对于对照，含pET-28a-PEA-HA2-KDEL质粒的Bal21菌经IPTG诱导5h，在80KDa附近出现相应的目的条带，主要存在于包涵体中。Western blot结果表明：该重组蛋白可与抗禽流感阳性血清发生特异性结合反应。

3.2 禽流感融合蛋白的纯化

使用Ni⁺亲和层析柱对上述表达产物进行纯化。将含pET-28a-PEA-HA2-KDEL质粒的Bal21菌，按1%（V/V）接种量接种含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌OD₆₀₀在0.6-1.0之间，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续培养5h后，收集细菌进行超声破碎，8000rpm离心30min，收集沉淀，使用包涵体溶解液溶解后，使用Ni⁺亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，透析蛋白使用紫外分光光度计测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE对其纯度进行鉴定。

鉴定结果表明：禽流感融合蛋白，即重组PEA-HA2-KDEL蛋白，经Ni⁺亲和层析柱纯化，透析后得到浓度为200μg/mL的含禽流感融合蛋白溶液，将其作为禽流感融合蛋白的储备液；SDS-PAGE电泳后，仅在80KDa附近出现条带。

将鉴定合格后的禽流感融合蛋白（将其命名为禽流感融合蛋白1）使用冷冻干燥机进行冻干，以便长期保存。

实施例4 禽流感融合蛋白的制备

依次参照禽流感H9亚型分离株中的HA蛋白（登录号为CY102744.1、CY144539.1）中的基因序列（详情依次见SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8），并按照实施例1-3的方法即通过PCR方法分别获得PEA基因、HA2基因，将其分别连接至克隆载体以获得PEA克隆载体、HA2克隆载体；通过PCR方法在构建的HA2基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并连接至克隆载体以获得HA2-KDEL克隆载体；将构建的HA2-KDEL克隆载体、PEA克隆载体通过酶切，构建同时包含PEA、HA2-KDEL基因的克隆载体，即禽流感融合蛋白的克隆载体；将构建的禽流感融合蛋白的克隆载体、表达载体通过酶切，构建同时包含PEA、HA2-KDEL基因的表达载体，即禽流感融合蛋白的表达载体；将所述禽流感融合蛋白的表达载体导入大肠杆菌Bal21进行诱导表达，并对表达的禽流感融合蛋白进行纯化和鉴定，分别制得禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3。

同时，将透析后得到浓度为200μg/mL的，且分别含禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3的溶液，将其作为禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3的储备液。将鉴定合格后的禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3使用冷冻干燥机进行冻干，以便长期保存。

实施例5 不含佐剂和含油佐剂的禽流感疫苗组合物的制备

5.1 不含佐剂的禽流感疫苗组合物的制备

将实施例3、实施例4制备的200μg/mL禽流感融合蛋白的储备液，用生理盐水进行稀释，使其含禽流感融合蛋白的终浓度均为25μg/mL，依次编码为疫苗1-1、疫苗2-1、疫苗3-1，2-8℃保存备用。

5.2 含油佐剂的禽流感疫苗组合物的制备

取注射用白油94份，加司本-80 6份混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌至透明为止，高压灭菌后备用，即为油相。

将实施例3、实施例4所制备的200μg/mL禽流感融合蛋白的储备液分别进行稀释，使其含禽流感融合蛋白的浓度均为75μg/mL禽流感抗原液，分别于无菌容器中，加入4%灭菌并冷却后的吐温-80，边加边搅拌，使吐温-80完全溶解为止，即为水相1、水相2、水相3。

乳化机的转子先用0.5%甲醛溶液浸泡消毒4h以上，使用前以热的无菌蒸馏水冲洗干净。取油相2份置乳化器内，开动电机搅拌，然后依次分别徐徐加入1份水相1、水相2、水相3，再以17500r/min乳化5min即可。在乳化终止前加入1%硫柳汞钠，使其终浓度为0.01%。制备的疫苗即为含油佐剂的25μg/mL禽流感融合蛋白的疫苗组合物，将其依次编码为疫苗1-2、疫苗2-2、疫苗3-2，于2-8℃保存备用。

实施例6 动物实验

选取3周龄的SPF鸡65只，随机挑选5只作为空白对照，其余60只随机分成6组，10只/组，分别经肌肉注射实施例5制备的不含佐剂和含油佐剂的禽流感疫苗组合物、生理盐水（作为空白对照），注射剂量0.3mL/羽。

于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分别采集并分离各试验组的血清，并利用ELISA检测血清中的禽流感抗体水平，检测结果见表1。

表1 不同时间段各试验组禽流感抗体水平的检测结果汇总

由表1可知：各试验组的禽流感疫苗组合物免疫后的抗体滴度均于免疫后第15天开始上升，并于第30天达到最大值；平行比较同样禽流感融合蛋白含量的疫苗组合物，可见含油佐剂的禽流感疫苗组合物（即疫苗1-2、疫苗2-2、疫苗3-2）产生较高的抗体水平，其次为不含佐剂的疫苗组合物，而空白对照组未产生特异性抗体。

实施例7 攻毒保护试验

选取3周龄的SPF鸡130只，随机挑选10只作为空白对照，其余120只随机分成12组，10只/组，分别经肌肉注射实施例5制备的不含佐剂和含油佐剂的禽流感疫苗组合物、生理盐水（作为空白对照），注射剂量0.3mL/羽。

免疫后第21天，通过静脉注射H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株，分别对每个免疫组和对照组进行攻毒，攻毒剂量为0.2mL/羽，攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头、泄殖腔拭子，混合后称为混合样，经尿囊腔接种10-11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中有1枚或大于1枚鸡胚的鸡胚液的HA效价≥1:16（微量法），即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。成功免疫时免疫组应至少有9只鸡病毒分离阴性，对照组应全部为阳性。结果详情见表2。

表2 禽流感病毒HL株攻毒保护试验

由表2可知：免疫后第21天，除生理盐水对照组外，各免疫组的保护率均≥90%，可完全抵抗禽流感H9亚型抗原HL株、SZ株的攻击，均可获得完全保护。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，包含：

（1）假单胞杆菌毒素A结构域I，

（2）假单胞杆菌毒素A结构域II，

（3）禽流感病毒HA2蛋白，以及

（4）羧基末端部分。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQID NO.7。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列可为SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述禽流感病毒HA2蛋白位于假单胞菌外毒素A结构域II与羧基末端部分之间，且假单胞杆菌毒素A结构域II位于假单胞杆菌毒素A结构域I与所述禽流感病毒HA2蛋白之间。

5.一种制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：通过基因工程手段，依次构建所述融合蛋白的克隆载体、表达载体，并对所述融合蛋白进行表达、纯化及鉴定。

6.一种用于预防H9亚型禽流感感染的疫苗组合物，包括一免疫量的如权利要求1所述融合蛋白和/或一兽医学上可接受的佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物单位剂量中含所述融合蛋白的含量为5-50μg。

8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物单位剂量中含所述融合蛋白的含量为10-40μg。

9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂包括油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、丙烯酸聚合物佐剂、水性佐剂、脂质体中的一种或几种。

10.权利要求6-9任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗H9亚型禽流感药物中的应用。