CN104911150A - 一种h3n2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞工程技术领域，公开了一种H3N2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用。所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555；其分泌的单克隆抗体与H3N2亚型犬流感病毒血凝素特异性结合，亲和力高，纯化后效价为1：320,000，它与CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒均不发生反应。通过注射本发明所述单克隆抗体用于预防和控制流感病毒的感染，与传统的疫苗接种手段相比，特异性更强，风险更低，安全性更高。具有实际的应用价值。

Description

一种H3N2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，更具体地，涉及一种H3N2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用。

背景技术

犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科A型流感病毒(IAV)属犬流感病毒(CIV)引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病。该病首次于2004年在美国爆发，随后在欧亚大陆等地区相继报道。CI主要分为H3N2和H3N8两种亚型，欧美以H3N8亚型为主，大部分亚洲国家以H3N2亚型为主。近十多年来，IAV不断突破种间束缚，在人和动物中交叉感染，引起了人们对流感的普遍关注。

犬是与人类接触最为亲密的动物之一，可能在流感传染过程中扮演着重要角色。因此，需要加强对CI的研究；申请号为201410535918.6的中国专利公开了针对H3N2亚型犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，它是以犬流感病毒分离株JS/10制备杂交瘤细胞后获得，现有技术对于H3N2犬流感病毒的研究较少，不利于临床研究与发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的第二个目的是提供一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供含有上述单克隆抗体的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供上述单克隆抗体的应用。

本发明的第五个目的是提供基于上述单克隆抗体的免疫检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株H3N2-CIV-HA-2C5，所述细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC C201555，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。

上述杂交瘤细胞株的制备方法：取血清效价符合融合要求的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-1000进行融合；用HAT培养基筛选融合细胞，用纯化后的H3N2CIV包被酶标板，采用间接ELISA方法筛选目的融合细胞；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

由上述杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体；所述单克隆抗体为IgG2a亚型，轻链为Kappa链。

所述单克隆抗体的制备方法：应用保藏编号为CCTCC C201555的杂交瘤细胞株，以1×10⁶/只的量注入经FICA处理的8～10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用琼脂糖亲和介质(Protein A)纯化腹水获得。

血凝素(HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，参与病毒结合细胞受体以及病毒与靶细胞膜融合。流感病毒只有当HA裂解为HA1和HA2时才能发挥病毒感染作用，因此，制备针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗体被作为评价流感病毒保护性的标准，本发明所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体为抗H3N2CIV HA的抗体。

另外，本发明还提供含有上述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒可用于检测流感病毒。

上述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应用。

上述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中的应用。

上述单克隆抗体在检测流感病毒中的应用。

本发明还提供基于上述单克隆抗体的免疫检测方法

优选地，上述流感病毒为犬流感病毒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555；其分泌的单克隆抗体与H3N2亚型犬流感病毒血凝素特异性 结合，亲和力高，纯化后效价为1：320,000，它与CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒均不发生反应。通过注射本发明所述单克隆抗体用于预防和控制流感病毒的感染，与传统的疫苗接种手段相比，特异性更强，风险更低，安全性更高。具有实际的应用价值。

附图说明

图1为H3N2CIV浓缩纯化结果图。

图2为杂交瘤细胞第7d生长状态图。

图3为小鼠腹水与兔血清纯化效果图；M：蛋白质分子量标准；A：纯化后的兔血清效果图；B：纯化后小鼠腹水。

图4为单克隆抗体亚型鉴定结果；a：2C5分泌的McAb亚型检测结果；b：试纸条标准显色条带说明。

图5为单克隆抗体间接免疫荧光鉴定结果；a：H3N2CIV感染的MDCK细胞；b：阴性对照。

图6为单克隆抗体WB试验鉴定结果；a：真核表达的H3N2CIV NP、HA、PB1、PB2、PA鉴定结果；b：真核表达的H3N2CIV NS2、M2、M1、NA鉴定结果；M：蛋白质分子量标准；C：未转染质粒的正常293T细胞对照组。

图7为阴性鸡胚尿囊液正态分布图。

图8为双抗夹心ELISA敏感性试验。

图9为双抗夹心ELISA特异性试验。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1杂交瘤细胞株的制备

一、H3N2亚型犬流感病毒的抗原制备

本发明所用的毒株A/canine/Guangdong/1/2006(H3N2)(简称CGD1)，其Genbank的登陆号为GU433345.1、GU433346.1、GU433347.1、GU433348.1、GU433349.1、GU433350.1、GU433351.1、GU433352.1，毒株及其序列参照网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝A％2Fcanine％2FGuangdong％2F1％2F 2006％28H3N2％29。

1、病毒扩大培养：将稀释后的CGD1毒株鸡胚尿囊液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量为0.15mL/胚，37℃孵育。每12h观察一次，弃24h内死亡鸡胚，将24h后的死胚置于4℃冰箱保存。96h后将所有鸡胚于4℃冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，10,000r/min，离心10min，去沉淀留上清。参照国标方法(GB/T 14926.53-2001)，取少量尿囊液上清测定血凝单位(HAU)，其余尿囊液上清于4℃暂存备用。

2、病毒的灭活：在H3N2CIV尿囊液上清中加入体积分数约0.1％的甲醛溶液，充分混匀，4℃灭活3d，每隔1d充分振荡1次。测定灭活病毒液的HAU，尿囊液置4℃保存。

3、病毒的纯化：a.将灭活的病毒液转入超离心管(超离心管内不能有气泡，应完全装满，以免离心过程中爆管)，35,000r/min离心1h；b.及时弃上清，抽干离心管底部残留上清。用已高压的2mL PBS重悬病毒沉淀，将重悬液转移至新EP管中备用；c.把不同浓度的蔗糖加入密度梯度离心管(总体积12mL)中，先加15％蔗糖溶液2mL，再顺序加入30％、45％蔗糖溶液各4mL，每次加蔗糖溶液时应将针头完全置于管底，用较高浓度蔗糖溶液将较低浓度蔗糖溶液抬升。把步骤b的重悬病毒液1mL加至蔗糖溶液最上层，35,000r/min下离心2h；d.在光线明亮处，小心吸取各浓度蔗糖层面交界处纯化产物，分别置于不同超离心管中，加满PBS，35,000r/min下离心2h，去蔗糖；e.弃上清，加入PBS重悬沉淀，各管重悬液吸出后分别转移至新高压EP管中，通过HA试验确定病毒粒子的分布。用分光光度计测定纯化病毒(H3N2CIV)蛋白浓度后，-20℃保存备用。

实验结果：共收集到鸡胚尿囊液约600mL，HAU为2⁸，0.1％甲醛灭活后HAU下降一个单位，为2⁷。H3N2CIV主要存在于30％与45％蔗糖层面交界处，有许多小颗粒物分布，呈白色条带。去蔗糖后，可见浓缩纯化的H3N2CIV呈黄白色斑块，如图1。试验共获得4mL病毒悬液，HAU为1：3,200，分光光度计测得蛋白浓度为1.65mg/mL；在其它各浓度蔗糖层面也发现流感病毒存在，但HAU均相对较低。

4、小鼠免疫程序

将纯化好的H3N2CIV免疫3只雌性8周龄BALB/c小鼠，共免四次(如表1)。首次免疫使用FCA与纯化的H3N2CIV以1：1超声乳化，取0.3mL腹腔注射。在第14d和第28d分别进行加强免疫时，以FICA与纯化的H3N2CIV按1：1混合，免疫剂量和免疫方式与首免相同。三免结束后尾尖采血，分离血清，用间接ELISA方法测其抗体效价。细胞融合的前3d对抗体效价最高的小鼠腹腔注射纯化好的H3N2CIV 0.3mL进行第四次免疫，3d后取小鼠脾脏进行细胞融合。

表1 小鼠免疫程序

5、间接ELISA最佳H3N2CIV包被浓度的确定

a.包被：将纯化的H3N2CIV按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1,600的比例用包被液稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔。以包被液作空白对照，4℃过夜孵育后，弃包被液，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)。

b.封闭：用含0.5％PVA的封闭液，200μL/孔，37℃封闭1h后，弃封闭液，PBST洗涤3次(200μL/孔，2min/次)。

c.加样：BALB/c小鼠阳性血清作一抗，以PBST按1：200、1：400、1：800、1：1,600、1：3,200、1：6,400的比例系列梯度稀释；小鼠阴性血清以相同比例稀释，作为阴性对照，100μL/孔，37℃孵育1h后，弃一抗，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)。

d.孵育二抗：加1：10,000稀释的Goat anti-Mouse IgG(H&L)-HRP二抗，100μL/孔，37℃孵育，进行ELISA方阵试验。1h后，弃二抗，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)。

e.显色：加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min。

f.加终止液：加入2M H₂SO₄终止显色反应，100μL/孔。

g.测OD值：迅速用提前30min预热的酶标仪进行双波长检测，参考波长设定为630nm，测定OD_450nm值。

间接ELISA试验结果的判断标准：(1)抗原最适包被浓度的确定：阴性对照的A值在0.2左右，阳性孔的A值在1.0左右，且P/N值最大。P/N＝(阳性值－空白值)/(阴性值－空白值)。

(2)待检样品阴阳性的确定：待检样本P/N≥2.1为阳性，反之为阴性。

(3)待检样品ELISA效价的确定：待检样品按不同方式梯度稀释后，测定各孔的OD值，以P/N≥2.1时的最大稀释度仍出现阳性反应的最大稀释度作为待检样品ELISA效价。

实验结果：根据方阵试验所得结果确定，H3N2CIV最适包被浓度为8.25μg/mL(200倍稀释)(表2)。以此浓度H3N2CIV包被酶标板，测定3免后7d小鼠血清抗体效价。将采集的小鼠血清从1：5,000倍比稀释至1：320,000，测得效价均在1：80,000以上，抗体水平达到融合需要(表3)。

表2 H3N2CIV纯化后ELISA最适包被浓度测定结果

表3 小鼠3免后血清抗体效价检测结果

6、杂交瘤制备 

a.饲养细胞的制备：本实验以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，于细胞融合前1d将其均匀铺在96孔细胞板中。饲养细胞的制备过程如下：

S1.取一只8周龄的雌性BABL/c小鼠，摘眼球采血收集至1.5mL EP管内，分离到的血清作杂交瘤细胞筛选时的阴性对照，-20℃备用。小鼠处死后于75％酒精中浸泡5min；

S2.无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤，充分暴露，但不要破坏腹膜。吸取8mL HAT选择性培养液注入腹腔。反复吸打十余次，完毕后将含有腹腔巨噬细胞的培养基转移至无菌细胞培养皿中。先取少量在显微镜下计数细胞个数，然后在培养皿中补加HAT培养液混匀，调整细胞浓度为10⁵个/mL；将含饲养细胞的HAT培养液混匀后加至96孔细胞培养板中，每孔100μL。之后，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，细胞应无污染，呈多形性，折光性好且贴壁紧密。

b.小鼠免疫脾细胞的制备

本次实验中，为提高融合细胞数量和防止单只小鼠脾细胞数量不足，取1号和3号(表3)小鼠脾细胞混在一起使用，小鼠脾细胞制备为常规方法。

c.细胞融合

S1.分别取出准备好的SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，悬浮混匀，按细胞个数1：10的比例吸取两种细胞于50ml离心管中。混匀后，1,000r/min离心10min，弃上清。用手指轻轻拍打管底，将沉淀细胞弹成泥浆。在以下各步试验中应保持离心管置于含37℃灭菌ddH₂O的烧杯中。

S2.吸取37℃预热的1ml 50％PEG-1000细胞融合剂，在1min内加至细胞泥浆，静止1min。接下来开始滴加DMEM基础培养基以终止融合，在第一个1min内加1mL，第二个1min内加2mL，第三个1min内加3mL，第四个1min内加4mL，第五个1min内加5mL。在进行这步操作时要均匀缓慢滴加培养基和轻轻晃动离心管。最后用DMEM基础培养基缓慢补加至40mL。轻轻混匀后，1,000r/min离心10min，弃上清。缓慢加入HAT选择性培养液并轻轻摇匀；将融合后的细胞加到已铺好饲养细胞的96孔板中，每孔100μL，于37℃、5％CO₂ 细胞培养箱中培养。使用HAT培养液每3d半量换液一次。待培养孔中出现细胞集落且长至孔底面积约20％～30％时，及时采集这些孔的上清液，鉴定是否有特异性抗体产生。第10d以后，采用HT培养液半量换液。第17d以后采用完全DMEM培养基培养细胞。

S3.阳性杂交瘤细胞株的亚克隆

在融合细胞集落长到孔底面积20％～30％时，采用间接ELISA方法对有融合细胞生长的细胞培养上清液及时鉴定，以确定其中是否存在针对H3N2CIV的特异性抗体。方法同上述步骤5。不同之处为，一抗采用融合细胞培养上清液。试验中同时取骨髓瘤细胞培养上清液、免疫小鼠阳性血清及正常小鼠血清做对照，阳性孔需及时进行下一步的亚克隆和扩大培养。

在阳性孔细胞亚克隆化前一天，使用完全DMEM培养基在96孔板内制备好饲养层细胞，10⁴个/100μL/孔。用完全DMEM培养基将待亚克隆的细胞从培养板轻轻冲下，计算细胞数。采用有限稀释法将细胞逐步均匀稀释至10个/mL，加至含饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔。每天观察细胞状态，第4d时，用完全培养基半量换液。待杂交瘤细胞长至孔底面积20％～30％时，用间接ELISA法再次检测上清。从中选取仅单个细胞集落生长且阳性值较高孔进行第二次亚克隆。之后如此重复，直至所有克隆细胞孔都为阳性。获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，先用24孔细胞板，再用6孔细胞板及时逐步扩大培养并冻存(-80℃冰箱中梯度过夜降温后，转移至液氮罐内，长期保存备用)。

实验结果：将融合后的细胞分装于4块96孔细胞培养板中，经HAT培养液的选择性培养，细胞于融合后前2d有大量死亡，从第5d开始出现杂交瘤细胞，如图2。待其长至孔底面积约20％～30％时，取培养上清液进行ELISA检测，结果见表4至表8。

表4 细胞融合后第11d ELISA检测结果(第1板)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.21	0.18	0.17	0.18	0.18	0.16	0.16	0.20	0.15	0.13	0.12	0.19
B	0.24	0.15	0.16	0.27	0.22	0.22	0.24	0.22	0.15	0.15	0.17	0.13
													C	0.32	0.33	0.26	0.29	0.28	0.32	0.23	0.23	0.21	0.27	0.19	0.29
D	0.20	0.26	0.23	0.19	0.19	0.26	0.17	0.15	0.18	0.18	0.21	0.25

E	0.26	0.28	0.19	0.24	0.19	0.26	0.21	0.18	0.18	0.24	0.26
													F	0.36	0.34	0.22	0.31	0.26	0.26	0.31	0.22	0.25	0.24	0.20	0.23
G	0.29	0.22	0.28	0.26	0.26	0.29	0.22	0.24	0.23	0.21	0.23
													H	0.35	0.24	0.32	0.32	0.30	0.28	0.25	0.29	0.21	0.22	0.30

表5 细胞融合后第11d ELISA检测结果(第2板)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.20	0.17	0.24	0.29	0.22	0.18	0.25	0.24	0.21	0.22	0.20	0.27
B	0.35	0.21	0.23	0.31	0.22	0.25	0.29	0.19	0.25	0.29	0.26	0.28
													C	0.30	0.25	0.31	0.21	0.42	0.24	0.23	0.19	0.17	0.24	0.26	0.31
D	0.23	0.21	0.24	0.23	0.25	0.23	0.24	0.12	0.27	0.24	0.22	0.25
													E	0.18	0.19	0.21	0.20	0.19	0.18	0.24	0.22	0.17	0.20	0.19
F	0.32	0.20	0.23	0.24	0.26	0.15	0.22	0.17	0.14	0.22	0.13
													G	0.3	0.19	0.20	0.22	0.19	0.18	0.24	0.22	0.17	0.16	0.21
H	0.14	0.17	0.14	0.17	0.12	0.15	0.14	0.22	0.15	0.19	0.15

表6 细胞融合后第11天的ELISA检测结果(第3板)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.35	0.29	0.29	0.23	0.29	0.27	0.42	0.34	0.35	0.27	0.26	0.41
B	0.29	0.30	0.30	0.27	0.25	0.27	0.41	0.38	0.40	0.32	0.34	0.35
													C	0.26	0.29	0.37	0.32	0.20	0.23	0.23	0.29	0.33	0.28	0.33	0.32
D	0.15	0.25	0.24	0.21	0.24	0.24	0.25	0.21	0.30	0.27	0.28	0.31
													E	0.13	0.21	0.26	0.22	0.19	0.17	0.18	0.18	0.20	0.20	0.25
F	0.18	0.39	0.33	0.34	0.15	0.20	0.27	0.24	0.34	0.22	0.27
													G	0.12	0.20	0.20	0.23	0.18	0.16	0.29	0.21	0.23	0.22	0.16
H	0.20	0.20	0.15	0.14	0.36	0.21	0.23	0.19	0.25	0.18	0.20

表7 细胞融合后第11天的ELISA检测结果(第4板)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.28	0.22	0.15	0.19	0.12	0.21	0.21	0.13	0.19	0.19	0.26	0.25
B	0.17	0.30	0.25	0.40	0.26	0.28	0.26	0.27	0.23	0.24	0.20	0.28

 

C	0.22	0.19	0.29	0.32	0.35	0.32	0.27	0.25	0.23	0.27	0.28	0.29
													D	0.18	0.30	0.33	0.35	0.25	0.23	0.32	0.20	0.21	0.17	0.22	0.29
E	0.14	0.30	0.250	0.27	0.21	0.20	0.19	0.17	0.20	0.18	0.21
													F	0.34	0.40	0.38	0.38	0.29	0.37	0.14	0.28	0.31	0.29	0.21
G	0.13	0.21	0.25	0.17	0.19	0.28	0.17	0.20	0.17	0.19	0.26
													H	0.32	0.23	0.17	0.19	0.15	0.14	0.13	0.16	0.17	0.16	0.17

表8 各板对照组检测结果

	阳性血清对照	阴性血清对照	SP2/0上清对照	空白对照
					1号板	0.416	0.155	0.122	0.087
2号板	0.428	0.120	0.160	0.118
					3号板	0.401	0.126	0.093	0.068
4号板	0.470	0.161	0.146	0.104

注：小鼠阳性血清均提前稀释40,000倍。

根据表4至表8的数据并结合显微镜观察，对11株阳性孔杂交瘤细胞进行第一次亚克隆。其中，仅2C5(第2板的C5孔)第一次亚克隆后有阳性孔，其它株未筛出阳性。对2C5使用有限稀释法连续进行第二次和第三次亚克隆，阳性率均为100％。三次亚克隆的检测结果见表9。

表9 2C5的亚克隆检测结果

注：各次亚克隆中，小鼠阳性血清均提前稀释20,000倍。其中，E1为小鼠阳性血清对照，E2为小鼠阴性血清对照，F1为SP2/0细胞上清对照，F2为空白对照。

将2C5进行保藏，该细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保 藏中心，杂交瘤细胞株命名为H3N2-CIV-HA-2C5，保藏编号为CCTCC C201555。

实施例2单克隆抗体的制备

雌性BALB/c小鼠腹腔内注射FICA，0.5mL/只。7d后用灭菌生理盐水洗涤悬浮对数期生长的杂交瘤细胞2C5(取对数生长期细胞培养液上清，测定McAb效价)，细胞密度调至2×10⁶个/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，逐日观察小鼠腹部是否膨大，待其明显鼓起时抽取腹水，置于EDTA处理过的抗凝管中，5,000r/min，离心10min，除去细胞沉淀。将收集到的上清于56℃灭活30min，10,000r/min，离心15min，然后进行纯化。在抽取小鼠腹水前后做好消毒工作，抽取过程中尽量避免刺破小鼠脏器，可进行多次腹水采集。此外，尚可使用单核细胞分离液分离小鼠腹水中的杂交瘤细胞冻存或继续进行腹水制备。

采用琼脂糖亲和介质(ProteinA)纯化腹水。按产品使用说明书，具体过程如下：

a.平衡：用5～10柱体积的磷酸缓冲液平衡层析柱。

b.进料：将处理过的腹水经0.22μm的滤膜过滤后转移至层析柱。

c.淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

d.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集流出液。洗脱后，立刻用1M Tris-HCl(pH 9.0)将收集到的McAb溶液pH值调至7.4。

对杂交瘤细胞2C5的培养上清液先稀释4倍后，再进行倍比稀释；对小鼠纯化前后腹水先稀释5,000倍后，再进行倍比稀释。同时，分别用SP2/0细胞上清、SP2/0细胞诱导腹水作为阴性对照，用间接ELISA方法测定OD_450nm值。P/N≥2.1时McAb的最大稀释度即为其抗体效价。由检测结果(表10至表11)可知，对数生长期2C5杂交瘤细胞培养上清液效价为1：128；纯化前小鼠腹水效价为1：40,000；纯化后小鼠腹水效价可达1：320,000，为细胞培养上清液的2,500倍。微量分光光度计测定纯化后腹水中IgG浓度为2.8mg/mL，取其14.4μg进行考马斯亮蓝染色，结果如图3，可观察到两条条带，其中一条重链约53ku，另一条轻链约22ku。

表10 细胞培养上清ELISA效价

表11 小鼠腹水纯化前后ELISA效价

一、单克隆抗体免疫学性质

(1)单克隆抗体亚型鉴定：按照Envirologix所产的小鼠McAb亚型鉴定试纸条说明书操作，结果如图4，此McAb亚型为IgG2a，轻链为Kappa链。

(2)单克隆抗体的特异性鉴定：按实施例1步骤5所述ELISA操作程序分别用CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV及H7N9、H10N8、H3N8、H3N2四种亚型流感病毒包被ELISA酶标板，检测小鼠腹水的特异性；判定标准：P/N≥2.1为有交叉反应；反之，无交叉反应。

间接ELISA表明，2C5分泌的McAb除与H3N2CIV发生反应，还与H3N8亚型EIV有弱交叉反应，而与CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒均不发生反应。

(3)单克隆抗体的间接免疫荧光试验

a.将对数生长期MDCK细胞铺至6孔细胞培养板。待细胞长至孔面积的50％时使用200μL H3N2CIV感染其中2孔细胞。另外2孔不感染，作阴性对照；

b.24h后，弃细胞培养基，每孔用1mL的4％多聚甲醛固定30min。PBS洗涤2次，每次5min，80r/min(以下洗涤步骤相同)；

c.0.25％Trixton-100处理细胞10min后，PBS洗涤2次；

d.使用PBS配制的5％脱脂奶粉封闭各孔30min后，PBS洗涤2次；

e.加入4,000倍稀释的纯化小鼠腹水作一抗，37℃孵育2h。PBS洗涤3次；

f.以Goat anti-Mouse IgG-FITC作二抗。37℃孵育2h。PBS洗涤3次；

g.加少量PBS于孔内防干燥。在倒置荧光显微镜下观察结果。出现绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性。

荧光实验结果如图5，H3N2CIV感染的MDCK细胞发出明亮的绿色荧光， 而阴性对照未出现反应，对比明显。表明2C5分泌的McAb确与H3N2CIV的某些蛋白发生了反应，且亲和力较高。

(4)单克隆抗体的Western Blot分析

1、H3N2CIV 9种主要蛋白真核表达质粒的转染及各蛋白的收获

提前1d，将对数期生长的293T细胞均匀铺到12孔板上，每孔细胞数为1～2×10⁵/mL，当细胞密度达孔底面积40～60％时开始转染。每种质粒(9种蛋白的质粒为现有)转染1孔细胞，设立阴性对照，质粒转染过程为常见的分子生物学技术，具体可参照LIPO-2000说明书。

2、Western Blot鉴定单克隆抗体

a.取上步试验制备的各蛋白20μL，分别加5μL 5×SDS上样缓冲液，沸水中煮10min；

b.吸取10μL蛋白变性液进行SDS-PAGE电泳，设立正常293T细胞为阴性对照。

c.电泳结束后，采用半干转法将抗原转移到NC膜上，转膜条件为恒压15V，25min。

d.TBST洗涤NC膜2次，5min/次(以下洗涤相同)。之后将其置于5％脱脂奶粉中4℃封闭过夜。弃封闭液，TBST洗涤2次。以纯化的小鼠腹水为一抗，37℃孵育2h后，弃一抗，TBST洗涤3次。加入1：10000稀释的Goat anti-Mouse IgG(H&L)-HRP二抗，37℃孵育2h，弃二抗，TBST洗涤3次。

e.按“增强型HRP-DAB底物显色试剂盒”说明书，在NC膜上加DAB底物显色液，室温，避光显色20min后，用ddH₂O终止反应，观察结果。

使用H3N2CIV 9种主要蛋白真核表达质粒分别转染293T细胞，共得到CIV的9种蛋白，分别为NP、HA、PB1、PB2、PA、NS2、M2、M1和NA。采用Western-Blot方法检测2C5杂交瘤细胞分泌的McAb与何种蛋白反应。结果表明(图6)：该McAb为抗H3N2CIV HA的抗体，而且针对的是HA(约75ku)的线性抗原表位。

实施例3双抗体夹心ELISA检测方法的建立

兔源多克隆抗体的制备：取2只3kg新西兰大白兔，用纯化的H3N2CIV与等量FCA超声乳化，背部皮下分多点注射，1.5mg/只。二免、三免分别于首 免后第14d和第28d用FICA与H3N2CIV乳化后作为抗原皮下注射，2mg/只。三免后心脏采血，分离血清，-20℃保存备用。用间接ELISA法测定抗血清效价，使用微量分光光度计测定纯化(纯化步骤同实施例2)后多抗浓度，取纯化后的样品进行考马斯亮蓝染色，检测纯化效果。

表12 兔源H3N2CIV多克隆抗体制备免疫程序

	抗原	免疫时间	免疫剂量(mg/mL/只)	免疫方式
					一免	H3N2CIV+FCA	第1天	1.5/2	皮下注射
二免	H3N2CIV+FICA	第14天	2/2.5	皮下注射
					三免	H3N2CIV+FICA	第28天	2/2.5	皮下注射

免疫结束后，每只兔子共获得约100mL血液，经离心后分离到血清约50mL，采用间接ELISA法测得纯化前抗血清效价为1：128000，如表13。血清纯化效果如图3所示，SDS-PAGE蛋白上样量为5.4μg，同样可观察到两条条带，说明纯化效果较好。经微量分光光度计测得纯化后H3N2CIV多克隆抗体浓度为1.6mg/mL。

表13 兔源H3N2CIV抗血清ELISA测定结果

双抗夹心ELISA步骤如下：

(1)包被单抗：用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释的，实施例2制备得到的鼠源McAb包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜孵育后，弃包被液，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)；

(2)封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h，弃封闭液，PBST洗涤3次(200μL/孔，2min/次)；

(3)加样：加入PBST稀释好的待测样品，100μL/孔，37℃孵育1h，弃样品液，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)；

(4)孵育多抗：用PBST稀释兔源H3N2CIV多克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1h，弃多抗，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)；

(5)孵育酶标抗体：加PBST稀释好的Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP，100 μL/孔，37℃孵育1h，弃酶标抗体，PBST洗涤5次(200μL/孔，2min/次)；

(6)显色：各反应孔加入新配制的TMB底物溶液，100μL/孔，避光孵育15min；

(7)加终止液：以同加底物的顺序加2M H₂SO₄终止反应，100μL/孔；

(8)测OD值：迅速用提前30min预热的酶标仪进行双波长检测，参考波长设定为630nm，测定OD_450nm值。

判断标准同实施例1。每次进行ELISA试验均需设立阴阳性对照和空白对照，每个样品重复2孔。

一、最适H3N2CIV单克隆抗体包被浓度及H3N2CIV尿囊液稀释度的确定

将McAb用pH9.6的碳酸盐缓冲液作1、0.5、0.25、0.125、0.06125、0.03125、0.015625μg/mL倍比稀释包被酶标板。HAU效价为2⁸的H3N2CIV尿囊液(实施例1)作1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256的倍比稀释。兔抗H3N2CIV多克隆抗体使用浓度为1μg/mL，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP作1：10000稀释。以此程序进行方阵试验，确定最适McAb包被浓度和病毒尿囊液参考稀释度。判定标准为阴性孔的A值在0.2左右，阳性孔的A值在1.0左右，且P/N值最大。

二、兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定

以最适McAb包被浓度包被酶标板，最适H3N2CIV尿囊液稀释度加样。兔抗H3N2CIV多克隆抗体作20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL倍比稀释，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP作1：10000、1：20000、1：40000、1：80000倍比稀释。以此程序进行方阵试验，确定兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度。判断标准同实施例1。

三、双抗体夹心ELISA最佳反应条件的确定

在确定各种抗体抗原最适反应浓度后，依次对封闭液种类(0.1％BSA，1％BSA，5％脱脂乳，1％PVA，0.5％PVA)，各步反应作用时间(0.5、1、1.5、2h)，底物显色时间(5、10、15、20min)等条件逐一优化。判断标准同实施例1。

经试验确定McAb最适包被浓度为0.25μg/mL；最适H3N2CIV尿囊液稀释度为1：128；最适兔抗H3N2CIV多克隆抗体工作浓度为2.5μg/mL；最适Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP稀释度为1：10000；最佳封闭液为5％脱脂奶粉；最 佳封闭时间、最佳尿囊液孵育时间、最佳多抗孵育时间、最佳酶标抗体孵育时间及最佳底物显色时间分别为1.5h、2h、1.5h、1h、10min，如表14至表19所示。

表14 最适McAb包被浓度和H3N2CIV尿囊液最佳工作浓度ELISA试验结果

表15 兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度试验结果^*

*各孔相对应空白对照组试验结果如表16

表16 兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体工作浓度空白对照组试验结果

表17 最适封闭液的确定

表18 各步反应最佳作用时间的确定

表19 TMB底物显色时间的确定

四、双抗体夹心ELISA检测方法阴阳性判定标准的确定

用上述已建好的双抗夹心ELISA方法检测16份10日龄SPF鸡胚尿囊液。以最佳稀释倍数H3N2CIV尿囊液作阳性对照。计算阴性样本OD_450nm平均值(X)及其标准差(SD)，根据统计学原理，求得阴阳性界限(X+3SD)。即，当OD_450nm值≥(X+3SD)时，样品可在99.9％的可信度上判断为阳性，当(X+3SD)≥OD_450nm≥(X+2SD)时判为可疑，需再次检测或结合其他更灵敏的方法检测；当OD_450nm≤(X+2SD)时，则判为阴性。

结果表明：在上述最优条件下，用16份SPF阴性鸡胚尿囊液进行ELISA检测，平均OD_450nm值X为0.131，SD为0.032，得到阳性临界值为(X+3SD)＝0.228，阴性临界值为(X+2SD)＝0.195。即，当样品OD_450nm≥0.228时，可以在99.9％的可信度上判断为阳性；当样品0.228≥OD_450nm≥0.195时判为可疑；当样品OD_450nm≤0.195时，则判为阴性(图7)。

实施例4双抗夹心ELISA方法敏感性试验

在最佳反应条件下，将H3N2CIV尿囊液以1：2⁰、1：2¹、1：2²、1：2³、1：2⁴、1：2⁵、1：2⁶、1：2⁷、1：2⁸、1：2⁹、1：2¹⁰、1：2¹¹、1：2¹²、1：2¹³、1：2¹⁴、1：2¹⁵倍比稀释后，采用实施例3建立的双抗夹心ELISA和HA试验同时测定其效价，确定病毒尿囊液最大稀释倍数，比较这两种方法检测H3N2CIV的敏感性。

采用双抗夹心ELISA方法测定H3N2CIV尿囊液不同稀释度的OD_450nm值，当OD_450nm值≥0.228即判为阳性。H3N2CIV尿囊液不同稀释度ELISA效价，如图8所示，该H3N2CIV尿囊液的ELISA效价为1：128。经血凝试验测定，该H3N2CIV尿囊液HAU为1：32。本实验构建的双抗夹心ELISA方法的检测灵敏度是HA方法的8倍。

实施例5双抗夹心ELISA方法特异性试验

在最佳反应条件下，以CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV以及H7N9、H10N8、H9N2、H3N8亚型流感病毒为待检样品。以H3N2CIV尿囊液为阳性对照，确定本方法的特异性。

以CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV以及H7N9、H10N8、H9N2、H3N8 亚型流感病毒为待检样品进行双抗夹心ELISA检测。结果显示H3N8亚型EIV OD_450nm值大于临界值，为0.298，HAU相应为2⁴。其它被检病原OD_450nm值均小于临界值，其中，H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒HAU相应分别为为2⁶、2⁶、2⁶。表明本研究建立的ELISA方法对H3N8亚型EIV有较弱的交叉反应，而对犬常见呼吸道病毒及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒无交叉反应性(图9)。

实施例6双抗夹心ELISA方法重复性试验

取3块不同批次包被的酶标板，用双抗夹心ELISA方法检测4份己知HAU的H3N2CIV尿囊液样品。在同一块酶标板上进行批内重复，每份样品重复5孔。不同酶标板之间进行批间重复。根据测定的OD_450nm值，计算其变异系数(CV)，CV＝SD/X×100％。如果变异系数<10％，则说明其重复性和稳定性好。

结果表明：4份鸡胚尿囊液OD_450nm值批内变异系数在2.40％～6.56％之间，批间变异系数在3.82％～7.28％之间，均小于10％，具有良好的重复性(表20)。

表20 双抗夹心ELISA重复性试验(n＝4)

实施例7双抗夹心ELISA方法临床样本检测

采用建立的双抗夹心ELISA方法对346份本实验室所收集的犬鼻拭子进行检测，发现阳性样品8份，检出率为2.31％。而采用鸡胚分离病毒仅检出1份阳性样品，检出率为0.29％。两种方法阳性符合率为12.5％，阴性符合率为100％，总符合率为98％(表21)。

表21 犬鼻拭子临床样品检测结果

Claims (8)

1.一种H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555。

2. 权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。

3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG2a亚型，轻链为Kappa链。

4. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应用。

5. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中的应用。

6. 权利要求2所述单克隆抗体在检测流感病毒中的应用。

7. 根据权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为犬流感病毒。

8. 基于权利要求2所述单克隆抗体的免疫检测方法。