CN103223162A - 一株h3n2犬流感病毒株cgd1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒疫苗制备技术领域，具体公开了一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用。本发明利用自行分离、鉴定、保存的3株H3N2犬流感病毒株CGD1、CGD2和CGD3接种鸡胚进行传代培养，发现病毒株CGD1的遗传稳定性好，因此选择CGD1株进行噬斑纯化病毒选育出了一株H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1，该疫苗株已于2013年2月1日送交北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNO：7218。利用H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1接种鸡胚进行病毒繁殖，经过收获鸡胚尿囊液、灭活、配苗等步骤可以制备出安全、有效的H3N2犬流感病毒灭活疫苗。

Description

一株 H3N2 犬流感病毒株 CGD1 的应用

技术领域

本发明涉及病毒疫苗制备技术领域，更为具体地，涉及一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用。

背景技术

A型流感病毒是一类威胁人类健康的重要传染病。流感病毒具有严格的宿主特异性，即便是相同病毒在不同的宿主上的传播也受到宿主界限制。传统观念认为，犬猫不是流感病毒的易感动物，但近几年流感病毒感染在这两种动物上已有报道。试验性和自然感染已经证明H5N1亚型禽流感可以感染犬。早在2004年，美国首次报道H3N8亚型犬流感病毒引起犬流感的大爆发，通过序列分析，发现该亚型的犬流感病毒是从马流感病毒衍变而来的。随后，澳大利亚发生马流感后也爆发犬流感病毒。与之前报道的流感病毒感染犬不同，H3N8亚型犬流感病毒（CIV）可以在犬群中进行水平传播。2008年，韩国爆发了由H3N2亚型犬流感病毒引起的犬流感，通过序列分析，发现H3N2亚型的犬流感病毒是禽源的，不同于欧美国家马源犬流感病毒，引起犬发生急性呼吸道系统疾病，在韩国的犬群中广泛传播。

2006年，发明人首次在华南地区分离到禽源H3N2亚型CIV，通过序列分析，发现这些病毒与韩国分离到病毒高度同源。2009 年2~12 月期间，广州地区临床疑似病例中CIV 病原学调查的阳性率为2.8 %，血清学调查阳性率为6.9 %。2009~2010年，在江苏、浙江两地也相继分离到禽源H3N2亚型CIV，该病毒与华南及韩国H3N2 CIV 高度同源，犬流感病毒在我国东南沿海地区已形成区域性流行。从血清学调查结果显示，犬流感在中国流行范围和感染率呈迅速上升趋势。因而急需研制有效的疫苗控制CIV的传播。

2009年6月，Intervet公司研究成功犬流感病毒灭活苗，在美国已经上市，但是我国流行的犬流感病毒与美国流行的犬流感病毒抗原性差别很大，二者起源于不同的H3流感病毒分支。因而，研制针对我国犬流感病毒流行株的灭活疫苗，对于犬流感的预防控制具有重要的实际意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术犬流感病毒抗原性差别很大的不足，提供一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，所述应用为应用于制备治疗或/和预防由H3N2亚型CIV犬流感病毒侵染引起的疾病的药物。

优选地，所以药物为H3N2犬流感病毒灭活疫苗，所述疫苗含有保藏号为CGMCC NO：7218的H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1，H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1于2013年2月1日送交北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏。

所述H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1是H3N2犬流感病毒株CGD1通过噬斑纯化选育得到的。

本发明首先将自行分离、鉴定、保存的3株犬流感病毒株CGD1、CGD2和CGD3经SPF鸡胚培育后，得到鸡胚适应毒株。CGD1株传至第9代，血凝效价达到2⁷~2⁸，CGD2株传至第9代，血凝效价达到2⁵~2⁶，CGD3株传至第9代血凝效价达到2⁵~2⁷。选择CGD1株进行噬斑纯化病毒，所得到的纯化病毒连续传6代，观察病毒稳定性。适应鸡胚的CGD1株的血凝效价稳定在2⁷~2⁸。能达到制备疫苗的效果。所以将纯化后稳定传代的H3N2犬流感病毒株CGD1选育作为H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1。

所述H3N2犬流感病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.将H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1接种SPF鸡胚，接种量为0.1～0.2ml/胚，35～37 ℃孵育72～96h，收集病毒滴度不低于8价的活的鸡胚的尿囊液；

S2.将收集的尿囊液离心去除沉淀，收集上清经滤膜过滤，得到犬流感病毒毒液；

S3.灭活：将无菌检验合格的犬流感病毒毒液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为1‰，35～37℃灭活24～48h，4℃保存；

S4.疫苗的制备：将灭活的犬流感病毒毒液做成铝胶佐剂疫苗或油乳佐剂疫苗。

铝胶佐剂疫苗或油乳佐剂疫苗的制备步骤具体如下：

油乳佐剂疫苗的制备：将16L的白油煮热加入160g硬脂酸铝（终浓度1%，温度低于110℃），顺时针搅拌溶解(30min)，加入1150g司本-80煮5min，室温放置备用。先向已经灭活的病毒液中加入3.5%的吐温80（吐温80煮沸再用，病毒体积的3.5%为吐温的体积），摇荡溶解后成水样，作为水相。然后按水相：油相（V/V）=2：3的比例加入油相到匀浆机中，打开匀浆机先将油相搅拌3~5min，然后向其中加入水相（低转速加入），加完后高转速搅拌5~10min，以乳化液滴入水中不扩散为准。放凉后，置于4℃冰箱保存。

铝胶佐剂疫苗的制备：用生理盐水和铝胶佐剂（V/V）=1：1的比例混匀，制成50%氢氧化铝胶佐剂。将犬流感病毒毒液与铝胶佐剂按照体积比为4:1比例混合乳化。

优选地，犬流感病毒毒液灭活前和灭活后都要分别测定HA效价，HA效价≥8log2者方可用于制备疫苗。

优选地，S1所述SPF鸡胚为9~11日龄SPF鸡胚。

优选地，S2所述离心的条件为2000~5000r/min，4℃离心20~30min。

优选地，S2所述滤膜的孔径为0.22um。

优选地，S2所述4℃保存的保存时间不超过1个月。

本发明的有益效果是：

本发明研制的H3N2亚型CIV灭活疫苗可以诱导犬产生较强的免疫应答反应，攻毒试验中，可以显著减轻病毒感染的临床症状的严重程度，明显缩短病毒的排毒期，对当前流行的H3N2亚型CIV有很好的预防和治疗作用。

附图说明

图1.疫苗免疫后各组犬HI抗体水平。

图2.攻毒后各组犬的体温变化。

图3.攻毒后各组犬的抗体水平。

具体实施方式

实施例1：H3N2犬流感病毒的分离。

S1.样品采集及处理：

用消毒棉拭子采集犬鼻咽部分泌物，采集鼻拭子时，尽量涂擦鼻子的分泌物或将拭子插入鼻腔深处，旋转数周后拔出；采集咽拭子时，尽可能多涂擦下咽的分泌物。采集后的拭子置于2mL EP管内，浸泡在含有青链霉素双抗的灭菌生理盐水中，迅速送往实验室检测或置-20℃保存。

S2.鸡胚接种：

将鼻咽拭子在管壁反复挤压后取出，充分振荡管中液体。置4℃待其自然沉淀5~10min，取上清加入终浓度为1 000μg/mL的青链霉素双抗，4℃作用1h，经尿囊腔接种9~11d龄的鸡胚，每个鼻咽拭子接种3枚胚，0.1mL/枚。置37℃孵育，每12h观察一次；弃去24h内的死胚，将24h后的死胚置于4℃冰箱保存。96h后将所有鸡胚置4℃冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，10000r/min离心5min以去除红细胞和大的杂质，上清液用于进行红细胞凝集(HA)试验。

S3.血凝（HA）试验及血凝抑制(HI)试验

参照国标方法进行（农业部，2004）。在微量反应板的1~12孔均加入25μL PBS液，换枪头。吸取25μL待检病毒液加入第1孔，混匀后，倍比稀释至第11孔，从第11孔吸出的25μL液体弃去。换枪头，每孔再加入25μL PBS液。最后每孔均加入25μL 1％(V/V)鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。轻轻振荡混匀，室温(20~25℃)下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下1h）。有血凝活性者作进一步鉴定；无血凝活性者将其尿囊液盲传三代，仍无血凝活性者弃去。阳性者置-20℃保存备用。

结果判定：将板倾斜，第12孔（阴性对照孔）红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底，观察1~11孔，以完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位。

将具有血凝活性的鸡胚尿囊液作为被检抗原，应用H1、H3、H5、H7、H9亚型标准阳性血清和阴性血清，参照国标方法(国标号：GB/T 14926.54-2001)进行HI试验。

S3.H3N2犬流感病毒的鉴定：

S31.病毒RNA的提取

对有血凝活性的尿囊液，严格按照Invitrigene生物工程公司TRIzol® Reagent抽提试剂方法进行。取病毒尿囊液250μL加入到DEPC处理过的1.5mLEP管中，接着加入750μL TRIzol® Reagent病毒裂解液，剧烈颠倒振荡，室温静置5min；加入200μL氯仿，室温下混匀后静置1~2min，4℃ 10 000r/min离心10min后取出EP管，小心吸取上清液600μL置于另一新的DEPC处理过的1.5mLEP管中，向此管加入600μL异丙醇(上清液:异丙醇=1:1)并混匀；4℃ 10 000r/min离心10min后取出EP管，小心倾倒掉上清液，接着加入1 000μL 75%乙醇，4℃ 9 000r/min离心5min后取出EP管，小心倒掉上清液，将EP官倒置于滤纸上使其在室温下充分干燥；最后加入20μL DEPC水，直接进行反转录或者-20℃冻存备用。

S32.病原的PCR鉴定 将提取鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA，用流感病毒通用反转录引物CU：（AGC AAA AGC AGG）进行反转录，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。反转录体系如下：9.5μL病毒RNA抽提液，4μL 5x AMV Buffer，4μL 10mmol each dNTPs，1μL AMV，1μL CU，0.5μL HPRI。反转录反应条件：反应体系静置10min，于42℃水浴1小时，冰上冷却2min，进行PCR扩增或-20℃保存备用。用CIV M片段特异性引物进行RT-PCR扩增。引物对为：F：AGC AAA AGC AGG TAG ATA T，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，R：AGT AGA AAC AAG GTA GTT TT，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。PCR反应体系：16.7μL ddH₂O，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL 2.5mmol each dNTPs，0.5μL PCR引物，0.3μL Ex Taq DNA聚合酶，3μL cDNA。PCR扩增的条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，33个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

S4.H3N2犬流感病毒的纯化：

噬斑纯化病毒方法：

S41.新长成片的MDCK细胞，弃生长液，用Hank`s溶液洗两遍，主要为了去除残余的牛血清。

S42.用维持液稀释病毒（10^-1~10^-8），加入细胞，0.5ml/瓶。轻轻晃动细胞瓶，使加入的病毒溶液均匀地铺在细胞表面上。

S43.置33~35℃孵育1h，倒掉接种液，用Hank`s液洗2遍，将未吸附的病毒颗粒洗掉。

S44.加入第一层覆盖液，3ml/小瓶，室温下待凝固，然后培养瓶倒置，置33~35℃孵育。

S45.72~96h后取出，加第二层覆盖液，每瓶2ml，盖上纸或布，因中性红见光后会分解，室温下凝固，同样让细胞面朝上，盖好纸或布，置33~35℃孵育。

S46. 24~27h后取出，计数空斑，以空斑形成单位表示病毒的感染滴度。按下列公式计算病毒的空斑形成单位。

S47.挑斑：为了纯化病毒，通过斑传斑进行克隆，挑选有意义的斑。将需挑选的斑用笔圈出，将无菌的毛细吸管尖端在酒精灯下弯曲成45度左右，待冷却后吸约0.1ml无菌盐水，轻轻冲洗所要收获的斑，吸出并收集起来。空斑收获的病毒经SPF鸡胚扩增后以备后续试验使用。

实施例2 H3N2犬流感疫苗毒株培育及选择。

S1.H3N2犬流感疫苗毒株培育

将2006~2007年分离得到的A/canine/Guangdong/01/2006(H3N2), A/canine/Guangdong/02/2006(H3N2), A/canine/Guangdong/01/2007(H3N2)，分别简称为CGD1、CGD2、CGD3三株H3N2犬流感病毒作为疫苗候选毒株。将3株疫苗候选毒株病毒尿囊液先做10^-1~10^-3倍稀释，经尿囊腔接种9日龄~11日龄SPF 鸡胚，接种量为0.2ml/胚，每个稀释度接种5枚，37 ℃孵育72~96h，弃去24 h 内死亡胚，每12 h 观察一次，并将死胚置于4 ℃冰箱保存。96 h 后将存活鸡胚置4 ℃冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，用1%鸡红细胞的血凝试验（HA）分别测定其血凝单位（HAU），将各株HAU较高的各鸡胚尿囊液混合后用灭菌的生理盐水稀释10^-1~10^-3倍后继续接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。如此反复传代几次，直至收获的病毒尿囊液HAU稳定。

表1 CGD1株不同代次HA试验结果统计

CGD1株传至第9代，血凝效价达到2⁷~2⁸。

表2 CGD2株不同代次HA试验结果统计

CGD2株传至第9代，血凝效价达到2⁵~2⁶。

表3. CGD3株不同代次HA试验结果统计

CGD3株传至第9代血凝效价达到2⁵~2⁷。

S2. H3N2犬流感疫苗毒株选择。

三株犬流感病毒经SPF鸡胚培育后，得到鸡胚适应毒株。CGD1株传至第9代，血凝效价达到2⁷~2⁸，CGD2株传至第9代，血凝效价达到2⁵~2⁶，CGD3株传至第9代血凝效价达到2⁵~2⁷。选择CGD1株进行噬斑纯化病毒，所得到的纯化病毒连续传6代，观察病毒稳定性。适应鸡胚的CGD1株的血凝效价稳定在2⁷~2⁸。能达到制备疫苗的效果（结果见表4）。将纯化后稳定传代的H3N2犬流感病毒株CGD1选育作为H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1。

表4 CGD1株不同代次HA试验结果统计

f10~f15为传代稳定性试验，CGD1株的血凝效价稳定在2⁷~2⁸。

S3.H3N2犬流感疫苗株CIVGDYM1遗传特性分析

HA和NA基因序列扩增和测序方法如下：

S31.病毒RNA的提取：对有血凝活性的鸡胚尿囊液，按照Invitrigene生物工程公司TRIzol^® Reagent抽提试剂方法提取病毒RNA：

S32.病毒反转录：参照Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶使用说明书进行。

S33.病毒HA和NA基因扩增引物设计

引物使用华南农业大学兽医学院外科教研室保存的犬流感各片段通用引物

表 H3N2亚型CIV RT-PCR引物序列

序号	引物名称	序列
			SEQ ID NO：4	HA基因上游	AGC AAA AGC AGG GGT MYR ATC T
SEQ ID NO：5	HA基因下游	AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT AAC TAC A
			SEQ ID NO：6	NA基因上游	AGC AAA AGC AGG AGT TYA AAA TG
SEQ ID NO：7	NA基因下游	AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT SAA C

S34.病毒的PCR鉴定

使用HA和NA基因引物，以上述cDNA为模版，参照宝生物工程公司Ex Taq DNA聚合酶的使用说明进行PCR检测

成分	用量（uL）
		ddH2O	37μL
10×EX Taq 聚合酶 Buffer	5μL
		2.5mmol each dNTPs	3.5μL
上游引物（20pmol）	0.5μL
		下游引物（20pmol）	0.5μL
cDNA	2μL
		Ex Taq DNA聚合酶	0.5μL（5U）。

[0046] 将以上成分混匀后，在UNO-II型核酸扩增仪（Biometra公司）运行。运行程序如下：

S35.PCR产物的凝胶电泳检测：反应结束后，取5μLPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL EB）进行电泳检测，点样完毕将电泳糟电压调至110V左右电泳30min，使用凝胶成像系统记录电泳结果。

S36.PCR产物的切胶回收：PCR反应结束后，取100μL的PCR产物于上样孔中，110V电压电泳30min；电泳结束后，紫外灯下观测电泳结果，切下目的条带，按照OMEGA公司胶回收试剂盒使用说明书进行目的片段的回收。

S37.将PCR扩增得到的产物连接pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞克隆测序。阳性克隆菌液送上海英骏生物技术有限公司 （广州分公司）测序。

S38.HA基因序列分析：将测序得到的HA基因序列（HA基因序列如SEQ ID NO：8所示）与中国国内分离得到的24株犬流感病毒毒株和传代之前的原毒株共25株病毒进行基因序列比较分析，参考基因序列登录号分别为：JN247597，JN247605，JN247613，JN247621，JX101347，JX101355，JX101363，JX101371，JX101379，JX101387，JX101395，JX101403，JX101411，JX101420，JX101428，JX101435，JX195352，GU433347，GU433356，GU433363，GU433371，JF714155，JN247581，JN247589。疫苗毒株的HA基因片段与原毒株同源性最高，达99.9%。 与其他参考毒株同源性为98.2%~99.0%。

S39.NA基因序列分析：将克隆测序得到的NA基因序列（NA基因序列如SEQ ID NO：9所示）与中国国内分离得到的24株犬流感病毒毒株和传代之前的原毒株共25株病毒进行基因序列比较分析，参考基因序列登录号分别为：JN247597，JN247605，JN247613，JN247621，JX101347，JX101355，JX101363，JX101371，JX101379，JX101387，JX101395，JX101403，JX101411，JX101420，JX101428，JX101435，JX195352，GU433347，GU433356，GU433363，GU433371，JF714155，JN247581，JN247589。疫苗毒株的HA基因片段与原毒株同源性最高，达99.7%。 与其他参考毒株同源性为98.4%~99.7%。

实施例3 H3N2犬流感疫苗毒株纯净性检验。

S1.菌性检验：根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准2001版》中有关方法进行，取新收获的病毒尿囊液，分别接种硫乙醇酸盐培养基（T.G）、葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）、改良的Frey氏培养基，置37℃培养72h，观察有无微生物生长。（检测细菌、霉菌及支原体）

检验用培养基配置法：

含硫乙醇酸盐培养基（T.G）：胰酪蛋白胨15.0g；琼脂（粉） 0.5~0.7g；酵母浸出粉5.0g；氯化钠2.5g；葡萄糖5.0g；0.2%美蓝溶液（或1%刃天青溶液1.0ml） 0.5ml；硫乙醇酸钠0.5g ；L-半胱氨酸盐酸盐0.5g；注射用水加至1000ml。将以上成份混合，加热溶解，以氢氧化钠溶液调整pH至7.0~7.2。分装于中性容器中，以116℃灭菌20~40分钟。

注：以上成分中不加硫乙醇酸钠，即制成酪素胰酶消化液（酪胨培养基，即G.A），加大琼脂量，制成琼脂斜面，作活菌检查。

葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）：葡萄糖20.0g；硫酸镁（含七个结晶水） 0.5g；磷酸氢二钾1.0g；蛋白胨5.0g；琼脂粉0.4g；酵母浸出粉（酵母透析液100ml）2.5g；纯化水（或注射用水）加至1000ml。

将以上成分混合，加热溶解。分装于中性容器中，以116。C灭菌20~40分钟，pH为6.0~6.6。

改良Frey 氏固体培养基：氯化钠 5.0 g；氯化钾 0.4 g；硫酸镁（含7 个结晶水） 0.2 g；磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 1.6 g；磷酸二氢钾 0.2 g；葡萄糖 10 g；乳蛋白水解物 5.0 g；酵母粉（或25％酵母浸出液100 ml） 5.0 g；琼脂粉 15 g；1%醋酸铊溶液 10 ml；注射用水加至1000 ml。

上述成分混合后加热溶解，定量分装，以 116℃灭菌20 分钟后，置2~8℃保存。使用前将100 ml 固体培养基加热溶解，当温度降到60℃左右时，添加辅助成分。

辅助成分：猪（马）血清 10 ml；2％精氨酸溶液 2.0 ml；1％辅酶I 溶液 1.0 ml；1％ L-半胱氨酸溶液 1.0 ml；8 万单位/ml 青霉素 1.0 ml

注：上述成分混合后，滤过除菌，定量分装，置－20℃保存

培养基	T.G	G.P	改良的Frey氏
				检测结果	—	—	—

S2.无其他病毒检验

根据各种犬病病毒的特性，采用PCR方法检测分离株犬流感病毒中是否有其他犬病病毒性疾病的病原存在。犬常见病毒性传染病CDV、CPV、CAV、CPIV。

S21.犬瘟热病毒和犬副流感病毒检测

犬瘟热病毒和犬副流感病毒同流感病毒一样是一种单链RNA病毒，将所收集的尿囊液按照T RIzo l Reagent 的使用说明书进行病毒RNA抽提。抽提得到的RNA 立即进行RT-PCR。RT-PCR 扩增，反应体系与流感病毒反转录体系一样。反转录反应: 37℃，10 min：42℃，60 min。应用DNA Star(Version 5.07)及Primer Premier(Version 5.0)基因分析软件，对Gen Bank收录的多个犬瘟热病毒和犬副流感病毒的基因序列分别进行比较，依据犬瘟热的核蛋白(NP)基因设计1对引物，预计扩增480bp。NP-F1: TTATGCTATGGGAGTTGG(如SEQ ID NO：10所示)，NP-R1:CGGTCATCGTCGTTTC(如SEQ ID NO：11所示)。犬副流感病毒设计1对引物，预计扩增417bp。CPIV-F: TACAATCCCACCTACAACA(如SEQ ID NO：12所示)，CPIV-R: AAAGTCTCAATCTCATCCC(如SEQ ID NO：13所示)。PCR反应体系与流感病毒PCR鉴定体系一样。PCR 反应条件如下: 94℃，5min；94℃,30s，53℃,30s，72℃,40s；进行30个循环；72℃延伸10 min。反应完毕后直接电泳检测。凝胶电泳和结果观察按常规方法制胶、点样6ul，同时于样品旁边点5ul 2000DNA Marker 作为分子质量标记。点样完毕将电泳糟电压调至110V左右30 min进行电泳。凝胶成像系统记录结果。

S22.犬细小病毒和犬腺病毒检测

犬细小病毒和犬腺病毒检测，将收集得到的尿囊液用天根公司病毒DNA提取试剂盒抽提DNA，用于病毒基因的检测。参考文献并根据NCBI上发表的犬细小病毒的基因序列(AY581307.1)，设计合成了1对检测引物，预计扩增681bp。CPV-F: GAAGAGTGGTTGTAAATAATT(如SEQ ID NO：14所示)，CPV-R: CCTATATAACCAAAGTTAGTAC(如SEQ ID NO：15所示)。犬腺病毒检测，在其早期转录区选择两段保守区域的23个碱基序列作为引物序列, 引物CAV-F为GCATGCTCCAAGCGTACGTTA TT(如SEQ ID NO：16所示),引物CAV-R为CGCTTCTGTGCTCTAAGCTAGCC(如SEQ ID NO：17所示)，其间CAV-1的核苷酸长度为520bp , CAV-2的核苷酸长度为1030bp。PCR 扩增反应体系: 16.7μL ddH₂O，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL 2.5mmol each dNTPs，0.5μL PCR引物，0.3μL Ex Taq DNA聚合酶，3μL 病毒DNA。 PCR 反应: 94℃，5min；94℃,30s，51℃, 30 s，72℃ , 1min；进行30个循环；72℃延伸10 min。反应完毕后直接电泳检测。凝胶电泳和结果观察按常规方法制胶、点样6ul，同时于样品旁边点5ul 2000DNA Marker 作为分子质量标记。点样完毕将电泳糟电压调至110V左右30 min进行电泳。凝胶成像系统记录结果。

实施例4

H3N2犬流感病毒理化特性的鉴定。

S1.病毒血凝性热稳定性试验。

流感病毒血凝性的热稳定性划分为三种类型，在5min以内下降两个滴度以上的为热不稳定型；30min以上下降两个滴度为热稳定型；介于两者之间的为中等耐热型。具体方法如下：将新收获的病毒尿囊液等量分装于灭菌的EP管中，1.0ml/管，然后分别放置于56℃水浴0min，5min，10min，15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min以及过夜，随后迅速放到4℃冰箱中5~10min，分别测其HAU。

S2.病毒的耐酸、耐碱性试验

取新收获的鸡胚尿囊液等量分装到3个50ml离心管中，5mL/管，第1管用1N HCl调节PH值到3.0左右，室温下作用3h，再用饱和NaHCO₃溶液（96g/L）将PH调到7.0左右；第2管用1N NaOH调节pH值到10.0左右，室温条件下作用3h，然后用1N HCl将PH值调回7.0左右；第3管加入灭菌生理盐水，温度下作用3h。以上三份病毒尿囊液经10倍稀释后，每个处理方式接种3枚10日龄SPF鸡胚，35℃培养48~72h，收集鸡胚尿囊液，测定HAU。

S3.病毒的氯仿敏感性试验

本试验分两组：第一组向新收获的病毒鸡胚尿囊液加入20%的氯仿，室温高速振荡2min后置4℃冰箱静置10min；另一组加入灭菌的生理盐水。然后将处理过的两组病毒分别接种3枚10日龄的SPF鸡胚，35℃培养48~72h，收集鸡胚尿囊液，测定HAU。

S4.病毒的乙醚敏感性试验

本试验分两组：第一组向新收获的病毒鸡胚尿囊液加入20%的乙醚，室温振荡2min后4℃过夜；另一组加入灭菌的生理盐水。然后将处理过的两组病毒分别接种3枚10日龄的SPF鸡胚，35℃培养48~72h，收集鸡胚尿囊液，测定HAU。

S5.抗原滴度测定确定：

病毒EID50的测定（鸡胚半数感染量）

用灭菌的生理盐水将第8代CGD1株稀释成10^-1~10^-6 6个稀释度，每个稀释度分别接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，接种鸡胚后置37℃，空气相对湿度75%孵育，每日观察，孵化48~72h后收集尿囊液，用HA试验检测各鸡胚尿囊液的血凝性，HA效价≥4log2判为感染，结果见表5，以Reed-Muench公式计算毒株的鸡胚半数感染量（EID₅₀）。

EID₅₀的计算：

表5.鸡胚半数感染量试验结果

EID₅₀值为3.4lg/0.2ml。

实施例5

H3N2犬流感疫苗制备。

S1.病毒的增殖

CGD1犬流感疫苗毒株病毒尿囊液先做10^-2倍稀释，经尿囊腔接种9~11日龄SPF 鸡胚，接种量为0.2ml/胚，37 ℃孵育72~96h，弃去24 h 内死亡胚，每12 h 观察一次，并将死胚置于4 ℃冰箱保存。96 h 后将存活鸡胚置4 ℃冷却过夜，用1%鸡红细胞的血凝试验（HA）分别测定其血凝单位（HAU），无菌收集培养后的病毒滴度不低于8价的鸡胚尿囊液。

收集的尿囊液经5000转/分钟4℃离心30分钟，去除沉淀，收集上清经0.22um的滤膜过滤，得到犬流感病毒毒液。

S2.灭活

将无菌检验合格的犬流感病毒毒液，检测流感病毒效价和病毒EID₅₀，向尿囊液中加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混匀，使甲醛溶液的终浓度为1‰。37℃灭活24h，每隔2~4h充分振荡1次。灭活后测定灭活病毒液的HA效价，尿囊液置4℃保存，应不超过1个月。

S3.半成品检验

S31.灭活检验

用灭菌的生理盐水将灭活的病毒进行10倍、100倍稀释，将稀释的病毒液分组接种鸡胚尿囊腔。每组接种10个9~11日龄鸡胚，每胚接种0.2ml，置35℃培养72小时。24小时死亡的不计数。收集的鸡胚尿囊液，测定血凝价，应均不出现血凝，并盲传1代，每组各接种10个胚，每个胚接种0.2ml，经35℃培养72小时，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，若无血凝现象，认为完全灭活。

S32.无菌检验：

取灭活的胚液，按照《中国兽药典》2001年版进行，应无菌生长。

S33.HA效价检验

灭活前和灭活后分别测定HA效价，HA效价≥8log2者方可用于制苗。

S4.疫苗的制备

S41.油乳佐剂疫苗的制备

将16L的白油煮热加入160g硬脂酸铝（终浓度1%，温度低于110℃），顺时针搅拌溶解(30min)，加入1150g司本-80煮5min，室温放置备用。先向已经灭活的病毒液中加入3.5%的吐温80（吐温80煮沸再用，病毒体积的3.5%为吐温的体积），摇荡溶解后成水样，作为水相。然后按水相：油相（V/V）=2：3的比例加入油相到匀浆机中，打开匀浆机先将油相搅拌3~5min，然后向其中加入水相（低转速加入），加完后高转速搅拌5~10min，以乳化液滴入水中不扩散为准。放凉后，置于4℃冰箱保存。

S42.铝胶佐剂疫苗的制备

用生理盐水和铝胶佐剂（V/V）=1：1的比例混匀，制成50%氢氧化铝胶佐剂。将犬流感病毒毒液与铝胶佐剂按照体积比为4:1比例混合乳化。

4 H3N2犬流感疫苗的检验

性状：油乳佐剂疫苗为白色均质乳剂，滴于水中呈圆的油滴状不分散，置于4℃保存，6月内未出现分层。

铝胶佐剂疫苗静止分层，上层为病毒液，下层为氢氧化铝胶生理盐水，置于4℃保存，使用前将病毒液和铝胶佐剂混匀。

S5.无菌性检验

取制备的疫苗，按照《中国兽药典》2001年版进行，应无菌生长。

安全性检验

小鼠的安全性试验

先采用小鼠为模型，进行疫苗的安全性试验，检验合格后再进行犬的安全性试验。

单剂量安全性试验：将制备的疫苗（HAU为28）免疫接种10只无H3N2亚型CIV特异性抗体健康小鼠，免疫接种途径为皮下注射，注射剂量为0.5ml/只，免疫后连续观察10d，每日观察有无异常的临床反应。

单剂量重复性安全性试验：将制备的疫苗（HAU为28）以0.5ml/只的剂量接种10只小鼠，在接种后2周，以相同途径和免疫剂量再次接种小鼠，连续观察10d，每日观察有无异常的临床反应。

一次性大剂量安全性试验：取实验室制备的灭活疫苗（HAU为28），以两倍免疫剂量（1ml/只）接种小鼠，连续观察10d，每日观察有无异常的临床反应。

犬的安全性试验

单剂量安全性试验：将实验室制备的疫苗（HAU为28）免疫接种10周龄比格犬3只，每只颈部皮下注射1.0ml，免疫后连续观察10d，每日观察有无异常的局部或全身反应。

单剂量重复性安全性试验：将实验室制备的疫苗（HAU为28）以1.0ml/只的剂量颈部皮下免疫接种10周龄比格犬3只，在接种后2周左右，以相同途径和免疫剂量再次接种一次，连续观察10d，每日观察有无异常的临床反应。

一次性大剂量安全性试验：取实验室制备的灭活疫苗（HAU为28），以2倍免疫剂量（2.0ml/只）接种10周龄比格犬3只，连续观察10d，每日观察有无异常的局部或全身反应。

结果

通过小鼠和比格犬体内进行的单剂量安全性试验、单剂量重复性安全试验及一次性高剂量安全性试验。结果表明，白油佐剂疫苗在接种部位会出现硬结，铝胶疫苗在接种后无任何不良反应

实施例6

H3N2犬流感疫苗免疫效力的研究。

S1.小鼠免疫效力试验

30只BALB/C小鼠随机分为3组，每组10只，第1组为油乳佐剂疫苗组，每只小鼠通过皮下注射0.5ml油乳佐剂疫苗，第2组为铝胶佐剂疫苗组，每只小鼠通过皮下注射0.5ml铝胶佐剂疫苗，第3组为空白对照组。免疫3次，每次间隔14天，3免后14天，通过眼球采血，制备血清，通过血凝抑制试验（HI）检测H3亚型CIV抗体，HI检测前血清经RDE处理。

结果（结论性描述）3免后14天，两种佐剂疫苗在小鼠体内均能产生较高水平的抗体，油乳佐剂疫苗组小鼠的HI抗体水平介于160到320之间，平均抗体水平为256；铝胶佐剂疫苗组小鼠的HI抗体水平也介于160到320之间，平均抗体水平为208，两种佐剂疫苗产生的抗体水平无明显差别，但铝胶佐剂疫苗组的抗体水平略低于油乳佐剂疫苗组的抗体水平；阴性对照组的小鼠均未产生流感病毒抗体（见表6）。

表6. 小鼠免疫效力试验结果

S2.犬的免疫效力试验

10周龄比格犬18只，HI检测均为H3亚型流感抗体阴性，随机分为6组。第1组犬通过皮下注射1ml油乳佐剂疫苗，第2组犬通过皮下注射1.5ml油乳佐剂疫苗，第3组犬通过皮下注射1ml铝胶佐剂疫苗，第4组犬通过皮下注射1.5ml铝胶佐剂疫苗。免疫2次，每次间隔14天。第5，6组犬均未注射疫苗。

结果（结论性描述）油乳佐剂疫苗组在一免后14天即可检测到较低水平的抗体，二免后7天，抗体水平达到最高值；铝胶佐剂疫苗组在二免后7天可检测到抗体，二免后14天抗体水平略有下降。二免后7天，两种疫苗产生的抗体水平均高于1：40，且抗体水平持续整个试验阶段。其他两组犬均未产生H3亚型流感病毒抗体。两种佐剂疫苗相比，油乳佐剂疫苗产生的抗体水平高于同期铝胶佐剂疫苗的抗体水平（见图1和表7）。

表7.疫苗免疫后各组犬HI抗体效价

S3.H3N2犬流感疫苗免疫保护性试验

S31.攻毒

S32.免后14天，第1，3，5组犬通过气管注射的方式接种2ml 10³EID₅₀的CGD4株病毒液，攻毒前，各组犬均通过肌肉注射0.15ml/kg的犬眠宝。第6组犬既未注射疫苗，也未攻毒。

临床症状和体温的监测 攻毒后1~10天，每日观察各组犬的临床症状，早晚监测各组犬的体温变化。

结果（结论性描述）整个攻毒阶段，两个疫苗组和空白对照组的犬均未表现出临床症状。阴性对照组的犬第2d开始出现单眼浓眼屎，精神沉郁，食欲下降等症状，后转为双眼浓眼屎，量变少，偶见喷嚏和咳嗽，第6天开始恢复正常。攻毒后72h，阴性对照组的犬出现发烧，平均体温达39.8℃，持续到攻毒后第5天，其他各组犬的体温整个攻毒阶段都介于38.5~39.5℃之间，属于正常变化范围（见图2）。

S33.攻毒后犬只排毒检测：攻毒后1~0天，每日采集各组犬的鼻咽拭子，通过RT-PCR方法检测每只犬的排毒情况。

结果（结论性描述）两个疫苗组在攻毒后第2天，通过RT-PCR方法可以检测到鼻腔排毒，持续到攻毒后第4天；阴性对照组，病毒排毒也是从第2天开始，持续到攻毒后第7天；空白对照组未检测到病毒排毒（见表8）。

表8. 攻毒后各组犬病毒分离阳性数

S34.攻毒后犬只抗体检测

各组犬在免疫0，7，14，21，28天，攻毒3，6，9，16天分别采集血液，制备血清，通过HI检测抗体水平，HI检测犬血清经RDE处理。

结果（结论性描述）

两个疫苗组攻毒后6天内，抗体水平未出现变化，均高于1：40，攻毒后第9天，抗体水平均出现显著升高，油乳佐剂疫苗组升高尤为明显；阴性对照组在攻毒后第9天可检测到抗体，空白对照组整个攻毒阶段未检测到抗体（见图3和表9）。

表9. 攻毒后各组犬的抗体水平

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 引物CU

<400> 1

agcaaaagca gg 12

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> CIV M片段特异性引物F

<400> 2

agcaaaagca ggtagatat 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> CIV M片段特异性引物R

<400> 3

agtagaaaca aggtagtttt 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> HA基因上游引物

<400> 4

agcaaaagca ggggtmyrat ct 22

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> HA基因下游引物

<400> 5

agtagaaaca agggtgtttt taactaca 28

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> NA基因上游引物

<400> 6

agcaaaagca ggagttyaaa atg 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> NA基因下游引物

<400> 7

agtagaaaca aggagttttt tsaac 25

<210> 8

<211> 1701

<212> DNA

<213> HA基因序列

<400> 8

atgaaaactg ttattgcttt aagctacatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcca 60

ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc gaacgggaca 120

atagtgaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccaccga gctagtccaa 180

aactcctcaa cagggaaaat atgcaacaat ccccacaaga tccttgatgg gagggactgc 240

acactaatag atgccctact aggggacccg cactgtgatg tcttccaaaa tgagacatgg 300

gacctttttg ttgaacgaag caatgctttc agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360

tatgcatccc ttcgatccat agttgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420

ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgcaaaag gggacctgct 480

aatggtttct tcagtagatt gaattggtta actaagtcag gaaatacata tccagtgttg 540

aatgtgacta tgccaaacaa taacaatttc gacaaattat acatttgggg ggttcatcac 600

ccaagcacta atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660

tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctggacc cttggtaagg 720

ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga cgtactggta 780

ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggctact tcaaaatgcg cattgggaaa 840

agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tctccgaatg tatcactccg 900

aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960

tgtcccaaat atgttaagca aaacaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020

gagaagcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggtt tcatagaaaa tggatgggaa 1080

gggatggtag acggttggta tggtttcagg caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140

gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaataaagtg 1200

attgaaaaaa cgaatgagaa gttccatcaa atcgaaaagg aattttccga agtagaaggg 1260

aggattcaag accttgagaa atacgttgaa gacacaaaag tagatctttg gtcttacaat 1320

gccgagcttc ttgttgcttt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380

aacaaattgt ttgaaaagac taggaagcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440

ggctgcttca agatatacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500

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gttgagctaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620

tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaacatt 1680

aggtgcaaca tttgcatttg a 1701

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<211> 1410

<212> DNA

<213> NA基因序列

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tgtttcctct tgcagattgc catcctagca acaactgtga cactgcactt caagcaaaat 120

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aacataacag aggtagtata tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgttccgta 240

gtgctagaat acaggaactg gtcgaaaccg cagtgtcaaa ttacaggatt tgctcctttc 300

tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tttgggtaac aagggaacct 360

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aacaataaac actcaaacgg cacaatacat gataggatct ctcatcgaac tcttttaatg 480

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gcgactgcta gtttcattta taatggaatg cttgttgaca gtattggttc atggtctcga 660

aatatcctca gaactcagga gtcagaatgc gtttgcatca atggaacttg tacagtagta 720

atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tactattcat cagagagggg 780

aaaattgtcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac atatagagga atgttcctgt 840

tatcctcaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctctaatagg 900

cccgttatag atataaatat ggcagattat agcatcgatt ccagttatgt gtgttcagga 960

cttgttggcg acacaccaag gaatgatgat agctctagta gcagcaactg cagggatcct 1020

aataatgaga gagggaatcc aggagtgaaa gggtgggctt ttgatgatga gaatgacgtt 1080

tggatgggga ggacaatcag caaagatttg cgctcaggtt atgagacttt caaggtcatt 1140

ggtggctgga ccactgctaa ttccaaatta caggtcaata gacaagtcat agttgacaat 1200

aataactggt ctggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg tgttaatagg 1260

tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320

aatagtattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380

ggggcgaata tcaacttcat gcctatataa 1410

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> NP-F1

<400> 10

ttatgctatg ggagttgg 18

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

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<400> 11

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<212> DNA

<213> CPIV-F

<400> 12

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gaagagtggt tgtaaataat t 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

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<400> 15

cctatataac caaagttagt ac 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> CAV-F

<400> 16

gcatgctcca agcgtacgtt att 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> CAV-R

<400> 17

cgcttctgtg ctctaagcta gcc 23

Claims (8)

1.一株H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，应用于制备治疗或/和预防由H3N2亚型CIV犬流感病毒侵染引起的疾病的药物。

2.根据权利要求1所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，所述药物为H3N2犬流感病毒灭活疫苗，所述疫苗含有保藏号为CGMCC NO：7218的H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1，H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1于2013年2月1日送交北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏。

3.根据权利要求2所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，所述H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1是H3N2犬流感病毒株CGD1通过噬斑纯化选育得到的。

4.根据权利要求2所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，所述H3N2犬流感病毒灭活疫苗的制备方法如下：

S1.将H3N2犬流感病毒疫苗株CIVGDYM1接种SPF鸡胚，接种量为0.1～0.2ml/胚，35～37 ℃孵育72～96h，收集病毒滴度不低于8价的活的鸡胚的尿囊液；

S2.将收集的尿囊液离心去除沉淀，收集上清经滤膜过滤，得到犬流感病毒毒液；

S3.灭活：将无菌检验合格的犬流感病毒毒液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为1‰，35～37℃灭活24～48h，4℃保存；

S4.疫苗的制备：将灭活的犬流感病毒毒液做成铝胶佐剂疫苗或油乳佐剂疫苗。

5.根据权利要求4所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，S1所述SPF鸡胚为9~11日龄SPF鸡胚。

6.根据权利要求4所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，S2所述离心的条件为2000~5000r/min，4℃离心20~30min。

7.根据权利要求4所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，S2所述滤膜的孔径为0.22um。

8.根据权利要求4所述H3N2犬流感病毒株CGD1的应用，其特征在于，S2所述4℃保存的保存时间不超过1个月。

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