CN110468109B - 一种h3n2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用 - Google Patents
一种h3n2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用。本发明采用病毒分离、培养、感染动物等技术，通过小鼠适应获得增强毒力及致病致死性氨基酸突变及缺失，获得了H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，该适应株能够引起小鼠致死性感染，为疫苗的研发、预防及治疗药物等效果评价，流感病毒感染，致病/和致死机制研究提供了有力的动物模型。此外，由于该鼠适应强毒株，其HA基因未出现突变，其抗原性未改变，可作为制备和/或基于抗体水平检测等基础实验研究用抗原。综上，本发明的适应强毒株，为研发H3N2亚型犬流感病毒疫苗及高效预防和/或治疗药物的筛选，感染，增强毒力等机制的研究提供了有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种犬流感病毒毒株，尤其涉及一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术
流感病毒(Influenza virus，IV)为正粘病毒科，直径为80～120nm，其结构由内向外分为核蛋白(NP)，基质蛋白(M)，包膜三个部分。其基因组RNA由8个节段的单链RNA组成，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因。目前己经发现的A型流感病毒具有18种HA亚型和11种NA亚型，其中H1～H16HA亚型和N1～N9NA亚型均来源于禽流感，而H17N10亚型和H18N11亚型仅见于蝙蝠。目前能够引起犬类感染的有H3、H6、H9亚型流感病毒，其中H3亚型已被确认为能够在体内稳定传播的特有毒株，被称为犬流感病毒(Canine influenza virus，CIVs)，分别来自马源H3N8和禽源H3N2。
中国、韩国和泰国主要流行株以禽源H3N2犬流感病毒为主，而欧美流行株多为马源H3N8亚型。自2006年韩国首次报道了由禽源H3N2流感病毒直接跨种感染犬，并在犬中传播扩散，与此同时中国、泰国也先后报道了该病的发生。近年来H3N2 CIVs在亚洲地区广泛流行，该毒株不仅发生在狗场，救护中心，宠物犬中也常有发生。2011年以前犬流感仅在我国南方流行，近年来逐渐由南方向北方扩散，并引起全国大范围流行。
H3N2 CIVs主要引起犬的呼吸道疾病，临床表现较为温和，大多在发病几天后便可恢复，在临床上较容易被忽视。但实验条件下，感染犬2-3周后仍可检测到少量的RNA和具有低感染能力的病毒。这为流感病毒在狗体内传播和进一步适应提供了机会，存在较为严重的潜在公共卫生风险。此外，在无继发细菌等感染的情况下，犬流感病毒在犬体内引起的临床症状较为温和，疫苗/药物等研制过程中评估效果存在一定的困难，因此目前获得稳定的动物感染模型和攻毒用强毒株尤为重要。但至今还未见有H3N2CIVs通过小鼠体内连续传代获得的适应性突变及致死性增强病毒株的报道。
发明内容
本发明针对目前预防及治疗犬流感药物、免疫用疫苗的评价模型的不足，对H3N2CIVs进行了相关研究，证实H3N2 CIVs能够引起小鼠体内感染，但不表现任何临床症状，通过小鼠适应获得一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用，该适应株为犬流感病毒疫苗的研发、预防及治疗药物等效果评价，流感病毒感染，致病/和致死机制研究提供了有力的动物模型。
本发明的目的之一是，提供一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株。
以及提供一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株的制备方法。
本发明的目的之二是，提供一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株的应用。包括：
作为一种强毒株在建立H3N2亚型犬流感病毒致病或致死动物感染模型中的应用。
以及作为一种检测用抗原在H3N2亚型犬流感病毒疫苗的免疫效果评价抗体水平检测中的应用。
以及作为实验材料在犬流感病感染机制和/或致死机制研究中的应用。
以及作为实验材料在获得适应细胞系MDCK发生病变及提高增殖滴度H3N2亚型犬流感病毒毒株中的应用。
以及作为实验材料在适应鸡胚繁殖获得高效价H3N2亚型犬流感病毒毒株中的应用。
以及在评价H3N2亚型犬流感病毒疫苗或治疗药物的安全性和有效性中的应用。
本发明的目的之三是，建立一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株的动物感染模型。具体为一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株小鼠致病或致死感染模型。
本发明的目的之四是，提供一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株小鼠致病或致死感染模型的应用。
包括：
在评价以H3N2亚型犬流感病毒鼠适应株为疫苗免疫、中药/中药提取物、化药的预防或治疗效果中的应用等。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，其为通过鼠适应后，获得包括但不限于PB2基因627K位点突变、PA基因531K位点突变以及NA基因颈部57位缺失的致病或致死性强毒株。
优选地，上述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，其HA基因序列如SEQ ID NO.1所示，其NA基因序列如SEQ ID NO.2所示，其NP基因序列如SEQ ID NO.3所示，其PA基因序列如SEQ ID NO.4所示，其PB1基因序列如SEQ ID NO.5所示，其PB2基因序列如SEQ ID NO.6所示，其M基因序列如SEQ ID NO.7所示，其NS基因序列如SEQ ID NO.8所示。
上述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18171，保藏日期为2019年6月26日，其分类命名为H3N2亚型犬流感病毒，毒株号为A/canine/Jilin/AMCQK7/2017(H3N2)。
为了实现上述目的，本发明还提供的上述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将H3N2亚型犬流感病毒分离株以20-30ul含量为106/100ulEID50接种于9g～10g BALB/c乳鼠，接种后第72小时，剖解取肺组织，研磨处理后，离心取上清液接种于9g～10g乳鼠；连续以鼠肺继续传代，直至小鼠肺脏出现典型流感病毒感染病理变化；
S2、取步骤S1肺脏出现典型流感病毒感染病理变化的代次小鼠的肺组织，进行研磨处理后，离心取上清液以25-35ul接种于11～13g BALB/c乳鼠；连续以鼠肺继续传代，直至小鼠肺脏出现典型流感病毒感染病理变化；
S3、取步骤S2肺脏出现典型流感病毒感染病理变化的代次小鼠的肺组织，进行研磨处理后，离心取上清液以40-50ul接种于14～16g BALB/c小鼠；连续以鼠肺继续传代，直至小鼠出现典型流感病毒感染临床症状；
S4、取步骤S3肺脏出现典型流感病毒感染病理变化的代次小鼠的肺组织，进行研磨处理后，离心取上清液以50-60ul接种于16～18g BALB/c小鼠；连续以鼠肺继续传代，直至小鼠出现典型流感病毒感染临床症状，并在1-5天内出现死亡；
S5、取步骤S4死亡鼠肺经研磨，接种于9日龄鸡胚，培养72小时后，4℃环境下放置30分钟，以收缩鸡胚中血管后，吸取尿囊液，离心获得H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株。
具体地，所述步骤S1肺脏出现典型流感病毒感染病理变化小鼠的代次为4-6代，所述步骤S2肺脏出现典型流感病毒感染病理变化小鼠的代次为10-12代，所述步骤S3出现典型流感病毒感染临床症状小鼠的代次为16-18代，所述步骤S4出现典型流感病毒感染临床症状并在1-5天内出现死亡的小鼠代次为24-26代。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明采用病毒分离、培养、感染动物等技术，通过小鼠适应获得增强毒力及致病致死性的氨基酸突变及缺失，获得了H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株。该适应株能够引起小鼠致死性感染，为疫苗的研发、预防及治疗药物等效果评价，流感病毒感染，致病/和致死机制研究提供了有力的动物模型。
同时，本发明通过建立稳定的犬流感病毒H3N2感染致病/致死动物感染模型，获得适应细胞系MDCK及鸡胚的高病毒增殖及血凝滴度的毒株。
此外，由于该H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，其HA基因未出现突变，其抗原性未改变，可作为制备和/或基于抗体水平检测等基础实验研究用抗原。
综上，本发明的适应强毒株，为研发H3N2亚型犬流感病毒疫苗及高效预防和/或治疗药物的筛选，感染，增强毒力等机制的研究提供了有力的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为分离野毒株PCR结果，由左向右依次为：DL5000，PB2，PB1，PA，NP，HA，NA，M，NS，DL2000。所有扩增片段均符合目的基因片段大小。
图2为鼠适应株肺组织病理变化情况。
图3为野毒株和鼠适应株引起小鼠死亡情况。
图4为野毒株和鼠适应株小鼠体重变化情况。
图5为本发明小鼠第26代能够导致小鼠死亡的鼠适应株与野毒株在鸡胚细胞扩增后产生的病毒的血凝滴度比较。图中，前两行为鼠适应株，后两行为野毒株。
图6为本发明小鼠第26代能够导致小鼠死亡的鼠适应株与野毒株在细胞系中引起的细胞病变对比，图中，左为接种鼠适应株的MDCK细胞系，右为接种无菌PBS(pH:7.0)的细胞对照。
图7为本发明小鼠第26代能够导致小鼠死亡的鼠适应株和野毒株在细胞系中产生的病毒的血凝滴度比较，图中，前三行为鼠适应株感染细胞，后三行为野毒株感染细胞。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1毒株的分离鉴定及培养
自2016年以来，我国H3N2 CIVs引起全国范围内流行，2016年流行株与06年亚洲流行株为不同进化分支。而目前该进化分支毒株在我国全国范围内广泛流行。本发明在2017年从吉林市一例具有呼吸道临床症状的宠物犬口腔拭子中检测到一株新型H3N2 CIVs(简称为QK32)，并在鸡胚尿囊液中获得分离株。分离方法为：将添加无菌PBS(pH:7.2)病犬口腔拭子涡旋振荡30秒，置4℃离心机以4000r/min，离心5min。吸取上清液加入终浓度为1000IU青链霉素，接种9日龄SPF胚，放置于37℃孵化箱培养72h，4℃冷藏环境下冷藏0.5h后，吸取尿囊液测定血凝性同时吸取100μl提取核酸。
使用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP315R)提取分离株QK32的RNA。提取过程、方法如下：
1)吸取560μl Carrier RNA工作液加入无菌1.5ml EP管中；2)向离心管中加入140μl已平衡至室温的鸡胚尿囊液，涡旋振荡15秒使其充分混匀。并在室温环境下孵育10分钟，暂短离心；3)加入560μl冰浴的无水乙醇后涡旋振荡，暂短离心；4)吸取EP管中630μl液体加入RNase-Free吸附柱CR2并确定放置收集管中，8000rpm离心分钟，弃掉废液放回收集管中，并重复一次；5)向吸附柱中加入500μl溶液GD，8000rpm离心分钟，弃掉废液放回收集管中；6)向吸附柱中加入500ul溶液RW，8000rpm离心1分钟，弃掉废液放回收集管中，并重复一次；7)以12000rpm离心3min，使吸附膜变干；8)将吸附柱放入一个RNase-Free EP管中，悬空加入50μl RNase-Free ddH2O，室温放置5分钟，以8000rpm离心1分钟。
使用AMV反转录酶(购自于Promega公司)配制反转录体系如下：5×AMV Buffer 10μl；dNTP(10μM)7μl；AMV 1μl；RRI 1μl；U12
(AGCAAAAGCAGG)1μl；补加DEPC(H20)至50μl并充分混合均匀，置42℃水浴60min。反转录得到cDNA。
以所有片段的非编码区全序列起始位点及终止位点设计引物(如表1)，分别进行PCR扩增。采用高保真酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，配制PCR扩增体系如表2，PCR反应程序为：98℃预变性30s→98℃变性20s→55℃退火30s→72℃延伸60s/kb(33个循环)→72℃后延伸7min。
表1 所有片段的非编码区全序列起始位点及终止位点引物序列
表2 PCR扩增体系
PCR结束后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在胶孔的每个孔中加入50μl样品(PCR扩增产物)，电压120V，时间30min，电泳结束后置于紫外凝胶成像仪系统内观察结果，犬流感病毒分离株QK32(野毒株)PCR检测结果如图1所示，从左至右依次为DL5000、HA1778bp、NA 1413bp、NP 1565bp、PA 2233bp、PB1 2341bp、PB2 2341bp、M 1027bp、NS 890bp、DL2000。
将目的基因片段送测序公司进行基因测序测定，获得分离株QK32基因序列，其HA基因序列如SEQ ID NO.9所示，其NA基因序列如SEQ ID NO.10所示，其NP基因序列如SEQ IDNO.11所示，其PA基因序列如SEQ ID NO.12所示，其PB1基因序列如SEQ ID NO.13所示，其PB2基因序列如SEQ ID NO.14所示，其M基因序列如SEQ ID NO.15所示，其NS基因序列如SEQID NO.16所示。将基因序列在GenBank数据库中进行同源性比对，发现PB2基因与A/canine/Beijing/20170512-122/2017(H3N2)(ID:MK212710.1)，A/Canis lupus familiaris/USA/188226/2017(H3N2)(ID:MK690150.1)，A/canine/Korea/AS-09/2012(H3N2)(ID:MH105901.1)同源性均为100.0％。PB1基因与A/canine/Beijing/20170528-148/2017(H3N2)(ID:MK212671.1)，A/canine/Indiana/96198/2015(H3N2)(ID:KX571006.2)，A/canine/North Carolina/109904/2015(H3N2)(ID:KX571003.2)同源性均为100.0％。PA基因与A/canine/Beijing/20170417-83/2017(H3N2)(ID:MK212760.1)，A/Canis lupusfamiliaris/USA/188305/2017(H3N2)(MK690164.1)，A/canine/Illinois/A37/2017(H3N2)(ID:MH266317.1)同源性均为100.0％。NP基因与A/canine/Beijing/20170512-137/2017(H3N2)(ID:MK212698.1)，A/canine/Florida/20170606-9/2017(H3N2)(ID:MG982735.1)，A/Canis lupus familiaris/USA/188297/2017(H3N2)(ID:MK690154.1)同源性均为100.0％。M基因与A/Canis lupus familiaris/USA/188305/2017(H3N2)(ID:MK690160.1)，A/canine/Florida/88807.2/2017(H3N2))(ID:MH363692.1)同源性均为100.0％，与A/canine/Korea/AS-03/2012(ID:H3N2)(MH105836.1)同源性为99.0％。NS基因与A/Canislupus familiaris/USA/188305/2017(H3N2)(ID:MK690159.1)，A/canine/Florida/88807.2/2017(H3N2)(ID:MH363694.1)同源性均为100.0％，与A/canine/Beijing/20170604-164/2017(H3N2)(ID:MK212665.1)同源性为99.0％。HA基因与A/Canis lupusfamiliaris/USA/188305/2017(H3N2)(ID:MK690163.1)，A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)(ID:MH363669.1)同源性均为100.0％，与A/canine/Beijing/20170528-147/2017(H3N2)(ID:MK212453.1)同源性为99.0％。NA基因A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)(ID:MH363676.1)，A/canine/California/BRW003/2018(H3N2)(ID:MK690587.1)同源性均为100.0％，与A/canine/Beijing/20170720-30/2017(H3N2)(ID:MK212563.1)同源性为99.0％，根据以上结果，该分离株被鉴定为H3N2亚型犬流感病毒株。
将鉴定为阳性的分离株样品，加入500ul PBS置漩涡振荡1min，4℃离心5min，取上清100ul按照梯度稀释法接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，37℃培养72小时后，置4℃环境下预冷30min，吸取鸡胚尿囊液，以0.5～1％的鸡红细胞，按照Reed-Muench法，测定血凝滴度。测定结果EID为106.33/100ul。
将鉴定为阳性的分离株样品，接种于状态良好的单层MDCK细胞，置33℃放置1.5小时后，加入血清浓度为1％，IPCK胰酶浓度为0.1ug/ml的DMEM培养基，置37℃，5％CO2培养箱种培养24小时，换液一次，继续培养至第72小时，干冰及流水下反复冻融3次。置4℃离心机5000转离心10min。弃去沉淀，收获病毒液。按照梯度稀释法接种于96孔板，测定血凝滴度。测定结果TCID50为106.33/50ul。
实施例2H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株的制备
本发明以QK32做为原始毒株，经过多次尝试改变接种BALB/c小鼠日龄及接种病毒的含量，最终确定一种制备方法获得能够导致小鼠致死的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株。具体操作方法如下：
第一步：以25ul含量为106/100ulEID50分别以双侧滴鼻法接种于9g～10g BALB/c乳鼠，接种后第72小时，剖解取肺组织，干冰速冻后置组织匀浆仪中研磨，8000×g 5min,取上清，再次置12000×g 5min，取上清组织液接种于9g～10g BALB/c乳鼠，每只鼠接种病毒液为25ul。连续以鼠肺继续传代，直至小鼠肺脏出现典型流感病毒感染病理变化，如图2所示，该代次为5代。
第二步：取第5代小鼠肺组织，按照以上步骤进行研磨处理后，取上清液25ul接种于11～13g BALB/c乳鼠，接种第72小时后剖杀，取肺组织，连续传代至小鼠临床表现呼吸困难，被毛蓬松，蜷缩等，剖解见肺部眼观病理变化，该代次为第12代。
第三步：按照第一步方法，将第12代组织研磨液接种于14～16g BALB/c小鼠7只，每只接种量为50ul，观察临床变现，取在接种后72小时出现呼吸困难，被毛蓬松临床症状的小鼠断颈部处死，剖杀取肺组织，该代次为18代。
第四步：按照第一步方法进行肺组织研磨处理，离心后取50ul上清，接种于16～18g BALB/c小鼠，并连续传代直至接种小鼠出现典型临床症状，并逐渐出现死亡。该代次为第26代，从第三天小鼠开始死亡。第五天所有接种小鼠全部死亡。
第五步：取死亡鼠肺经研磨，接种于9日龄鸡胚，培养72小时后，4℃环境下放置30分钟，以收缩鸡胚中血管后，吸取尿囊液，离心获得鼠适应强毒株。
本发明以尝试逐渐增加小鼠日龄及体重(观察结果见图3和图4)，其中，接种鼠适应株的小鼠，从第三天开始死亡，第五天所有接种小鼠全部死亡，而与适应第26代的适应株同时接种的野毒株组小鼠和空白对照组小鼠，15天内均未出现死亡。
最终获得一株能够引起体重为16～18g小鼠在5天内全部致死的鼠适应强毒株，并进行保藏，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18171，保藏日期为2019年6月26日，其分类命名为H3N2亚型犬流感病毒，毒株号为A/canine/Jilin/AMCQK7/2017(H3N2)。
实施例3本发明的鼠适应强毒株的鉴定
取实施例2第26代鼠肺组织研磨液，采用实施例1方法提取病毒核酸，经反转录获得cDNA，使用实施例1中引物序列及PCR反应条件进行扩增。通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收后进行序列测定。鼠适应强毒株的HA片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.1所示，其NA片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.2所示，其NP片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.3所示，其PA片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.4所示，其PB1片段的非编码区全序列如SEQ IDNO.5所示，其PB2片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.6所示，其M片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.7所示，其NS片段的非编码区全序列如SEQ ID NO.8所示。
将鼠适应强毒株与实施例1的原始分离株(QK32)比对序列发现，在PB2中有一处位点突变，在PA中有一处位点突变，在NA颈部有1个位点的缺失，结果见表3。
表3 鼠适应强毒株突变位点
| 毒株 | PB2 | PA | NA |
| H3N2第26代鼠适应株 | 627K | 531K | 57缺失 |
实施例4本发明的鼠适应强毒株鸡胚繁殖及血凝滴度测定
将实施例2第26代小鼠肺组织干冰速冻后置组织匀浆仪中研磨，8000转离心5min，取上清，置12000转离心5min，取鼠肺组织研磨液，加入青链霉素使终浓度为1000UI。取处理好的组织研磨液200ul，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，作为实验组。同时将实施例1的原始分离毒株QK32(野毒株)200ul，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，作为对照组。两组分别置37℃孵化箱培养72小时。4℃环境中放置30min，吸取鸡胚尿囊液，置4℃离心机5000转离心10min，弃去沉淀，收获病毒液，以0.5～1％的鸡红细胞，按照Reed-Muench法，同时测定原始毒株与鼠适应毒株的血凝滴度。
结果如图5所示，第1-2行为实验组(鼠适应株)，从左至右第1孔为稀释2×，第2孔为稀释4×，如此依次以2×稀释至第11孔，第12孔为鸡红细胞对照孔，可见鼠适应株鸡胚毒稀释至第9孔仍具有血凝性，HA滴度为29/50ul。第3-4行为对照组(原始毒株)，从左至右第1孔为稀释2×，第2孔为稀释4×，如此依次以2×稀释至第11孔，第12孔为鸡红细胞对照孔，可见原始毒株鸡胚毒HA滴度为26/50ul。鼠适应株的血凝滴度为原始毒株的8倍。因此，本发明的鼠适应株可作为实验材料应用在适应鸡胚繁殖获得高效价H3N2亚型犬流感病毒毒株中。
实施例5本发明的鼠适应强毒株细胞繁殖及血凝滴度测定
按照实施例4的组织处理方法，将实施例2第26代小鼠肺组织研磨后，取研磨液100ul加入状态良好的单层MDCK细胞(25cm2)，另加入400ul DMEM，置33℃每隔15min轻轻摇动一次，使液体均匀分布在细胞瓶底部，1.5h后补加含1％胎牛血清DMEM，另加入IPCK胰酶使终浓度为0.1ug/ml，置37℃，5％CO2培养箱种培养24小时换液。当接种第48小时，细胞出现典型流感病毒病变状态，如图6所示，其中，左图为接种鼠适应株MDCK细胞系，表现为细胞圆缩、团聚等现象，右图为细胞对照，接种无菌PBS(pH：7.0)，并未表现任何异常。
继续培养细胞出现病变量为80％，即接种后第72小时。将整个细胞瓶置液氮中迅速冰冻，后置流水解冻，如此反复冻融3次。置4℃5000转离心10min。弃去沉淀，收获病毒液。按照梯度稀释法接种于96孔板，鼠适应毒株作为实验组，实施例1的原始毒株作为对照组，同时测定原始毒株与鼠适应毒株的血凝滴度。
如图7，第1-3行为实验组(鼠适应强毒株)，从左至右第1孔为稀释2×，第2孔为稀释4×，如此依次以2×稀释至第11孔，第12孔为鸡红细胞对照孔。可见鼠适应株细胞毒稀释至第9孔仍具有血凝性，HA滴度为29/50ul。第4-6行为对照组原始毒株，从左至右第1孔为稀释2×，第2孔为稀释4×，如此依次以2×稀释至第11孔，第12孔为鸡红细胞对照孔，可见原始毒株细胞毒HA滴度为25/50ul，鼠适应株细胞毒为原始毒株细胞毒的16倍，因此，本发明的鼠适应强毒株可作为实验材料应用在获得适应细胞系MDCK发生病变及提高增殖滴度H3N2亚型犬流感病毒毒株中。
实施例6本发明的鼠适应株在小鼠感染模型建立中的应用
首先进行鼠适应株EID50的测定：将病毒株置于冰水浴中缓慢融化，以10×倍比稀释至10-12，按照梯度吸取病毒稀释液100ul分别接种于9日龄SPF级鸡胚，设置3个重复。置于37℃孵化箱培养72h后取出置4℃冷藏环境下冷藏0.5h后，依次吸取尿囊液50ul加入96孔V型板中，另取50ul1％鸡红细胞加入样品空中，室温静置30min后观察血凝性，并按照Reed-Muench法计算鼠适应株EID50。
鼠适应株MLD50的测定：根据鼠适应株稀释为106EID50/50ul后，以10×倍比稀释至102EID50/50ul，并吸取各梯度病毒稀释液50ul，分别以鼻内接种于5只小鼠20g左右雌性小鼠。每日观察存活情况，至第14天，如果体重低于感染前体重的25％，被定义为死亡，并进行安乐死。计算总死亡数并按照Reed-Muench法计算鼠适应株MLD50。通过MLD50计算获得能够导致攻毒组小鼠100％致死的最小剂量105EID50/50ul为攻毒剂量。
取能够导致小鼠100％致死的最小剂量为攻毒剂量用于攻毒实验研究。选取17只SPF级BALB/c小鼠，体重为14～15g，分为三组。第一组为鼠适应株感染组，小鼠数量为7只，取实施例2的鼠适应株。第二组为原始毒QK32感染组，小鼠数量为7只，取实施例1的原始毒QK32。第三组为空白对照组，小鼠数量为3只。以异氟烷吸入性麻醉后滴鼻攻毒，剂量为105EID50/50ul。每日观察小鼠临床表现及记录临床变现。
经观察第1组第三天死亡2只，第四天死亡4只，第五天全部死亡。而第二组7只小鼠全部存活。第三组对照组所有小鼠全部健活。
分析结果：本发明的鼠适应株在第五天导致所有感染鼠死亡，而感染原始毒株的小鼠虽体重较空白对照有所减轻，但均为出现死亡。
由此可见，本发明的鼠适应强毒株，可用于建立犬流感病毒H3N2感染、致病/致死动物感染模型，同样可用于评价中药和/或中药提取物、化药等预防及治疗效果评价，以及作为实验材料应用在犬流感病感染机制和/或致死机制研究中等。
实施例7本发明的鼠适应强毒株作为检测用抗原的应用
通过小鼠适应性传代获得能够增强小鼠感染性和致死性适应性突变，但经适应后该毒株HA基因未发生突变，通过采集经感染原始毒株的比格犬获得免疫血清进行抗原差异比较。
实验方法：采集感染原始毒株H3N2犬流感病毒第21天比格犬的全血，待凝血后放置4℃冰箱中过夜，以4000rpm离心5min，吸取血清，以56℃水浴热灭活30min，并做10倍稀释。分别以原始毒株和鼠适应株灭活毒为测定用抗原。配制4单位抗原，测定抗体水平，比较抗原性差异。
具体步骤如下：
1、取96孔V型血凝板，以左上角为第1孔起每孔加入50ul无菌PBS至第12孔，取50ul灭活抗原加入左上角第1孔，使用吸头充分混匀后吸取50ul加入第2孔，继续以吸头吸吹法充分混匀，避免产生气泡，按此方法依次梯度稀释至第11孔，吸取第11孔稀释液弃掉。依次由右(对照孔)向左依次加入50ul 1％鸡红细胞，于室温(25℃左右)静置30min后观察其血凝价。
2、根据血凝价配制4HAUs抗原(即为4个能够100％凝集1％鸡红细胞的血凝单位)，配制方法为：
1)配置抗原8HAUs抗原：8HAUs/50ul的稀释倍数为能够100％凝集1％鸡红细胞的最高稀释倍数/23，(如血凝价为29，8HAUs/50ul稀释倍数为29/23＝26，即为64倍)，用于HAI试验的抗原为4HAUs/25ul。
2)8HAUs校验：取96孔V型血凝板，每孔加入50ul无菌PBS(pH：7.0)，另取50ul配制好的8HAUs抗原加入第1孔，依次稀释至第6孔，另加入50ul 1％鸡红细胞，室温(25℃)静置30min。应凝集至第3孔，即为8HAUs。
3、HI血凝效价的测定方法：
1)取96孔V型血凝板，每孔加入25ul无菌PBS，以左上角第1孔为起始孔加入25ul待检血清，依次2×倍比稀释至第10孔；
2)取25ul校验好的8HAUs/50ul(即4HAUs/25ul)由第11孔倒序依次加入至第1孔，轻柔振荡混匀后，室温静置30min。
3)每孔加入50ul 1％鸡红细胞，轻柔振荡混匀后，室温静置30min，判读结果。
实验结果：通过实验证明原始株和鼠适应株抗体水平均为1：320，两者无差异，说明鼠适应强毒株抗原性未发生变化，可作为检测用抗原应用，如在H3N2亚型犬流感病毒株疫苗的免疫效果评价抗体水平检测中的应用等。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株及其应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1701
<212> DNA
<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 1
atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60
ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc gaacgggaca 120
atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180
aactcctcaa cagggaaaat atgcaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gagggactgc 240
acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300
gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360
tatgcatccc tccgatccat agttgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420
ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgct 480
aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcag gaaatacata tccagtgttg 540
aatgtgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600
ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660
tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720
ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780
ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaatgca cattgggaaa 840
agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900
aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960
tgtcccaaat atgttaagca aaacaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020
gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080
gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140
gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200
attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260
aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320
gccgagcttc ttgttgcctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380
aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440
ggctgcttca aaatctacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500
acttatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaggt 1560
gttgagctaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620
tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaacatt 1680
aggtgcaaca tttgcatttg a 1701
<210> 2
<211> 1407
<212> DNA
<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 2
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tgtttcctct tacagattgc catcctagca acaactgtga cactgtactt caagcaaaat 120
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ataacagagg tagtacattt gaataatact accatagaaa aagaaatttg ctccgtagtg 240
ctagaataca ggaactggtc gaaaccgcag tgtcaaatta caggatttgc tcctttctcc 300
aaggacaact caatccgact ctccgctggt ggggacattt gggtaacaag ggaaccttat 360
gtgtcatgcg accccagcaa atgttatcag tttgcacttg ggcaggggac cacactgaac 420
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actgctagtt tcgtgtataa tggaatgctt gttgacagta ttggttcatg gtctcgaaat 660
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actgatggaa gtgcatcagg aagggctgat actagaatac tattcatcag agaggggaaa 780
attatccata ttagcccatt gtcagggagt gctcaacaca tagaggaatg ttcctgttat 840
ccccaatatc caaatgttag atgtgtttgc agagacaatt ggaagggctc caataggccc 900
gttatagata taaatatggc agattataac atcaattcca gttatgtgtg ttcaggactt 960
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gcgaatatta acttcatgcc tatataa 1407
<210> 3
<211> 1497
<212> DNA
<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 3
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<211> 2151
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<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 4
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<210> 5
<211> 2274
<212> DNA
<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 5
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gctgagatcg tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atag 2274
<210> 6
<211> 2280
<212> DNA
<213> 犬流感病毒(Canine influenza virus)
<400> 6
atggaaagaa taaaagaatt aagagatcta atgtcgcagt cccgcactcg cgagatacta 60
acaaaaacca ctgtggacca catggccata atcaagaaat atacatcagg gagacaagag 120
aagaaccctg ctctcagaat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat cacagcagac 180
aagagaataa tggaaatgat tcctgaaagg aatgaacaag ggcagatact ttggagtaag 240
acaagtgacg ctggatcgga cagggtgatg gtgtctccct tagctgtaac ctggtggaac 300
agaaatgggc cgacgacaag tacagtccac tatccaaagg tttacaaaac atactttgag 360
aaggttgaaa ggttaaaaca tggaaccttc ggtcccgttc atttccgaaa ccaagttaaa 420
atacgccgcc gagttgatac aaatccgggc catgcagatc tcagtgctaa agaagcacaa 480
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Claims (5)
1.一种H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，其特征在于，通过鼠适应后，获得PB2基因627K位点突变、PA基因531K位点突变以及NA基因颈部57位缺失的致病或致死性强毒株，所述毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18171，保藏日期为2019年6月26日，其分类命名为H3N2亚型犬流感病毒，毒株号为A/canine/Jilin/AMCQK7/2017(H3N2)。
2.根据权利要求1所述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株，其特征在于，其HA基因序列如SEQ ID NO.1所示，其NA基因序列如SEQ ID NO.2所示，其NP基因序列如SEQ ID NO.3所示，其PA基因序列如SEQ ID NO.4所示，其PB1基因序列如SEQ ID NO.5所示，其PB2基因序列如SEQ ID NO.6所示，其M基因序列如SEQ ID NO.7所示，其NS基因序列如SEQ ID NO.8所示。
3.权利要求1-2任一项所述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株在建立H3N2亚型犬流感病毒致病或致死动物感染模型中的应用。
4.权利要求1-2任一项所述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株在制备适应细胞系MDCK的H3N2亚型犬流感病毒毒株中的应用。
5.权利要求1-2任一项所述的H3N2亚型犬流感病毒鼠适应强毒株在制备适应鸡胚繁殖的H3N2亚型犬流感病毒毒株中的应用。
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