CN113234689A

CN113234689A - 一株鸡传染性支气管炎病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN113234689A
Application number: CN202110549500.0A
Authority: CN
Inventors: 王晨燕; 侯博
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-05-20
Also published as: CN113234689B

Abstract

本发明提供一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其分类命名为：IBV‑CK/CH/FJ/202005，该毒株于2021年2月4日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202116，保藏地址：中国．武汉．武汉大学。该毒株对鸡只具有较强的致病力，能应用于作为攻毒毒株，在鸡疫情防控具有重要意义。

Description

一株鸡传染性支气管炎病毒毒株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株鸡传染性支气管炎病毒株及其应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious bronchitis， IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种家禽呼吸道病。该病毒可感染各年龄段鸡群，包括蛋鸡和肉鸡，主要引起亚临床症状的呼吸系统疾病、气囊炎、肾脏和生殖道疾病，从而导致鸡群产蛋量下降和生长率降低，同时还可与其他病毒混感，给养禽业造成很大的经济损失。

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属冠状病毒科冠状病毒属，单股正链RNA病毒，由于其基因组RNA复制不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对性，IBV易发生病毒变异和基因重组。中国在1982年首次报道鸡群中存在IBV，目前已从临床分离得到不同基因型的IBV毒株，包括GI-7，GI-16（Q1），GI-19（包括QX，A2和LX4），GI-22，GI-28，GVI以及新分离未定型毒株，临床主要表现为气囊炎、肾炎和生殖系统炎症等。不同基因型之间交叉保护率低。尽管现有较多的不同基因型的IBV疫苗在鸡场广泛使用，包括4/91疫苗、H120疫苗和QX疫苗等弱毒苗，但疫苗的大量使用使得IBV出现了不同程度的免疫逃避、基因重组等，导致从已免疫的鸡群中分离到疫苗重组毒株，使得免疫预防日益困难和复杂化。

目前，国内主要流行的IBV基因型为GI-19（QX），鸡只感染该基因型毒株后临床可表现为气囊炎、肾炎和输卵管炎等，部分分离毒株可造成SPF鸡只在攻毒后出现死亡，具有很强的致病力。IBV GVI毒株在2007年首次被分离到，然而具有致病力的GVI毒株尚未见报道，由于缺少实时对该基因型流行情况的监测及致病力的正确认识，无法提供可靠、有效的防控手段，造成实际临床中无法评估鸡群感染GVI毒株后生产中所带来的损失，可能会对IB的防控造成不利的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一株致病力强、适用于在疫苗免疫攻毒保护中作为攻毒毒株的鸡传染性支气管炎病毒毒株。

一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，所述鸡传染性支气管炎病毒毒株，其分类命名为：IBV-CK/CH/FJ/202005，该毒株于2021年2月4日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202116，保藏地址：中国．武汉．武汉大学。

上述的一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其S1 基因全长1638 bp，其核苷酸序列如SEQ ID. NO1所示。

上述一株鸡传染性支气管炎病毒毒株在疫苗免疫攻毒保护中作为攻毒毒株的应用。

通过对福建省某鸡场疑似感染鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的鸡群采集气管、肺脏和肾脏混合后进行IBV的分离和鉴定，获得一株命名为IBV-CK/CH/FJ/202005的病毒株。扩增IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株S1基因序列进行遗传进化树分析，结果表明该毒株与目前国内普遍使用的IBV疫苗株如H120株，M41株的亲缘关系较远，属于距离关系较远的GVI，由于不同基因型的IBV毒株交叉保护力差，可能出现在临床上现有疫苗无法对该毒株产生很好的保护作用。

上述的一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，采用气囊炎评分方式（0-4分）对发病鸡只的胸气囊和副气囊进行临床症状评分。

本发明通过用IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株纯培养物感染1日龄的SPF鸡，发现该毒株具有较强的致病力，攻毒后第5天鸡只开始出现气囊炎，发病率为40%，第10天鸡只100%出现气囊炎，攻毒后5 d气管病毒再分离为100%。同样用IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株纯培养物感染15日龄的SPF鸡，攻毒后第5天鸡只出现气囊炎，发病率为57.1%，攻毒后5 d气管病毒再分离为14.2%。1日龄和15日龄鸡只剖检临床症状主要以气囊炎为主，虽然发病率和气管病毒再分离结果存在差异，但是攻毒组气囊平均损伤评分在攻毒后第10 d最高，攻毒后第5 d和10 d都能从气管中再分离出IBV-CK/CH/FJ/202005病毒。采用1羽份鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）免疫鸡群21d后，采用IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株纯培养物进行攻毒，7 d后免疫攻毒组气管病毒再分离为80%，阳性对照组为100%，表明无法有效保护鸡群免受IBV-VI型毒株的感染，因此，IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株纯培养物能作为疫苗保护试验攻毒毒株。

本发明的优点在于：

本发明经分离和鉴定，获得一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其分类命名为：IBV-CK/CH/FJ/202005，该毒株于2021年2月4日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202116，保藏地址：中国．武汉．武汉大学。通过扩增IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株S1基因全长序列进行遗传进化树分析，结果表明该毒株与目前国内普遍使用的疫苗株如H120株，M41株的亲缘关系较远，属于距离关系较远的GVI基因型，该毒株对鸡只具有较强的致病力。本发明的毒株作为疫苗保护试验攻毒毒株提供原材料。在鸡疫情防控具有重要意义。

附图说明：

图1：S1基因的系统进化树分析图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1毒株的分离和鉴定

一株鸡传染性支气管炎病毒毒株的分离和鉴定，包括以下步骤：

1）病料处理：从福建某鸡场有轻微呼吸道症状的病鸡中采集气管、肺和肾脏，将其混合按常规方法进行组织匀浆，4℃，12000 rpm离心10 min，取上清液用 0.45 μm滤器过滤除菌，取140 μL上清液提取RNA并反转录成cDNA后进行PCR检测。IBV检测引物序列参考国家标准《鸡传染性支气管炎诊断技术》GB/T 23197-2008，引物序列为：5'-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3'（F）；5'-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3'（R）。

2）病毒分离：取阳性病料上清液0.2 mL接种于9日龄SPF鸡胚，共接种5枚鸡胚，孵育3 d。每天照蛋，弃掉24 h以内死亡鸡胚，收集接种后3 d内的鸡胚尿囊液，将所有尿囊液混合，继续胚内传代。将分离物连续经鸡胚传代3代以适应鸡胚培养，可见较为明显的侏儒胚，并出现鸡胚死亡，收获的最后一代鸡胚尿囊液放置于-70℃保存。

3）病毒纯化：采用有限稀释法，取盲传最后一代的鸡胚尿囊液100 μL用无菌的1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）进行倍比稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释度尿囊腔途径各接种5枚9日龄的鸡胚，接种量为0.1 mL/枚，弃去24 h内死亡鸡胚，逐日观察记录并收取24 h以后死亡的鸡胚，6 d后将剩余鸡胚放置于4℃冰箱保存过夜，次日收取24 h以后死亡和非死亡鸡胚尿囊液，并进行RT-PCR鉴定，取最高稀释度的阳性尿囊液进行下一次纯化。采用该方法取最高稀释度的阳性尿囊液连续纯化3次，并将收获的尿囊液放置于-70℃保存。

4）扩繁：取最后一次纯化的阳性尿囊液接种于9日龄SPF鸡胚，每个胚接种100 μL，共接种10枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，逐日观察记录并收取24 h以后死亡的鸡胚，48 h后将剩余鸡胚放置于4℃冰箱保存过夜次日收获所有尿囊液，每1 mL分装记为P0代，并放置于-70℃保存。

5）外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明分离纯化的病毒株无外源病毒污染。

6）对毒株IBV-IBV-CK/CH/FJ/202005进行生物保藏。毒株IBV-IBV-CK/CH/FJ/202005保藏于中国典型培养物保藏中心；其保藏编号为：CCTCC NO：V202116，保藏地址：中国．武汉．武汉大学；保藏日期：2021年2月4日。

上述PBS的制备：称取8.0g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄和1.44g Na₂HPO₄，充分溶于800 mL双蒸水中，用浓HCl调节溶液pH值至7.2，最后蒸馏水定容至1 L。高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存备用。

实施例2 IBV-CK/CH/FJ/202005 P0代毒株的滴度测定

取扩繁的P0代病毒液100 μL用无菌的1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）进行倍比稀释，分别10倍稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7共7个稀释度，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释度各接种5枚9日龄的SPF鸡胚，接种量为0.1 mL/枚，弃去24 h内死亡鸡胚，逐日观察记录并收取24 h以后死亡的鸡胚，7 d后全部鸡胚放置于4℃冰箱保存过夜，次日收取24 h以后死亡和非死亡鸡胚尿囊液，观察存活鸡胚出现侏儒胚则记为感染，并对收集的尿囊液采用RNA提取试剂盒提取RNA，并进行RT-PCR鉴定，采用Reed-Muench法计算EID₅₀，重复测定3次，最终该毒株的EID₅₀为10^-6.17/ mL（见表1a,1b,1c）。

表1a 第1次Reed-Muench法计算EID₅₀

采用Reed-Muench法计算，攻毒毒株的EID₅₀=10^-6.33/ mL。

表1b 第2次Reed-Muench法计算EID₅₀

采用Reed-Muench法计算，攻毒毒株的EID₅₀=10^-6.17/mL。

表1c 第3次Reed-Muench法计算EID₅₀

采用Reed-Muench法计算，攻毒毒株的EID₅₀=10^-6.37/mL。

实施例3 S1基因扩增以及进化树分析

采用RNA提取试剂盒提取IBV-CK/CH/FJ/202005毒株P0代RNA，并用RT试剂将其反转录成cDNA，利用S1基因引物扩增全长序列。S1基因全长引物序列如下：5'- TGAAAACTGAACAAA AGAC-3'（F）；5'- CATAACTAACATAAG GGCAA -3'（R）。PCR 反应程序：95℃，预变性 5 分钟；95℃，变性 30 秒，50℃，退火1 分钟，68℃，延伸 2 分钟，共 35 个循环；最后于 68℃，延伸 10 分钟。25 μL PCR 产物在1wt%的琼脂糖上电泳，然后在紫外照射仪下进行切胶，用DNA回收试剂盒回收PCR产物，送生物公司测序。测序结果表明IBV-CK/CH/FJ/202005毒株S1基因组核苷酸序列全长1638 bp，序列如SEQ ID NO.1所示。

使用Lasergene软件包（DNAStar，Madison，WT）中的Edit Seq和Meg Alin程序与其他22株参考IBV毒株（见表2）进行S1基因序列比较分析，并利用MEGA 7构建S1基因系统进化树。如图1所示，本发明所提供的IBV-CK/CH/FJ/202005毒株与国内大部分流行毒株的亲缘关系较远，该毒株与其他参考毒株的S1基因核苷酸同源性为57.45%~97.80%，属于GⅥ，与目前临床使用的弱毒疫苗株如H120株、M41株的亲缘关系较远，不在同一分支。

表2 S1基因序列比较分析参考毒株

实施例4 IBV-CK/CH/FJ/202005毒株对1日龄SPF鸡的致病力试验

1）将1日龄SPF鸡随机分成2组，每组15只，试验组用IBV-CK/CH/FJ/202005 P0代毒株进行攻毒，用PBS稀释病毒，攻毒剂量为50 μL/羽（含10^4.0EID₅₀），对照组用阴性尿囊液作相同处理。攻毒方式均为点眼方式，连续观察15 d。攻毒毒株稀释方式采用1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）对毒株进行稀释。

2）分别于攻毒后第5 d、10 d和15 d各剖杀5只鸡，观察气囊炎病变情况，按气囊病变评分标准进行判定，记为0-4分：未发现肉眼可见气囊损伤记为0分；可见淋巴滤泡病变或气囊轻度浑浊记为1分；气囊有些增厚，通常有小的干酪样渗出物聚集记为2分；气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物记为3分；气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物但是气囊损伤在2个或2个以上气囊中发现记为4分。单只鸡气囊评分累积为鸡胸气囊和腹气囊的评分累积，气囊平均损伤评分=各组鸡气囊评分累积之和/鸡只数量。结果表明IBV-CK/CH/FJ/202005 毒株对1日龄SPF鸡有致病力，临床表现为第5 d开始攻毒组2只鸡只均出现气囊炎，攻毒组第10 d，5只鸡只全部发病，气囊的平均损伤评分达到最高分为4.2分，气囊炎症状典型。结果见表3。

表3 1日龄SPF鸡只攻毒后气囊炎发病情况

^a表示气囊平均损伤评分。

3）攻毒后气管中IBV-CK/CH/FJ/202005病毒再分离结果

攻毒后及时采集鸡只气管，放置于-40℃保存，每管加入3 mL 1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）液体，采用研磨法进行气管研磨，经4℃离心过滤后取上清液用于IBV-CK/CH/FJ/202005病毒再分离。将200 μL上清液接种于9日龄SPF鸡胚，每份气管接种5枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d后将24 h以后死亡或非死亡鸡胚4℃保存，收取所有鸡胚尿囊液采用检测引物进行IBV的RT-PCR鉴定，考察各气管中是否能够再次分离到毒株。结果表明，气管中能够再次分离得到鸡传染性支气管炎病毒IBV-CK/CH/FJ/202005株，攻毒后第5 d气管病毒再分离率为100%，该毒株能够在感染早期（感染第5 d）定植于气管中，并导致鸡只出现气囊炎，IBV-CK/CH/FJ/202005病毒株是一株致病力较高的IBV毒株。结果见表4。

4）攻毒后泄殖腔拭子中IBV-CK/CH/FJ/202005再分离结果

攻毒后采集鸡只的泄殖腔拭子在5 mL离心管中，每管加入3 mL 1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）液体，经4℃离心过滤后取上清液用于IBV病毒再分离。将200 μL上清液接种于9日龄SPF鸡胚，每份气管各接种5枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d后将24 h以后死亡或非死亡鸡胚4℃保存，收取所有鸡胚尿囊液采用检测引物进行IBV的RT-PCR鉴定，考察各泄殖腔拭子中是否能够再次分离到毒株。结果表明，15份泄殖腔拭子中仅1份分离得到IBV-CK/CH/FJ/202005株，且临床上肾脏并没有观察到典型的肾脏病变，表明IBV-CK/CH/FJ/202005毒株对1日龄鸡肾脏的致病力弱，肾脏不是该毒株的主要靶器官。结果见表4。

表4 1日龄SPF鸡攻毒后鸡传染性支气管炎病毒再分离结果

实施例5 IBV-CK/CH/FJ/202005株对15日龄SPF鸡的致病力试验

1）将15日龄SPF鸡随机分成2组，每组21只，试验组用IBV-CK/CH/FJ/202005 P0代毒株进行攻毒，用1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）稀释病毒，攻毒剂量为50 μL/羽（含10^4.0EID₅₀），对照组用阴性尿囊液作相同处理。攻毒方式均为点眼方式，连续观察15 d。攻毒毒株稀释方式采用PBS对毒株进行稀释。

2）分别于攻毒后第5 d、10 d和15 d各剖杀7只鸡，观察气囊炎病变情况，按气囊病变评分标准进行判定：未发现肉眼可见气囊损伤记为0分；可见淋巴滤泡病变或气囊轻度浑浊记为1分；气囊有些增厚，通常有小的干酪样渗出物聚集记为2分；气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物记为3分；气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物但是气囊损伤在2个或2个以上气囊中发现记为4分。单只鸡气囊评分累积为鸡胸气囊和腹气囊的评分累积，气囊平均损伤评分=各组鸡气囊评分累积之和/鸡只数量。结果表明该毒株可对15日龄SPF鸡致病，其致病力较强。第5 d开始攻毒组4只鸡均出现气囊炎，攻毒组第10 d气囊炎发病率为6/7，其气囊平均损伤评分达到最高分为3.0分，气囊炎症状典型。结果见表5。

表5 15日龄SPF鸡只攻毒后气囊炎发病情况

^a表示气囊平均损伤评分。

3）攻毒后气管中鸡传染性支气管炎病毒再分离结果

攻毒后及时采集鸡只气管，放置于-40℃保存，每管加入3 mL 1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）液体，采用研磨法进行气管研磨，经4℃离心过滤后取上清液用于IBV-CK/CH/FJ/202005病毒再分离。将200 μL上清液接种于9日龄SPF鸡胚，每份气管接种5枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d后将24 h以后死亡或非死亡鸡胚4℃保存，收取所有鸡胚尿囊液采用检测引物进行IBV的RT-PCR鉴定，考察各气管中是否能够再次分离到毒株。结果表明，攻毒后第5 d（1/7）和第10 d（4/7）气管中能再次分离得到鸡传染性支气管炎病毒IBV-CK/CH/FJ/202005株，这是一株对15日龄SPF鸡具有致病力的毒株。结果见表6。

4）攻毒后泄殖腔拭子中IBV-CK/CH/FJ/202005再分离结果

攻毒后采集鸡只的泄殖腔拭子在5 mL离心管中，每管加入3 mL 1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）液体，经4℃离心过滤后取上清液用于IBV-CK/CH/FJ/202005病毒再分离。将200 μL上清液接种于9日龄SPF鸡胚，每份气管接种5枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d后将24 h以后死亡或非死亡鸡胚4℃保存，收取所有鸡胚尿囊液采用检测引物进行IBV的RT-PCR鉴定，考察各泄殖腔拭子中是否能够再次分离到毒株。结果表明，泄殖腔拭子中均不能分离得到IBV-CK/CH/FJ/202005株，且临床上肾脏并没有观察到典型的肾脏病变，表明该IBV毒株对15日龄鸡只肾脏的致病力很弱。结果见表6。

表6 15日龄SPF鸡攻毒后鸡传染性支气管炎病毒再分离结果

实施例6 鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）的免疫攻毒保护试验

1）选取品种相同、外观健康、初始体重接近的0日龄SPF出雏雏鸡 15羽，试验动物分3组，第1组鸡只采用鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）按说明书操作免疫1羽份，第2组作为阳性对照组不免疫，第3组鸡只作为阴性对照不作任何处理。免疫21 d后第1组和第2组鸡只全部用IBV-CK/CH/FJ/202005 P0代毒株进行攻毒，攻毒剂量为50 μL/羽（含10^5.0EID₅₀），对照组用阴性尿囊液作相同处理。攻毒方式均为点眼方式，攻毒后7 d采集气管进行气管再分离。攻毒毒株稀释方式是采用1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）对毒株进行稀释。

2）攻毒后7 d气管中鸡传染性支气管炎病毒再分离结果

攻毒后7 d采集全部鸡只气管，放置于-40℃保存，每管加入3 mL 1×PBS（Gibco，0.01M，pH 7.2）液体，采用研磨法进行气管研磨，经4℃离心过滤后取上清液用于IBV-CK/CH/FJ/202005病毒再分离。将200 μL上清液接种于9日龄SPF鸡胚，每份气管接种5枚鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察7 d后将24 h以后死亡或非死亡鸡胚4℃保存，收取所有鸡胚尿囊液采用检测引物进行IBV的RT-PCR鉴定，考察各气管中是否能够再次分离到毒株。结果表明，攻毒后7 d免疫攻毒组气管病毒再分离结果为4/5，H120疫苗保护率仅有20%，阳性攻毒组气管病毒再分离结果为5/5，阴性组为0/5。现有IBV H120活疫苗无法对IBV-CK/CH/FJ/202005病毒毒株，即对IBV GⅥ毒株提供有效的免疫保护。结果见表7。

表7. H120株免疫保护试验气管的病毒再分离结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株鸡传染性支气管炎病毒毒株及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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ataaatagta gtggttccca gttattagag gaccagtact atgttagatt aaccaatacc 1620

tcacataggc gtaagcgt 1638

Claims

1.一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其特征在于：所述鸡传染性支气管炎病毒毒株，其分类命名为：IBV-CK/CH/FJ/202005，该毒株于2021年2月4日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：V202116，保藏地址：中国．武汉．武汉大学。

2.根据权利要求1所述的一株鸡传染性支气管炎病毒毒株，其特征在于：所述毒株的S1 基因全长1638bp，其核苷酸序列如SEQ ID. NO1所示。

3.如权利要求1所述的一株鸡传染性支气管炎病毒毒株在疫苗免疫攻毒保护中作为攻毒毒株的应用。