CN109868262B

CN109868262B - 一种犬瘟热弱毒株及其应用

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Publication number: CN109868262B
Application number: CN201910275453.8A
Authority: CN
Inventors: 单虎; 郑秀云; 张洪亮; 盖春云; 秦志华; 张传美; 杨瑞梅
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN109868262A; CN108486068A

Abstract

本发明提供一种犬瘟热弱毒株，其保藏编号为CCTCC NO:V201814；本发明所筛选的QN‑1株用于制备疫苗。本发明的犬瘟热活疫苗QN‑1株具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对犬瘟热强毒GN株攻毒的水貂具有非常好的保护效果，免疫后水貂的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效的预防水貂犬瘟热的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种犬瘟热弱毒株及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品制备技术领域，具体涉及一种犬瘟热弱毒株及其应用。

背景技术

中国毛皮动物养殖业始于1965年，到现在已有50年的发展史。在我国毛皮动物养殖产业发展很快，饲养种类不断增多，数量逐年增大，主要集中山东、辽宁、黑龙江、河北等地，饲养的主要品种有水貂、银狐、貉子等。据不完全统计，目前全国拥有毛皮动物养殖户上万家，各种毛皮动物存栏约4000万只，其中水貂就有2000万只，已经成为一个名副其实的养殖大国。

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科的犬瘟热病毒(Caninedistemper virus，CDV)引起的犬科、鼬科和部分浣熊科动物的急性、热性、高度接触性传染病。其主要特征为双相型发热，炎、鼻、消化道等黏膜炎症，以及卡他性肺炎、皮肤湿疹和神经症状。犬瘟热病毒属于副粘病毒科 (paramyxoviridae family)麻疹病毒属(Morbillivirus)，病毒基因组为不分节段的负链RNA，病毒粒子呈圆形或不规则形，有时也呈长丝状，直径120～300nm。粒子中心含有宽径15～17nm的螺旋形核衣壳。1905年Carre首次发现犬瘟热病毒，故本病也称carre病。先后在银黑狐、貉、紫貂、北极狐等毛皮动物中发生犬瘟热。现已有报道证实在患Pagets疾病的病人组织中检出了犬瘟热病毒核酸。可见犬瘟热的宿主范围在不断地扩大，感染谱在日益增多。近年来，随着我国军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的增多，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率均有升高的趋势，而且临床表现也与以往有所不同。该病是目前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，受到广泛重视。

水貂犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV)引起的一种急性、热性、传染性极强的高度接触性传染病，是水貂养殖业的主要传染病之一。近几年来，随着各地毛皮动物养殖规模的不断扩大，水貂犬瘟热的发病率有逐步上升的趋势。由于水貂犬瘟热无特效的治疗方法，接种疫苗进行预防显得尤为重要。

目前国内市场上流行的水貂犬瘟热疫苗多为灭活疫苗，产生的免疫效果维持时间较短，不产生局部抗体。且灭活苗需要多次注射，需要抗原量比较大，成本较高。而弱毒活疫苗能刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，诱导免疫记忆，具有良好的免疫原性。有研究表明，国内流行犬瘟热野毒株与商业疫苗毒株的抗原蛋白存在较大差异。因此，需要考虑现行使用的犬瘟热弱毒疫苗是否能够预防不断变异、自然宿主不断扩大的犬瘟热病毒感染，研制既有高安全性又有良好免疫原性的弱毒疫苗具有重要的实际意义。研究水貂犬瘟热活疫苗对我国水貂养殖业具有重大的意义。

现行研制的犬瘟热弱毒株多是将分离的犬瘟热强毒株经细胞或鸡胚多次传代适应而致弱得到的，病毒的传代致弱所需时间长，工作量大，传代致弱过程中会存在诸如细菌污染等不确定因素的影响。传代致弱的毒株还可能存在毒力不稳定现象，如果毒株不纯，混有强毒力的病毒粒子，可能会导致免疫失败甚至疫病的流行。因此，如果能够直接分离一株弱毒疫苗株，大大减少了疫苗研制的工作量，且毒株较纯，降低了导致疫病流行的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬瘟热弱毒株(QN-1株)及其应用，所筛选的 QN-1株具有安全性高和良好的免疫原性的特点，其制备的疫苗能够解决灭活疫苗免疫效果维持时间短，成本较高等问题。

本发明所提供的犬瘟热病毒Caninedistempervirus CDV QN-1株,于2018年4 月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号： CCTCC NO:V201814；

所述的QN-1株，其病毒毒种含量≥10^5.0TCID₅₀/ml；

本发明所筛选的QN-1株用于制备疫苗。

本发明再一方面提供一种疫苗，是用QN-1株作为抗原来制备的。

所述的疫苗，为冻干疫苗。

本发明的犬瘟热活疫苗(QN-1株)具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对犬瘟热强毒GN株攻毒的水貂具有非常好的保护效果，免疫后水貂的发病率和死亡率均明显减少，其免疫效果达到或优于市场上现有的商品化疫苗，能够有效的预防水貂犬瘟热的流行和传播，降低本病造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

附图说明

图1：CDV QN-1株与CDV3株H基因序列比对结果图；

图2：CDV QN-1株与标准株H基因序列核苷酸比对结果图；

图3：CDV QN-1株H基因序列比对结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：水貂犬瘟热病毒QN-1弱毒株的分离鉴定与克隆纯化及免疫试验本实施例所用的材料如下：

标准毒株：CDV Onderstepoort株，由青岛农业大学实验室保存。

攻毒用强毒株：CDV GN株(脏器毒，ID50≤10^-2/ml)，由青岛农业大学培育、鉴定并保管。

免疫血清：兔抗CDV QN-1株(本次克隆纯化的病毒株)阳性血清由本单位自制；兔抗CDV Onderstepoort株阳性血清由本单位自制。

Vero细胞，由南京农业大学提供。培养液为含有5％小牛血清的MEM。

水貂由青岛农业大学动物科技学院实验动物站提供。

一、病毒株的筛选

山东省诸城市某养殖场水貂，约60日龄左右。未免疫水貂犬瘟热疫苗产品，水貂群出现疑似犬瘟热症状，眼、鼻有明显分泌物，食欲减退、鼻镜干燥，但未出现水貂死亡病例，怀疑受到水貂犬瘟热病毒弱毒株的感染。

对从该养殖场获得的样品进行病毒筛选。

筛选用到的试剂如下：

蚀斑纯化用试剂：琼脂糖，TaKaRa公司生产；中性红，日本武田公司生产。

细胞培养基：不含酚红的MEM培养基，宜兴赛尔生物技术公司生产。其中细胞生长液为含10％犊牛血清的MEM细胞培养液，细胞维持液为无血清的 MEM细胞培养液。

细菌培养基：硫乙醇酸盐(T.G)小管、酪胨琼脂(G.A)斜面，葡萄糖蛋白胨培养基(G.P)按中华人民共和国兽用生物制品质量标准方法配制。

支原体培养基：按中华人民共和国兽用生物制品质量标准方法配制成液体培养基和固体培养基。

1、水貂犬瘟热病毒QN-1弱毒株的分离鉴定与克隆纯化及免疫试验。

1)病毒的分离安乐死水貂，取貂的脑、肺脏、肝脏、脾脏等组织样品，用含双抗(2000IU/ml青霉素和2000μg/ml链霉素)的PBS冲洗3次，充分剪碎后按1：3的比例加入含双抗的PBS，研磨成乳剂，5000rpm，4℃离心 10min取上清，0.2μm孔过滤除菌，-20℃下保存供分离病毒用。取Vero细胞按正常传代长成80％单层后，弃去培养液，按培养液体积分数的10％加入待病毒分离的样品。37℃吸附1h后，加入含5％小牛血清的MEM培养液，置于37℃5％ CO₂的条件下培养，逐日观察细胞是否出现融合、拉网、脱落等病变。结果，病料的10倍稀释样品在Vero细胞上生长第4天开始可见明显多核巨细胞，在Vero 细胞上生长可见细胞融合与空泡变性，并形成合胞体，第七天，病变细胞脱落，呈拉网状。在Vero细胞上传3代，每代可见相同的CPE。

2)不同培养天数CPE观察与毒力测定用Vero细胞对第3代培养物进行不同收毒时间比较试验：Vero细胞单层接CDV，接毒量为1ml，营养液10ml。分别在第3、4、5天于倒置显微镜下观察细胞病变情况，并照相。第4、5、6、7 天收毒，测定不同收毒时间的TCID₅₀。结果，接毒后第一、二、三天无明显 CPE，第四天少量细胞出现聚集，培养液清亮，第五、六天大量细胞聚集成团，培养液有少量浑浊，表明病毒开始脱落。第七天细胞几乎全部脱落。不同收毒时期收毒，TCID50呈递增趋势，以第七天最高，病毒不同收毒时间与TCID₅₀值的关系见下表1。

表1不同时期培养的TCID₅₀值

3)包涵体检查取分离病毒株的Vero细胞第3代培养物制成飞片，晾干，甲醇固定5min，滴加苏木精染液染色15-20min，蒸馏水冲洗，0.1％盐酸酒精液分色，氨水蓝化，伊红复染1-5min，95％酒精分化5min，油镜下观察结果。结果，细胞核呈浅紫色，细胞质呈淡玫瑰色，胞浆内可见到红色、圆形或卵圆形的包涵体。

4)电镜观察取分离病毒株的Vero细胞第3代培养物经三次冻融，3000rpm 离心15-20min，取上清液加到30％蔗糖铺底的超速离心管中，4℃下35000rpm 离心2.5小时，取沉淀物，用0.1ml PBS悬浮，2％PTA负染，电镜观察。结果，可见到圆形的病毒粒子，有囊膜，囊膜表面上有纤突，病毒核衣壳卷曲在囊膜内，病毒表面有类结晶样排列，呈典型的CDV病毒粒子形态。

5)病毒理化学特性试验取分离病毒株的Vero细胞第3代培养物，分别进行病毒核酸型鉴定试验、乙醚敏感性和耐酸性试验。

病毒核酸型鉴定试验：Vero细胞长成单层的96孔细胞培养板内，换细胞生长维持液100μl/孔，分为两列，每列6孔/排，分别按列接种不同稀释度的病毒 (10^-2～10^-7)25μl/孔，每个稀释度前6孔加5-氟脱氧尿核苷(FUDR)，使其终浓度为50μg/ml，此后逐日观察CPE。结果，加FUDR的病毒10^-4时产生CPE，对照病毒产生CPE的稀释度为10^-5三孔，10^-4二孔，则抑制滴度小于1个对数，说明该分离毒株为RNA病毒。

乙醚敏感性试验：病毒液0.8ml分别加入两个西林小瓶，向其中一瓶加乙醚0.2ml，两瓶均用橡皮塞塞紧后置4℃24小时，其间不振荡。已加乙醚的小瓶分为两层：上层为乙醚，下层为病毒液。用移液管吸取病毒液入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发，用乙醚处理的病毒液和对照病毒液同时测TCID₅₀。结果，乙醚处理的病毒液TCID₅₀为10^-1.33，对照病毒液TCID₅₀为10^-5.0。说明此病毒对乙醚敏感。

耐酸性试验：病毒液等量分装于三个西林小瓶中，用0.1mol/L HCl将两瓶中的病毒液的pH分别调为3.0和5.0，另一瓶加相当量的灭菌生理盐水作对照。室温感作1小时后，用7.5％NaHCO₃溶液调pH至7.2，分别测TCID₅₀。结果， pH为3.0的病毒液TCID₅₀为10^-2.0，pH5.0时TCID₅₀为10^-4.5，对照组TCID₅₀为10^-5.33。说明此病毒在pH 5.0时较稳定，在pH 3.0时不稳定。

6)分子生物学检测

参考CDV Onderstepoort(AF305419)株基因序列，利用Oligo7.37软件在CDV H基因两端的相对保守区设计一对扩增H基因编码区的特异性引物，

P1(CDV-H-F(7075-7095))：5’-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3’，

P2(CDV-H-R(8975-8995))：5’–AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’，扩增长度为1921bp。

取分离毒第3代Vero细胞培养物，测其TCID₅₀为10^-6.0/ml。按200μl细胞培养物加入500μl TRIzol试剂，15～30℃静置5min。按0.2ml/1ml TRIzol加氯仿，用手用力摇动试管15秒，15～30℃静置2～3min。2～8℃12,000转离心样品15min。离心之后，混合物就分离成下层红色，苯酚-氯仿中间层，上层无色层。转移上面无色层到另一新离心管，按0.5ml/1mlTRIzol加异丙醇，通过与异丙醇混合后从水相中沉淀RNA，-20℃静置30min。2～8℃12,000转离心样品10min，在管壁或管底形成RNA沉淀。弃上清液，按1ml/ml TRIzol加75％的乙醇洗涤RNA一次，2～8℃7500转离心样品5min。弃上清液，干燥RNA(勿完全干燥)。用 DEPC处理过的水10～20μl溶解，-70℃保存。同时设CDV标准毒株作对照。

在20μl反转录体系中：MgCl₂(25mM)4μl，10×RNA PCR Buffer 2μl，RNase FreedH₂O(DEPC-H₂O)7.5μl，dNTP mixture(2.5mM)2μl，RNA Inhibitor(40U/ul) 0.5μl，AMVReverse Transcriptase XL(5U/μl)1μl，下游引物或OligodT 0.5μl，RNA样品2.5μl。充分混合后入PCR仪内，42℃1h，99℃5min，5℃5min，4℃ 5min。

PCR反应总体积20μl：MgCl₂ 1.5μl，10×Buffer 2μl，dNTP mixture(2.5mM)1.8ul，DEPC-H₂O 10.2μl，Taq酶(5U/μl，TaKaRa公司产品)0.5μl，RT产物3μl， P1P2混合物共1μl。对PCR循环参数和PCR反应体系中各要素用量进行了选择，最后确定PCR的最合适的程序为：96℃预变性5min，然后开始扩增，94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min20s，共40个循环，最后72℃10min， 4℃5min，-20℃保存备用。

PCR产物鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物。配制含琼脂糖1.5％的1×TAE液，加入EB工作液至终浓度为5μg/ml。RT-PCR扩增产物与溴酚蓝加样缓冲液4：1混匀后，以2000bp Marker作对照，点样。稳压电压为80V，约20min后，于紫外透射仪下观察结果，凝胶自动成像仪上照相。并将PCR产物克隆至pMDT-18载体上测序，将测序结果与GenBank收录的CDV H基因序列比对分析。结果，得到与预期扩增片段(1921bp)相符的核酸电泳带，并对序列进行测定，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。通过对其H蛋白的基因序列分析发现，在主要抗原位点上，CDV QN-1病毒株的氨基酸序列与国内外报道的分离株有较大差异，与CDV3相比有14处发生了变异，P10-A10，P18-A18，Q29-E29，Q215-E215，A269-T269，S295-L295， A436-G436，Q441-E441，A457-G457，Y525-S525，D526-V526，H540-D540， P550-S550，P583-A583，显示了病毒的变化。其中Y525-S525和D526-V526这两个突变位点发生在宿主细胞结合的受体关键区域，会影响CDV与宿主细胞的结合，这很可能是导致CDV QN-1毒力降低的原因。其他相关特异性变异与毒株致病性研究较少，不排除其相关性。

7)CDV分离株原始毒的增殖复壮及其滴度测定用不含血清的MEM培养基将毒种适当稀释，接种于培养24h长满密集单层的Vero细胞上，每瓶接种1ml， 37℃吸附1h后，弃去病毒液，以不含血清的MEM培养基洗涤一次，然后加入含5％新生犊牛血清的MEM培养基，37℃、5％CO₂条件下继续培养；同时设正常Vero细胞做空白对照。24h后开始观察，当细胞病变(CPE)达80％时，冻融三次收获病毒液。取收获后的病毒液做10倍梯度稀释后，取适宜的5个稀释度以96孔细胞培养板测定其TCID₅₀。结果，分离株原始毒在Vero细胞复壮1～ 2代后趋于稳定，接毒后48～56h出现CPE，120～168h CPE可达80％，CPE表现为细胞圆缩、脱落。经多次测定毒价，TCID₅₀在10^4.5～10^5.9/ml之间。

二、病毒的克隆纯化

1、病毒感染的贴壁细胞的制备用胰酶消化刚长满单层的Vero细胞，加入细胞培养液，制成细胞悬液，加入到24孔细胞培养板中；取将克隆病毒的细胞培养物稀释为10^-1、10^-2、10^-3三个稀释度，接种于长满单层Vero细胞的平皿中，每个平皿接种0.1ml，每个稀释度接种3个平皿，37℃吸附1h，其间每15min 轻晃平皿一次，弃去上清液，加入维持液，37℃、5％CO₂条件下继续培养。做 10倍系列稀释后，按稀释倍数分别加入24孔板中，每个稀释度做2孔，均按 10％的量同步接种，设未接种病毒的正常细胞对照孔1个，置37℃、5％CO₂条件下培养。待细胞贴壁良好(培养约10h)后，弃去培养液，用不含血清酚红的 MEM液轻洗2次，轻洗后，加入融化的温度为45℃、血清含量为2％的无酚红的MEM营养琼脂(每孔0.8mL)，第5天时，加入1/5体积的胰酶含量为1/8000 的含中性红的MEM营养琼脂染色。

2、挑斑及克隆株的扩大培养蚀斑形成后，挑选不同大小的蚀斑。用记号笔在培养板上对欲挑选的直径大小不同的蚀斑部位做好标记(用于挑斑的蚀斑只能用中性红染色)，然后用吸管吸取蚀斑；将吸取的蚀斑琼脂糖凝胶放入灭菌的培养皿中，用灭菌刀片切除并弃掉不含病毒侧的琼脂糖凝胶，使含病毒的凝胶层很薄，取出并放入青瓶中，加入0.5mL营养液，冻融3次，于24孔培养板中同步接种Vero细胞，待出现病变后，收毒，再用培养瓶扩大培养，利用可形成蚀斑的条件，对已获得的蚀斑克隆株克隆3次。结果，克隆3次后，获得了肉眼可见的蚀斑。蚀斑形态较规则，略呈圆形。根据斑径大小大致可分为大、中、小斑三蚀斑直径为2.00～2.75mm，1.00～1.33mm及0.40～0.75mm的克隆株。分别命名为CDV QN-1株、CDVQN-2株、CDV QN-3株。

3、克隆毒株的电镜观察将克隆毒株接种于Vero细胞单层，在CPE达 80％时，倾出培养液，加入少量PBS缓冲液，反复冻融3次后，3000rpm离心 30min，取上清液进行磷钨酸负染扫描电镜观察。结果，均见到的球形病毒粒子。

4、克隆毒株滴度测定用96孔板按照2.1.7方法进行。结果见表2.

表2 CDV毒株克隆株滴度检测结果

滴度检测结果显示CDV QN-1株滴度明显高于其他两株，为后续弱毒疫苗的研究奠定了良好的基础。

5、克隆毒株纯净检验按现行《中国兽药典》附录的方法进行细菌检验、霉菌检验、支原体检验和外源性病毒检验。结果，无细菌、真菌、支原体及外源性病毒污染。

6、克隆毒株增殖力稳定性试验选取滴度最高的克隆株进行本试验。将克隆毒株在Vero细胞上连续传20代，每隔5代进行一次病毒滴度测定。结果见表3，表明CDV QN-1株的增殖力良好。各代次病毒置-70℃保存备用。

表3 CDV QN-1株增殖力试验结果

三、免疫原性试验

1、分离株的微量血清交叉中和试验(SN)取12月龄貂4只，用 CDV-Onderstepoort株细胞培养物制备的弱毒疫苗免疫，每间隔15d加强免疫一次，反复免疫3次，于后肢胫外侧皮下静脉采血，微量血清中和试验检测血清中和抗体效价，达1:100以上时采血分离血清，-20℃冷冻保存备用。取分离病毒株的Vero细胞第3代培养物，以固定病毒-稀释血清法进行：用96孔细胞培养板，按1:4系列稀释阳性血清，25μl/孔，同时加25μl/孔约200个TCID₅₀的分离病毒，37℃感作1小时，按50μl/孔加入Vero细胞(约12000个)，于5％CO₂、 37℃下培养，4～7天观察CPE，同时设正常Vero细胞和阴性血清对照孔。结果，正常Vero细胞生长正常，未加血清只加病毒液的对照孔产生明显的CPE，未加病毒液只加血清的对照孔未见产生CPE，而病毒液与血清中和孔未产生明显的 CPE。此时可初步判定该分离病毒为CDV，分离的CDV毒株与CDV-Onderstepoort株产生抗体中和反应，表明两种病毒株有交叉抗原性。

2、克隆毒株的免疫原性试验将克隆株病毒培养物稀释至 10^3.5TCID₅₀/ml，皮下注射45～60日龄健康水貂(中和抗体效价≤1:4)5只，1mL/ 只皮下注射，同时设立对照组(注射生理盐水1ml)，免疫后21日，用100个ID₅₀的CDV强毒(GN株)攻击，观察21日，观察免疫保护情况。结果，免疫后 21d分别用强毒攻击，CDV QN-1株免疫组获得100％保护，RT-PCR检测粪便未出现阳性条带；对照组全部发病，RT-PCR检测粪便出现阳性条带。表明，CDV QN-1弱毒株具有较好的免疫原性。其结果见表4。

表4 CDV QN-1株免疫原性试验结果

3、克隆株的安全性试验选用45～60日龄健康水貂(中和抗体效价≤1:4)8 只，其中5只皮下注射CDV QN-1弱毒株在Vero细胞上的培养液5ml，另三只皮下注射5ml注射用水作为对照。每天观察接种貂体温、粪便、食欲精神状态、脚垫性状及死亡情况。连续观察21日。结果，全部接种水貂健活，局部无红肿，精神无异常，饮食、粪便均正常。表明犬瘟热弱毒株QN-1株对水貂是安全的，不会引起水貂发病。其结果见表5。

表5 CDV QN-1株安全性试验结果

实施例2：水貂犬瘟热CDV QN-1株毒种的毒力返强试验

所使用的毒种：CDV QN-1株，第5代基础毒种(最低代次)；

Vero细胞由南京农业大学提供，其培养液为含有5％小牛血清的MEM。

试验动物：5月龄健康易感水貂(CDV中和抗体≤1:4)，购自威海某水貂养殖场。

1、水貂犬瘟热CDV QN-1株毒种的毒力返强试验

1)CDV QN-1株病毒含量测定

将冻干毒种CDV QN-1株用灭菌生理盐水恢复原量，适当稀释，每个稀释度接种Vero细胞各1瓶，每瓶接种1ml，37℃吸附1小时后，弃去病毒液，以不含血清的MEM培养基洗涤一次，然后加入含5％新生犊牛血清的MEM培养基，33℃条件下继续培养；同时设正常Vero细胞做空白对照。24小时后开始观察，当细胞病变(CPE)达80％时，冻融3次收获病毒液。取收获后的病毒液做10倍梯度稀释后，取适宜的5个稀释度以96孔细胞培养板测定其TCID₅₀。连续传代至30代。结果，CDV QN-1株5～30代次的病毒TCID₅₀均能达到 10^5.8/ml。结果表明，CDV QN-1株的病毒增殖力稳定，适合作为疫苗毒种使用。具体结果见表6。

表6 CDV QN-1株传代的病毒含量测定试验结果

2)CDV QN-1株接种水貂后的体内复制及排毒情况

将CDV QN-1株在Vero细胞上培养的第5代基础毒种(TCID₅₀为10^5.8/ml) 皮下注射水貂14只，1ml/只，同时设未接种水貂2只。接种后每隔3d(3d、6d、 9d、12d、15d、18d、21d)采集水貂的眼鼻分泌物、尿液、粪便，并每次安乐死两只水貂，无菌采集肺、脾、肝、淋巴结，研磨处理，提取核酸进行CDV RT-PCR 检测，检测方法参照《水貂犬瘟热活疫苗(QN-1株)制造及检验试行规程(草案)》附注2进行，同时采集的样品研磨处理过滤除菌后接种Vero细胞进行病毒分离。结果表明，接种后9～15d，水貂的粪便和尿液中可检测到CDV核酸，说明这期间CDV QN-1株接种水貂后向外界排毒，15d以后排毒减少，18d排毒停止，检测不到病毒核酸。脏器检测结果表明，接种后6～9d在肺脏、脾脏、肝脏、淋巴结中可检测到病毒核酸或分离到病毒，而且肺脏、脾脏和淋巴结中的阳性率高，说明CDV QN-1株接种水貂后主要在这三种脏器中复制，18d后在上述脏器中均检测和分离不到病毒。见表7。

表7 接种水貂的病毒复制及排毒检测结果

3)CDV QN-1株对水貂的继代接种试验

将CDV QN-1株在Vero细胞上培养的第5代基础毒种(TCID₅₀为10^5.8/ml) 皮下多点注射水貂3只，10ml/只，隔离饲养10d，每天观察水貂的精神状态、食欲、体温、粪便等变化情况，观察10d后安乐死试验水貂，无菌采集淋巴结、脑、肺脏、脾脏、肝脏组织样品，加PBS研磨成1:5的组织悬液，反复冻融3 次，6000rpm离心30min，取上清液进行电镜负染观察，同时取上清液接种Vero 细胞，观察细胞病变情况。

将观察到CDV病毒粒子和产生细胞病变的接种水貂组织上清液再次接种水貂3只，10ml/只，隔离饲养10d，每天观察水貂的精神状态、食欲、体温变化等情况，观察10d后安乐死试验水貂，无菌采集淋巴结、脑、肺脏、脾脏、肝脏组织样品，按前述方法进行样品处理和水貂连续继代接种，如此反复，在水貂体内连续5次继代。在最后一次接种试验水貂后，连续观察21d。每代观察水貂的精神状态、食欲、体温、粪便等变化情况。如接种水貂犬瘟热发病标准，可判定试验水貂感染犬瘟热，即CDV QN-1株毒力返强。每个代次的继代接种试验均不接种病毒的空白对照水貂2只。

CDV的基因组依次编码6个蛋白基因，其中H基因编码血凝素蛋白，起到与CDV受体SLAM识别和结合的关键作用。由于H基因变异频繁，所以它被认为是导致CDV不断变异的重要因素。本研究取1～5代接种水貂的脏器研磨上清液，提取病毒RNA，RT-PCR扩增CDV QN-1株血凝素蛋白基因，并进行测序分析，判断H基因毒力相关氨基酸序列有无变异，评价CDVQN-1株在水貂体内传代的遗传稳定性。

结果CDV QN-1株基础种子第5代毒种(TCID₅₀为10^5.8/ml)在貂体内连续传5代，每代水貂脏器研磨上清液中(淋巴结、脑、肺脏、脾脏、肝脏)中通过电镜均可观察到犬瘟热病毒粒子，脏器研磨上清液接种Vero细胞，48小时候出现融合性细胞病变，说明CDV QN-1株在水貂体内复制。1～5代水貂接种10d 内精神状态、食欲均正常，接种水貂体温均正常(表8)。观察期内接种水貂未出现疑似犬瘟热症状(表9)。

表8接种水貂的临床症状变化

表9 CDV QN-1株第5代基础毒种接种水貂1～5代体温数据

CDV QN-1株在水貂体内连续传5代后，其影响毒力和免疫原性的7个N- 连接糖基化位点(19～21，19～151，391～393，422～424，456～458，587～589和 603～605)和11个半胱酰胺残基均未出现变异。说明CDV QN-1株在水貂体内连续传代过程中无毒力返强的基因突变产生，基因遗传稳定性高。

4)CDV QN-1株对水貂的同居感染试验

将CDV QN-1株第5代基础毒种接种水貂5只，10ml/只，同时将未接种任何疫苗的健康水貂3只进行同笼饲养21日，每天观察同居水貂的体温、粪便、精神状态脚垫性状及死亡情况，同时试验组和对照组水貂分别采血，测定血清中和抗体。结果，同居水貂的精神状态、食欲、体温、粪便均正常，未出现疑似犬瘟热的临床症状(见表10、表11)，同居水貂未出现血清中和抗体阳性(见表12)。表明，CDV QN-1株对靶动物安全，接种疫苗的水貂对共同饲养的健康易感水貂无不良反应，不会造成犬瘟热的临床感染。

表10水貂同居感染试验的临床症状变化

表11 CDV QN-1株接种水貂同居与同居水貂21d体温数据

表12水貂同居感染21d血清中和抗体变化

实施例3：水貂犬瘟热活疫苗(QN-1株)制备与检验

Vero细胞：用于水貂犬瘟热病毒的培养及检测。

水貂犬瘟热病毒弱毒CDV QN-1弱毒株，

主要试剂：新生牛血清，由指定厂家提供，产品达到厂家质量标准。MEM 由Gibco公司提供，达到规定要求；胰蛋白酶由指定厂家提供；氯化钠、磷酸氢二钠等均为分析纯，由指定厂家提供。

试验动物45～60日龄的健康易感水貂(水貂犬瘟热血清中和抗体≤1:4)，由青岛农业大学动物科技学院实验站提供。

1)细胞生长液和细胞维持液配制

将MEM粉用注射用水配成10倍母液，0.22um滤膜无菌过滤至无菌容器内保持备用(不超过15天)；用灭菌注射用水将MEM母液10倍稀释即为MEM 工作液；MEM工作液950ml，加入新生牛血清50ml，加入青链霉素100U/ml，用碳酸氢钠调整pH为7.0～7.2，即为5％细胞生长液，将新生牛血清更换为20ml，即为2％的细胞维持液。

2)阳性血清及抗体犬瘟热和水貂细小病毒阳性血清由本实验室自制，抗犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、狂犬病病毒、牛病毒性腹泻病毒的荧光抗体、抗胸腺细胞血清购自中国兽医药品监察所。

3)水貂犬瘟热活疫苗(QN-1株)生产用毒种的制备取保存的CDV QN-1 株毒种，1:3稀释后按细胞培养液的3％接毒量同步接种于Vero细胞，置33℃培养7～8日，当细胞病变达80％时，收获病毒液冻融两次后，按前述方法再传 2代，定量分装，注明收获日期、传代代次，-20℃保存作为生产毒种使用。

4)生产毒种检验取各批次生产毒种各2支，按现行《中国兽药典》的方法进行病毒含量和纯净性检验。毒种检验结果符合标准，可作为生产毒种使用。

5)病毒含量测定将生产用毒种做10倍系列稀释，选取10^-3、10^-4、10^-5、 10^-6、10^-7 5个稀释度，接种长成Vero细胞单层的96孔板上，每个稀释度接种6 孔，每孔100μl，吸附1小时，加维持液(含2％新生牛血清的MEM)100μl，在33℃含5％二氧化碳的培养箱中培养7～8日，逐日观察并记录出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果，毒种病毒含量均不低于10^5.0 TCID₅₀/ml。

6)无菌检验取生产用毒种按现行按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

7)支原体检验取生产用毒种按现行按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无支原体生长。

8)外源病毒检查取生产用毒种按现行按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无外源病毒污染。

9)特异性检验用细胞维持液将CDV QN-1株毒种稀释成 200TCID₅₀/0.1ml，与犬瘟热特异性阳性血清等量混合，37℃水浴中和1小时，接种长满Vero细胞单层的24孔细胞培养板4个培养孔，每孔0.1ml，补充维持液0.9ml，同时设病毒对照、正常细胞对照、阴性血清对照各4孔，33℃培养7 日。结果，病毒对照孔和阴性血清对照孔应全部出现CPE，阳性血清中和孔和正常细胞对照孔应不出现CPE。

1、制苗用毒液的制备

接种用细胞生长液(含5％新生牛血清的MEM)制备Vero细胞悬液(浓度5×10⁶个/ml)，加入3％生产用CDV种毒液，置33℃静置或转瓶培养。

2.3.2观察与收获接毒培养后，每日观察1～2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达80％以上时收获病毒，并留样，保存于-20℃。共制备了三批病毒液。

制苗用毒液的检验

无菌检验将收获的病毒液以组为单位分别取样并混合，按现行《中国兽药典》附录的方法进行。结果，无污染。

病毒含量测定将收获的病毒液以组为单位分别取样并混合，并作10倍系列稀释，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果，三批犬瘟热制苗毒液病毒含量测定结果分别为10^5.0TCID₅₀/ml、10^5.0TCID₅₀/ml和10^5.25TCID₅₀/ml。

疫苗配比与分装将检验合格的病毒液以10000-11000ml混合组成1批，根据病毒含量按表13中6头份/瓶的稀释标准稀释后，调整pH至7.4，按3份病毒加2份稳定剂，同时加入适宜的抗生素，充分混均后定量分装于西林瓶中，每瓶2ml，配苗数据见表14。

表1 3不同病毒含量半成品稀释倍数换算表

表14制备3批疫苗配苗数据表

＊原苗指稀释抗原液加入保护剂和抗生素，调节PH值之后的待分装抗原液

※分装过程会出现部分损耗，分装时设备也会有部分原苗损失，所以实际分装量与理论产量不相符合。

疫苗冻干与贴标

分装后按现行《中国兽药典》附录的方法及生产工艺优化的冻干曲线迅速进行冷冻真空干燥。制备了三批冻干苗，批号为201201、201202、201203，贴上生产标签。

2、水貂犬瘟热活疫苗(QN-1株)成品检验

物理性状检验每批疫苗取5瓶，观察记录。

无菌检验每批疫苗取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

支原体检验每批疫苗取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

外源病毒检验每批疫苗取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

鉴别检验每批疫苗取5瓶，将疫苗稀释成200个TCID₅₀/0.1ml，加CDV 等量特异性血清，37℃水浴中和1小时，接种Vero细胞，观察6日，记录结果。

安全检验选用45～60日龄健康水貂(CDV中和抗体效价≤1:4)5只，皮下注射10个使用剂量的疫苗，每天观察接种貂的精神、食欲和体温变化，连续观察21日。结果，免疫接种水貂全部健活，RT-PCR检测CDV皆为阴性(表15)。

3、效力检验

病毒含量测定取疫苗样品1瓶，按规定头份加入灭菌生理盐水作10倍系列稀释。取10³～10⁷稀释度5个，接种长成Vero细胞单层的96孔板上，每个稀释度接种6孔，每孔100μl，吸附1小时后加维持液100μl，在33℃培养观察 7～8日，计算TCID₅₀。结果，测得3批疫苗(201201/201202/201203)的病毒含量分别为10^4.6TCID₅₀/ml、10^4.7TCID₅₀/ml和10^4.34TCID₅₀/ml。

动物攻毒保护试验每批疫苗随机取1瓶。按规定头份加入注射用水，皮下注射45～60日龄健康易感貂(CDV中和抗体≤1:4)5只，每只1ml(1头份)， 21日后按相同途径相同剂量进行1次免疫。另取条件相同水貂3只作对照。免疫后21日用100ID₅₀的强毒CDV GN株皮下注射攻击各免疫貂和对照貂。观察 21日。结果，接种疫苗的免疫貂攻毒后保护率为100％，免疫水貂全部存活，对照组水貂攻毒后全部死亡(表17)。

剩余水分测定每批疫苗取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

真空度测定每批疫苗取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果，生产三批疫苗，批号为201201、201202、201203。经检验，疫苗在物理性状、纯粹性、特异性、安全性(结果见表15)、效力(结果见表16)均合格；水貂犬瘟热病毒效价分别为10^4.6TCID₅₀/ml、10^4.7TCID₅₀/ml和 10^4.34TCID₅₀/ml。

表15水貂犬瘟热活疫苗(QN-1株)成品检验结果

表16疫苗安全性检验结果

注：“-”表示无该症状:a:发热≥40℃，持续1～3日；b:精神沉郁、食欲减退或废绝、两眼出现眼眵、结膜炎、鼻流清涕或脓性鼻液；c:排血样稀便或伴有蛋清样粪便；d:脚垫增厚，出现角质化；e:RT-PCR检测结果

表17攻毒保护试验结果

注：a:发热≥40℃；b：精神沉郁、食欲减退或废绝、两眼出现眼眵、结膜炎、鼻流清涕或脓性鼻液；c：排便异常(血样或蛋清样)；d：脚垫角质化；e:精神状态差；“-”：无该症状；“√”：出现该症状。

实施例4：最小免疫剂量试验

1材料

1.1试验动物40～50日龄的健康易感水貂(水貂犬瘟热血清中和抗体≤1:4)，由青岛农业大学动物科技学院实验站提供。

1.2病毒攻毒用强毒株CDV GN株(脏器毒，ID₅₀≤10-²/ml)，由青岛农业大学培育、鉴定并保管。

2最小免疫剂量试验

2.1免疫分组将批号为201201的水貂犬瘟热活疫苗(QN-1)用灭菌注射用水稀释为10^3.0TCID₅₀/ml、10^3.5TCID₅₀/ml、10^4.0TCID₅₀/ml、10^4.5TCID₅₀/ml共4 个梯度，分别接种45～60日龄的水貂10只1ml。另设对照组4只(45～60日龄)，注射生理盐水1ml。

2.2攻毒保护试验21d后再按相同剂量相同途径进行1次免疫，免疫后第21 天进行攻毒，水貂犬瘟热组用100个ID₅₀的强毒(GN株)攻击，隔离饲养观察 21天，观察粪便排毒及临床表现，计算保护率。结果，45～60日龄的健康貂分别接种水貂犬瘟热活疫苗不同剂量，在攻毒前都未出现不良反应，接种后的第 21天分别用100个ID₅₀的强毒(GN株)攻击。水貂犬瘟热组以10^3.5TCID₅₀/头份接种水貂犬瘟热活疫苗时，耐受了水貂犬瘟热毒强毒的攻击，而10^3.0TCID₅₀/ 头份接种水貂犬瘟热活疫苗的实验动物攻毒以后，出现了不同程度程度发病，对照组全部发病(表18)。通过试验结果可知：水貂犬瘟热活疫苗免疫貂的最小免疫剂量为10^3.5TCID₅₀/头份。

表18水貂犬瘟热活疫苗最小免疫剂量测定结果(水貂犬瘟热病毒CDV GN攻毒组)

犬瘟热临床发病判定标准(1)发热(体温达40℃以上)，持续1～3日；(2)精神沉郁、食欲减退或废绝、两眼出现眼眵、结膜炎、鼻流清涕或脓性鼻液；(3)排血样稀便或伴有蛋清样粘液的粪便；(4)脚垫增厚，出现角质化；(5)RT-PCR检测粪便或死亡动物脾脏或肺脏呈阳性。具备(5)项和(1)、(2)、 (3)、(4)中的任一项，判为感染发病。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种犬瘟热弱毒株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1824

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgctctcct accaagacaa ggtgggtccc ttctacaagg acaatgcaag acccaattca 60

tccaagctgt ccccagtgac agaacagcat gggggcagga gaccacctta tttgttgttt 120

gtccttctca tcctattggt tggaatcctg gccctgcttg ctatcactgg agttcgattt 180

caccaagtat caactagcaa tatggaattt agcagattgc tgaaagagga tatggagaaa 240

tcagaggccg tacatcatca agtcatagat gtcttgacac cgctcttcaa gattattggg 300

gatgagattg ggttacggtt gccacaaaag ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa 360

aagacaaatt tcttcaatcc gaacagagaa ttcgatttcc gcgatctcca ctggtgcatt 420

aacccgccta gtaaggtcaa ggtgaatttt acaaattact gtgagacaat tgggatcaga 480

aaatctattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag ccctctctgg gggcaggagt 540

gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcaa agttttcccc 600

ctatcagtct cgttatccat gtctttgatc tcaagaacct cacagataat caatatgctg 660

accgctacct cagacggcgt gtatggcaaa acttacttgc tagtgcctga tgatatagaa 720

cgggagttcg acactcaaga gattcgagtc tttgaaatag gcttcattaa aaggtggctg 780

aatgacatgc cattactcca agcaaccaac tatatggtcc tcccggagaa ttccaaagcc 840

aaggtatgta ccatagcagt gggtgagttg acactggctt cctcgtgtgt agaagagagc 900

actgtattat tataccatga cagcaggggt tcacaagatg gtattctagt agtgacactg 960

gggatatttg gggcaacacc tatggatcat attgaggaag tgatacctgt cgctcaccca 1020

tcaatggaga aaatacatat aacaaaccac cgtggtttta taaaagattc aattgcaacc 1080

tggatggtgc ctgccctggc ctctgagaaa caagaagaac aaaaaggttg gctggagtca 1140

gcttgtcaaa gaaaaaccta ccccatgtgc aaccaaacgt catgggaacc cttcggagga 1200

ggacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atgcaagtgt tgaccttcaa 1260

cttaacatat cgttcacata cggtccggtt atactgaatg gagatgctat ggattattat 1320

caaagcccac ttttgaactc cggatggctt accattcctc ctaaaaacgc aacaatcctt 1380

ggattgataa acaaagcaag tagaggagac cagttcactg tgatacccca agtattaaca 1440

tttgcgccca gggaatcatg tggaaattgt tatttaccta ttcaaacatc tcaaattata 1500

gatagagatg tcctcatcga gtccaatgta gtggtgttgc ctacacagag ttttagatat 1560

gtcatagcaa cgtctgtcat atcacgaaat gatcatgcga ttgtttatta tgtttatcac 1620

ccaatccgga ccatttctta tacgcaccca tttagactaa ctaccaaggg tagacctgat 1680

ttcctaagga ttgaatgttt tgtgtgggat gataatttgt ggtgtcacca attttacaga 1740

tacgagccta acatcgccaa ctctacaacc agtgttgaga atttagtccg tataagattc 1800

tcatgtaacc gttcaaatcc ctga 1824

<210> 2

<211> 607

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Val Gly Pro Phe Tyr Lys Asp Asn Ala

1 5 10 15

Arg Pro Asn Ser Ser Lys Leu Ser Pro Val Thr Glu Gln His Gly Gly

20 25 30

Arg Arg Pro Pro Tyr Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly

35 40 45

Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Thr Gly Val Arg Phe His Gln Val Ser

50 55 60

Thr Ser Asn Met Glu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Glu Asp Met Glu Lys

65 70 75 80

Ser Glu Ala Val His His Gln Val Ile Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe

85 90 95

Lys Ile Ile Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn

100 105 110

Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn

115 120 125

Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser

130 135 140

Lys Val Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Ile Gly Ile Arg

145 150 155 160

Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ser

165 170 175

Gly Gly Arg Ser Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg Cys Ser Gly Ala Thr

180 185 190

Thr Ser Val Gly Lys Val Phe Pro Leu Ser Val Ser Leu Ser Met Ser

195 200 205

Leu Ile Ser Arg Thr Ser Gln Ile Ile Asn Met Leu Thr Ala Thr Ser

210 215 220

Asp Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Val Pro Asp Asp Ile Glu

225 230 235 240

Arg Glu Phe Asp Thr Gln Glu Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile

245 250 255

Lys Arg Trp Leu Asn Asp Met Pro Leu Leu Gln Ala Thr Asn Tyr Met

260 265 270

Val Leu Pro Glu Asn Ser Lys Ala Lys Val Cys Thr Ile Ala Val Gly

275 280 285

Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ser Cys Val Glu Glu Ser Thr Val Leu Leu

290 295 300

Tyr His Asp Ser Arg Gly Ser Gln Asp Gly Ile Leu Val Val Thr Leu

305 310 315 320

Gly Ile Phe Gly Ala Thr Pro Met Asp His Ile Glu Glu Val Ile Pro

325 330 335

Val Ala His Pro Ser Met Glu Lys Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly

340 345 350

Phe Ile Lys Asp Ser Ile Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Ala Ser

355 360 365

Glu Lys Gln Glu Glu Gln Lys Gly Trp Leu Glu Ser Ala Cys Gln Arg

370 375 380

Lys Thr Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Asp Ala Ser

405 410 415

Val Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr Gly Pro Val Ile Leu

420 425 430

Asn Gly Asp Ala Met Asp Tyr Tyr Gln Ser Pro Leu Leu Asn Ser Gly

435 440 445

Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Ala Thr Ile Leu Gly Leu Ile Asn

450 455 460

Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Thr Val Ile Pro Gln Val Leu Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Arg Glu Ser Cys Gly Asn Cys Tyr Leu Pro Ile Gln Thr

485 490 495

Ser Gln Ile Ile Asp Arg Asp Val Leu Ile Glu Ser Asn Val Val Val

500 505 510

Leu Pro Thr Gln Ser Phe Arg Tyr Val Ile Ala Thr Ser Val Ile Ser

515 520 525

Arg Asn Asp His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr His Pro Ile Arg Thr

530 535 540

Ile Ser Tyr Thr His Pro Phe Arg Leu Thr Thr Lys Gly Arg Pro Asp

545 550 555 560

Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp Asn Leu Trp Cys His

565 570 575

Gln Phe Tyr Arg Tyr Glu Pro Asn Ile Ala Asn Ser Thr Thr Ser Val

580 585 590

Glu Asn Leu Val Arg Ile Arg Phe Ser Cys Asn Arg Ser Asn Pro

595 600 605

Claims

1.一种犬瘟热弱毒株, 其特征在于，所述的犬瘟热弱毒株为犬瘟热病毒（Caninedistemper virus）QN-1株，其保藏编号为CCTCC NO:V201814。

2.权利要求1所述的弱毒株在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为冻干疫苗。

4.一种冻干疫苗，其特征在于，所述的疫苗使用权利要求1所述的弱毒株作为抗原。