CN116064417A

CN116064417A - 一株猫泛白细胞减少症病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN116064417A
Application number: CN202211258945.4A
Authority: CN
Inventors: 徐彦召; 王青; 安志兴; 宋会帅; 谈晓梅; 申玉华; 胡建和
Original assignee: Henan Institute of Science and Technology
Current assignee: Henan Institute of Science and Technology
Priority date: 2022-10-14
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2023-05-05

Abstract

本发明提供了一株猫泛白细胞减少症病毒毒株及其应用。本发明的猫泛白细胞减少症病毒毒株命名为猫泛白细胞减少症病毒RC‑2021，其保藏编号为CCTCC NO:V202196。本发明提供的猫泛白细胞减少症病毒为高致病性毒株，F81细胞培养具有较高的病毒滴度；该分离病毒应用于猫后可产生典型的临床症状，具有较强的致病性，具备应用于疫苗评价的潜质。该病毒的灭活制品具有良好的免疫原性，免疫动物后可使动物产生较好的免疫应答，可刺激机体产生较高水平的中和抗体，具体开发灭活疫苗的潜质。本发明提供猫泛白细胞减少症病毒RC‑2021株可作为强毒株，用于评价疫苗免疫效果，制备的灭活疫苗可用于预防猫泛白细胞减少症。

Description

一株猫泛白细胞减少症病毒毒株及其应用

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一株猫泛白细胞减少症病毒毒株及其应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症（Feline Panleukopenia，FP），也可以称为“猫瘟热、猫瘟、猫传染性肠炎”，是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline Panleukopenia Virus，FPV）感染猫后引起以白细胞减少、高热、呕吐和肠炎为主要特征的一种高度接触性病毒传染病。

猫泛白细胞减少症病毒又称猫细小病毒，属于细小病毒科细小病毒属，该病毒的核酸类型为单股DNA。和其他细小病毒一样FPV没有囊膜，病毒由核衣壳和内部的DNA构成。核衣壳由三种多肽组成分别是VP1、VP2和VP3，VP3是由宿主蛋白酶酶切VP2而生成，内部的单链DNA长度约5000 nt。

FPV在广泛分布在全世界各地，是当前危害猫科动物的主要病原，我国于1984年首次从自然发病的猫体内分离到FNF8病毒株，以后又陆续分离到多株FPV。猫感染FPV后，以1周岁以下的猫病情最为严重，死亡率可达70%以上。目前，国内有进口的FPV灭活疫苗在使用，对该病防控在一定程度发挥了积极作用，但近几年，尤其是2021年下半年以来，免疫FPV灭活疫苗的猫仍高发此病。尽管DNA病毒相对于RNA病毒的变异速度并不是很快，但疫苗的接种在一定程度上加速了病毒的变异速度。为此，筛选出具有地域流行特征的FPV分离株对FP的防控更具有针对性和现实意义。

发明内容

本发明的目的一方面在于提供一种新的具有地方流行特点的猫泛白细胞减少症病毒毒株，其为猫泛白细胞减少症病毒RC-2021株，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；其NS1蛋白基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，NS2蛋白基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，VP1蛋白基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，VP2蛋白基因具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列。

该猫泛白细胞减少症病毒RC-2021株于2021年12月29日保藏在位于中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），分类命名为：猫泛白细胞减少症病毒RC-2021，保藏登记号为CCTCC NO:V202196。

本发明的目的另一方面在于提供一种猫泛白细胞减少症病毒毒株在制备生物制品中的应用，所述猫泛白细胞减少症病毒毒株是猫泛白细胞减少症病毒RC-2021，其保藏登记号为CCTCC NO:V202196。

上述猫泛白细胞减少症病毒毒株在制备生物制品中的应用中，所述生物制品是猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗或联苗、或者是疫苗评价药物。

上述猫泛白细胞减少症病毒毒株在制备生物制品中的应用中，所述猫泛白细胞减少症病毒优选是灭活疫苗，其中抗原是灭活的猫泛白细胞减少症病毒RC-2021。

本发明的目的还在于提供利用所述猫泛白细胞减少症病毒RC-2021株所制备的生物制品，如猫泛白细胞减少症病毒灭活疫苗或联苗、或者是疫苗评价药物。

本发明的有益效果为：

本发明从确诊猫细小病毒的病料中分离出一株新的FPV RC-2021株，通过动物回归试验，确定了该病毒株具有较高的致病力，可使未免疫FPV典型的临床症状，最终可导致感染猫出现死亡。

通过安全性、免疫原性等方面的研究，确定了制备的FPV RC-2021株灭活疫苗毒株具有良好的安全性，并可产生良好的体液应答，可诱导免疫猫产生高水平的中和抗体水平。因此，FPV RC-2021株可作为潜在的猫泛白细胞减少症灭活疫苗的候选疫苗株，用于防控FPV病毒的流行。

附图说明

图1：分离病毒在F81细胞上的病变图；A：正常的F81细胞；B：F81细胞第三代毒。

图2：PCR检测病料中FPV特异性条带电泳图；M：DNA Maker2000；1：粪便病料上清（引物FPV-UP/DP）扩增产物；2：粪便病料DNA（引物FPV-UP/DP）扩增产物；3：阴性对照（引物FPV-UP/DP）。

图3：FPV RC-2021在F81细胞形成的空斑图。

图4：FPV RC-2021株纯化病毒的电镜图。

图5：FPV RC-2021株基因组全长的分段克隆图；M：DL5000DNA maker；1：P1引物扩增产物；2：P2引物扩增产物；3：P3引物扩增产物；4：P1阴性对照；5：P2阴性对照；6：P3阴性对照。

图6：FPV RC-2021毒株攻毒猫后，发病猫临床症状观察结果；A：患病猫精神状态；B：猫眼分泌物；C：病猫呕吐物；D：病猫粪便。

图7：FPV RC-2021毒株攻毒猫后，发病猫粪便PCR检测结果图；M：DL2000DNAmaker；1：实验组猫1；2：实验组猫2；3：实验组猫3；4：实验组猫4；5：实验组猫5；6：阴性对照。

图8：FPV RC-2021毒株攻毒猫后，发病猫血项分析结果。

图9：FPV RC-2021毒株攻毒猫后，内脏器官病变图。

图10：FPV RC-2021毒株灭活苗细胞中和抗体检测图；A：抗体1:200稀释中和病毒后细胞病变；B：病毒对照。

保藏信息

FPV RC-2021株：

保藏时间：2021年12月29日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:V202196；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

分类命名：猫泛白细胞减少症病毒RC-2021。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规实验室分析纯，实施例中所用的技术均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1FPV 的分离及鉴定

1、病毒分离

（1）从河南新乡某宠物医院收集确诊猫泛白细胞减少症病毒感染的病猫的粪便。将粪便称重后，用10倍体积的高糖DMEM稀释，充分混匀，4 ℃，12000 rpm，20 min离心，取上清；0.22μm滤器过滤，分装至灭菌EP管中，﹣80 ℃冰箱保存。

(2) 复苏F81细胞；待F81细胞铺满细胞培养瓶约70 %～80 %时，将上步骤（1）中处理后的病料用无血清的高糖DMEM按照1:10的比例稀释，接种到F81细胞中（每个T25细胞培养瓶用约2 mL的稀释病毒进行孵育）；37 ℃ 5% CO₂培养箱，孵育2 h；换新鲜的无血清高糖DMEM培养基，置于37 ℃ 5 % CO₂培养箱培养2～3天，观察接种细胞的病变出现情况。

(3) 将第一代的F81培养物取出在﹣80 ℃与常温之间冻融3次，收集混悬液，4 ℃，12000 rpm，20 min离心，取上清，分装至灭菌EP管中（即为P1代病毒），﹣80 ℃冰箱保存。

将收集到的第一代病毒液，按照1:10的比例接于70%～80%密度的F81细胞上，吸附2 h后，换新鲜的不含血清的培养基，继续培养2～3天，观察接种细胞病变情况。结果显示，本实施例成功从病料中分离到猫泛白细胞减少症病毒（FPV），其在易感细胞F81上培养表现出FPV样的病变，如图1B所示，细胞出现聚堆、变圆、脱落等课件细胞病变。

然后按照上述步骤盲传病毒3代。

2、病毒的鉴定

（1）PCR鉴定

取P3代病毒液1 μL，进行PCR鉴定，鉴定用引物序列为：

FPV-UP：5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAG-3’；

FPV-DP：5’-GAATTGGATTCCAAGTATGAG-3’。

PCR鉴定体系为2×PCR MIX 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板1 μL，水8 μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95 ℃预变性5 min，循环参数：95 ℃30s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃再延伸10 min，16 ℃保存。PCR反应结束后，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图2所示，粪便病料DNA扩增产物在约750bp处出现特异性条带。

（2）测序鉴定

按照上述PCR鉴定程序，等比例扩大PCR体系至50 μL，PCR 产物经回收后送公司测序，并将序列使用NCBI Blast软件进行比对分析。

测序结果显示，粪便病料DNA扩增产物长度为768 bp。Blast软件比对结果显示，分离病毒扩增出的基因序列与NCBI现有数据库中的猫泛白细胞减少症病毒的同源性最高，提示分离病毒为猫泛白细胞减少症病毒。

实施例2 FPV RC-2021的噬斑纯化

（1）将F81细胞接种至6孔板中，当细胞密度为80%～90%，十倍倍比稀释P3代稀释，获得五个浓度的病毒稀释液（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6）；分别向6孔板中的每一个孔里滴加病毒液200 μL，37 ℃吸附2h，弃去病毒液，PBS洗两遍。

（2）取高压灭菌后的2%的低熔点琼脂糖溶液，微波炉融化后，置于37 ℃水浴锅中保温待用；将配置好经过滤除菌的2×高糖的DMEM培养基也置于37 ℃水浴锅中预热；将2%低琼脂糖溶液与2×高糖DMEM维持液按照1:1的比例混匀后，加入上述病毒孵育后的6孔板中，3 mL/孔；将6孔板放置在超净工作台上，室温放置10 min让培养基自然凝固；接着将6孔板置于4 ℃冰箱10 min，使培养基充分凝固；最后将6孔板倒置于37 ℃，CO₂培养箱中培养，于每隔12 h观察细胞病变出现情况。

（3）白光下观察噬斑的出现情况，并在培养板底部用记号笔做好标记；超净工作台上用切除前段尖部的1 mL枪头，连同上层覆盖琼脂一起移走培养物，溶解于无血清的高糖DMEM培养基中；

（4）充分溶解后按照上述步骤再次进行病毒的纯化，分离病毒进行3轮纯化。

经过3轮纯化后得到的病毒在F81细胞形成的空斑图如图3所示，大量培养收集病毒，并将该纯化病毒命名为FPV RC-2021株。

实施例3 FPV RC-2021的电镜结果

将纯化过的10 μL FPV RC-2021病毒液，滴加到100目铜网上，自然干燥后负染，用滤纸吸取多余液体，置于透射电镜（HITACHI 7700）下观察。

FPV RC-2021株病毒在电镜下的形态如下图4所示，病毒粒子在电镜下呈等轴对称的二十面体，直径约20nm，无囊膜。

实施例4 FPV RC-2021株病毒的TCID₅₀测定

（1）将F81细胞传代接种于96孔板中，待细胞密度达到约80%，用无血清的高糖DMEM将按10倍倍比稀释纯化病毒后，每孔加入100 μL稀释后病毒液，每个稀释度作8个重复，置于37 ℃ 5% CO₂培养箱中吸附2h。

（2）用移液器吸出孵育病毒液，用PBS清洗接毒后的细胞2次，加入无血清的高糖DMEM培养基继续培养细胞72h。

（3）72h后取出，显微镜下观察细胞病变的情况，并记录每个稀释度出现病毒的细胞孔数。

（4）采用Reed-Muench法计算纯化病毒TCID₅₀。

结果如表1所示，病毒接种96孔板中的细胞后，病毒的稀释度越低出现细胞病变的越明显，病毒的稀释度越高出现的细胞病变越少，根据累计出现细胞的情况按照计算公式得到该纯化病毒的滴度为10^-6.75/0.1 mL。

表1 不同病毒稀释倍数下的细胞病变情况

稀释倍数	出现细胞病变的孔数	不出现细胞病变的孔数	累计出现细胞病变的孔数	累计不出现细胞病变的孔数	出现细胞病毒的比例
						<![CDATA[10<sup>-1</sup>]]>	0	8	0	8	0%
<![CDATA[10<sup>-2</sup>]]>	0	8	0	16	0%
						<![CDATA[10<sup>-3</sup>]]>	0	8	0	24	0%
<![CDATA[10<sup>-4</sup>]]>	0	8	0	32	0%
						<![CDATA[10<sup>-5</sup>]]>	0	8	0	40	0%
<![CDATA[10<sup>-6</sup>]]>	1	7	1	47	12.5%
						<![CDATA[10<sup>-7</sup>]]>	5	3	6	50	62.5%

实施例5 FPV RC-2021病毒株全基因测序分析

（1）目的基因扩增

取纯化后的FPV RC-2021株病毒液300 μL，利用 Viral DNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。

以提取的病毒DNA为模板，利用如下引物进行病毒全基因组的扩增，扩增时，将病毒全基因组分为P1、P2、P3进行分别扩增：

P1上游引物：1-xiu：5’-CTTGGTCAGTTGGTTCTAAAG-3’；

P1下游引物：1-DP：5’-AAAGTTACCAGCTTCTTCAACCC-3’；

P2上游引物：2-UP：5’-CTGTGGGTAATGTTGGTTGTT-3’；

P2下游引物：2-DP：5’-TGGATCACCATCTGCTGCTTG-3’；

P3上游引物：3-UP：5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3’；

P3下游引物：3-DP：5’-TTAATATAATTTTCTAGGTGCT-3’；

扩增体系：5×Buffer 10 μL，d NTP Mix 1 μL，Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase 1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板1 μL，水33 μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95 ℃预变性3 min后进入循环，循环参数：95 ℃30s，56 ℃15s，72 ℃1 min，34个循环后72 ℃延伸10 min，16 ℃5 min。

（2）测序：将扩增的目的基因PCR产物送往生物测序公司测序。目的基因覆盖了FPVRC-2021株的全基因组，包括全部非结构蛋白（NS1 和NS2）和结构蛋白基因（VP1和VP2）。目的基因的PCR扩增结果如图5所示，P1目的条带长度为1520 bp，P2目的条带长度为2369 bp；P3目的条带长度为1747 bp。

FPV RC-2021株的基因序列为：5'-ATTGGTCAGTTGGTTCTAAAGAATGATAGGCGG

TTTGTGTGTTTAAACTTGGGCGGGAAAAGGTGGCGGGCTAATTGTGGGCGTGGTTAAAGGTATAAAAGACAAACCATAGACCGTTACTGGCATTCGCTTCTTGTCTTTGACAGAGTGAACCTCTCTTACTTTGACTAACCATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGGAAGTTATGGAGGGAGTAAATTGGTTAAAAAAACATGCAGAAAATGAAGCATTTTCGTTTGTTTTTAAATGTGACAACGTCCAACTAAATGGAAAGGATGTTCGCTGGAACAACTATACCAAACCAATTCAAAATGAAGAGCTAACATCTTTAGTTAGAGGAGCACAAACAGCAATGGATCAAACCGAAGAAGAAGAAATGGACTGGGAATCGGAAGTTGATAGTCTCGCCAAAAAGCAAGTACAAACTTTTGATGCATTAATTAAAAAATGTCTTTTTGAAGTCTTTGTTTCTAAAAATATAGAACCAAATGAATGTGTTTGGTTTATTCAACATGAATGGGGAAAAGATCAAGGCTGGCATTGTCATGTTTTACTTCATAGTAAGAACTTACAACAAGCAACTGGTAAATGGCTACGCAGACAAATGAATATGTATTGGAGTAGATGGTTGGTGACTCTTTGTTCGGTAAACTTAACACCAACTGAAAAGATTAAGCTCAGAGAAATTGCAGAAGATAGTGAATGGGTGACTATATTAACATACAGACATAAGCAAACAAAAAAAGACTATGTTAAAATGGTTCATTTTGGAAATATGATAGCATATTACTTCTTAACAAAGAAAAAAATTGTCCACATGACAAAAGAAAGTGGCTATTTTTTAAGTACTGATTCTGGTTGGAAATTTAACTTTATGAAGTATCAAGACAGACAAACTGTCAGCACACTTTACACTGAACAAATGAAACCAGAAACCGTTGAAACCACAGTGACGACAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAATTCAAACTAAAAAGGAAGTTTCGATCAAATGTACTTTGCGGGACTTGGTTAGTAAAAGAGTAACATCACCTGAAGATTGGATGATGTTACAACCAGATAGTTATATTGAAATGATGGCACAACCAGGAGGTGAAAATCTTTTAAAAAATACACTTGAAATTTGTACTTTGACTTTAGCAAGGACAAAAACAGCATTTGAATTAATACTTGAAAAAGCAGATAATACTAAACTAACTAACTTTGATCTTGCAAATTCTAGAACATGTCAAATTTTTAGAATGCACGGATGGAATTGGATTAAAGTTTGTCACGCTATAGCATGTGTTTTAAATAGACAAGGTGGTAAAAGAAATACAGTTCTTTTTCATGGACCAGCAAGCACAGGAAAATCTATTATTGCTCAAGCCATAGCCCAACCTGTGGGGAATGTTGGTTGTTATAATGCAGCAAATGTAAAGGTTCCATTTAATGACTGTACCAATAAAAATTTAATTTGGATTGAAGAAGCTGGTAACTTTGGTCAACAAGTTAATCAATTTAAAGCAATTTGTTCTGGACAAACAATTAGAATTGATCAAAAAGGTAAAGGAAGTAAGCAAATTGAACCAACTCCAGTAATTATGACAACTAATGAAAATATAACAATTGTAAGAATTGGATGTGAAGAAAGACCTGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATTAAGTTAGTGTGTAAGCTTCCAGGAGACTTTGGTTTGGTTGATAAAGAAGAATGGCCTTTAATATGTGCATGGTTAGTTAAACATGGTTATGAATCAACCATGGCTAACTATACACATCATTGGGGAAAAGTACCAGAATGGGATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGCTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAGAGACACAAGCGGCAAACAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCGACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGTGTTAGTAAGGTGGGGGGAGGGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTCTTATAGGACTTGTGCCACCAGGCTATAAATTTTTTGGGCCTGGAAACAGTTTTGACCAAGGAGAACCAAATAACCCTTTTGACGCCGCTGCAAAAGAACAAGAGGAAGCTTACGTTGTTTTTTTTCGTTTTGGTAAAAACCCATATTTATTTTTTTTGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAAAAACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAAAAGAGTAGTTGTAAATAATATGGATAAAACTGCAGTTAAAGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGTACAAATTGTAACTCCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATATCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAATCTGAAGGAGCTACTAACTTTGGTGATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAGACTATATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAAGCATCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACTACAACAGGAGAAACACCCGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAAATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCATCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAATAATATTGGAGCTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA-3'，如SEQ ID NO:1所示，其中，1～173bp为5’端非编码区的部分序列，174～4442bp为编码区序列。该纯化病毒3’、5’端非编码区的序列，未能完全、准确测定，但这并不影响对于该病毒致病性和免疫原性的研究。FPV RC-2021株的NS1蛋白基因的核苷酸序列为：5'-ATGTCTGGCAACCAGTATAC

TGAGGAAGTTATGGAGGGAGTAAATTGGTTAAAAAAACATGCAGAAAATGAAGCATTTTCGTTTGTTTTTAAATGTGACAACGTCCAACTAAATGGAAAGGATGTTCGCTGGAACAACTATACCAAACCAATTCAAAATGAAGAGCTAACATCTTTAGTTAGAGGAGCACAAACAGCAATGGATCAAACCGAAGAAGAAGAAATGGACTGGGAATCGGAAGTTGATAGTCTCGCCAAAAAGCAAGTACAAACTTTTGATGCATTAATTAAAAAATGTCTTTTTGAAGTCTTTGTTTCTAAAAATATAGAACCAAATGAATGTGTTTGGTTTATTCAACATGAATGGGGAAAAGATCAAGGCTGGCATTGTCATGTTTTACTTCATAGTAAGAACTTACAACAAGCAACTGGTAAATGGCTACGCAGACAAATGAATATGTATTGGAGTAGATGGTTGGTGACTCTTTGTTCGGTAAACTTAACACCAACTGAAAAGATTAAGCTCAGAGAAATTGCAGAAGATAGTGAATGGGTGACTATATTAACATACAGACATAAGCAAACAAAAAAAGACTATGTTAAAATGGTTCATTTTGGAAATATGATAGCATATTACTTCTTAACAAAGAAAAAAATTGTCCACATGACAAAAGAAAGTGGCTATTTTTTAAGTACTGATTCTGGTTGGAAATTTAACTTTATGAAGTATCAAGACAGACAAACTGTCAGCACACTTTACACTGAACAAATGAAACCAGAAACCGTTGAAACCACAGTGACGACAGCACAGGAAACAAAGCGCGGGAGAATTCAAACTAAAAAGGAAGTTTCGATCAAATGTACTTTGCGGGACTTGGTTAGTAAAAGAGTAACATCACCTGAAGATTGGATGATGTTACAACCAGATAGTTATATTGAAATGATGGCACAACCAGGAGGTGAAAATCTTTTAAAAAATACACTTGAAATTTGTACTTTGACTTTAGCAAGGACAAAAACAGCATTTGAATTAATACTTGAAAAAGCAGATAATACTAAACTAACTAACTTTGATCTTGCAAATTCTAGAACATGTCAAATTTTTAGAATGCACGGATGGAATTGGATTAAAGTTTGTCACGCTATAGCATGTGTTTTAAATAGACAAGGTGGTAAAAGAAATACAGTTCTTTTTCATGGACCAGCAAGCACAGGAAAATCTATTATTGCTCAAGCCATAGCCCAACCTGTGGGGAATGTTGGTTGTTATAATGCAGCAAATGTAAAGGTTCCATTTAATGACTGTACCAATAAAAATTTAATTTGGATTGAAGAAGCTGGTAACTTTGGTCAACAAGTTAATCAATTTAAAGCAATTTGTTCTGGACAAACAATTAGAATTGATCAAAAAGGTAAAGGAAGTAAGCAAATTGAACCAACTCCAGTAATTATGACAACTAATGAAAATATAACAATTGTAAGAATTGGATGTGAAGAAAGACCTGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATTAAGTTAGTGTGTAAGCTTCCAGGAGACTTTGGTTTGGTTGATAAAGAAGAATGGCCTTTAATATGTGCATGGTTAGTTAAACATGGTTATGAATCAACCATGGCTAACTATACACATCATTGGGGAAAAGTACCAGAATGGGATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGCTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAGAGACACAAGCGGCAAACAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCGACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGATTAA-3'，如SEQ ID NO:2所示；NS2蛋白基因的核苷酸序列为：5'-ATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGGAAGTTATGGAGGGAGTAAATTGGTT

AAAAAAACATGCAGAAAATGAAGCATTTTCGTTTGTTTTTAAATGTGACAACGTCCAACTAAATGGAAAGGATGTTCGCTGGAACAACTATACCAAACCAATTCAAAATGAAGAGCTAACATCTTTAGTTAGAGGAGCACAAACAGCAATGGATCAAACCGAAGAAGAAGAAATGGACTGGGAATCGGAAGTTGATAGTCTCGCCAAAAAGTTGCAAAGACTTAGAGACACAAGCGGCAAACAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCGACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGA-3'，如SEQ ID NO:3所示；VP1蛋白基因的核苷酸序列为：5'-ATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGACTTGT

GCCACCAGGCTATAAATTTTTTGGGCCTGGAAACAGTTTTGACCAAGGAGAACCAAATAACCCTTTTGACGCCGCTGCAAAAGAACAAGAGGAAGCTTACGTTGTTTTTTTTCGTTTTGGTAAAAACCCATATTTATTTTTTTTGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAAAAACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAAAAGAGTAGTTGTAAATAATATGGATAAAACTGCAGTTAAAGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGTACAAATTGTAACTCCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATATCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAATCTGAAGGAGCTACTAACTTTGGTGATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAGACTATATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAAGCATCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACTACAACAGGAGAAACACCCGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAAATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCATCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAATAATATTGGAGCTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA-3'，如SEQ ID NO:4所示；VP2蛋白基因的核苷酸序列为：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGG

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实施例6 FPV RC-2021病毒株致病性分析

1. FPV RC-2021病毒株对幼猫的致病力测定

选5月龄左右的幼猫6只，幼猫经FPV核酸检测阴性且未免疫FPV疫苗。实验组5只幼猫均采用肌肉和口服的方式感染FPV RC-2021病毒株1 mL（含10⁵ TCID₅₀/ mL）。另取1只幼猫以同样的方法注射高糖DMEM培养基生理盐水1 mL，作为对照组的猫，隔离饲养，正常饲喂，记录试验结果。病毒感染后，每天在与接种时间对应的时刻进行观察，并按正常、发病和死亡记录幼猫的临床发病情况。

结果显示，实验组的猫在接种FPV RC-2021病毒后，在实验室正常饲养的过程中，7天内先后发生死亡，死亡前表现为精神沉郁、发烧、眼睑出现分泌物、拉稀、呕吐等临床症状，代表性临床症状如图6所示。

2. 发病猫粪便的FPV PCR检测

收集病死猫的粪便，采用实施例1的方法对样品处理并用FPV-UP/DP引物进行PCR扩增，结果显示，所有鉴定病料中FPV均为阳性，见图7。

3. 病猫血液指标分析

采集出现临床症状的猫，进行血液指标分析，发现病猫的白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞明显降低，如图8所示，部分猫的红细胞数目也出现下降。

4. 病死猫剖检检测

剖检病猫内脏器官发现，感染猫腹腔病变最为明显，具体表现为：肠管充盈、变薄，出血严重，见图9。综上所述，FPV RC-2021 具有较强的致病力，可以用于疫苗免疫效果的评价。

实施例7 FPV RC-2021病毒株免疫原性分析

1、FPV RC-2021灭活疫苗的制备

（1）病毒的扩增：将F81细胞接种至T75细胞培养瓶中，待细胞密度为70%～80%时，以0.1×MOI的病毒感染剂量感染细胞，吸附2h后，补加无血清的高糖DMEM培养基，48 h收毒，-80 ℃与常温交替反复冻融3次，12000rpm，20 min，4 ℃离心，收上清，并用0.22μm滤器过滤，备用。

（2）病毒的灭活：在上述病毒液中按照1:2000的比例加入β-丙内酯，4 ℃充分灭活24 h，37 ℃水解2 h用以消除残留的β-丙内酯。

（3）灭活效果的检测：取灭活好的病毒液按照1:10的比例加入F81细胞中，观察是否出现病变，检验是否灭活彻底。

2、灭活疫苗免疫原性的测定

（1）每只猫免疫10^6.0TCID ₅₀的剂量，抗原与赛比克水佐剂比例为1:9，皮下多点注射，颈背部皮肤。

（2）免疫之后称体重，量体温，观察临床症状，评估疫苗的安全性。

（3）首免后21天对猫进行二次免疫，二次免疫后10天对免疫猫进行前肢静脉采血，通过中和实验检测中和抗体水平。F81细胞中和实验：将采得的静脉血4 ℃过夜，析出血清，3000 rpm，10 min，取上清，56 ℃灭活30 min。使用无血清的DMEM进行2倍比稀释，加入96孔板，50 μL/孔。将病毒液稀释到100×TCID₅₀/100 μL，与稀释好的免疫血清等量混合，37 ℃孵育1h。孵育结束后，接种加入细胞，100 μL/孔细胞液。

安全性评价结果显示，免疫后14天内，接种猫未出现不良反应，体温正常，体重逐日上升，说明灭活的FPV RC-2021疫苗株具有良好的安全性。

免疫原性评价结果显示，二次免疫后第10天进行一次前肢静脉采血，检测中和抗体水平，免疫血清经1:200稀释后能够中和FPV RC-2021病毒对F81细胞的感染，如图10所示。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims

1.一株猫泛白细胞减少症病毒毒株，其特征在于，所述猫泛白细胞减少症病毒毒株的保藏编号为：CCTCC NO:V202196。

2.根据权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒毒株，其特征在于，所述猫泛白细胞减少症病毒毒株的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO:1所示的基因序列在制备灭活疫苗或联苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述灭活疫苗或联苗为防治猫泛白细胞减少症的灭活疫苗或联苗。

5.权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO:1所示的基因序列在制备疫苗评价药物中的应用。

6.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO:1所示的基因序列。

7.一种疫苗评价药物，其特征在于，包括权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO:1所示的基因序列。