CN117230026A - 柯萨奇病毒a6型cva6-km-j33及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了柯萨奇病毒A6型CVA6‑KM‑J33及应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一株柯萨奇病毒A6型CVA6‑KM‑J33，属于CVA6病毒。本发明所述毒株CVA6‑KM‑J33对KMB17细胞易感，能够获得较高滴度。本发明所述毒株毒力较强，对乳鼠具有高致病和致死能力，具有良好免疫原性，是一株效果良好的病毒株。该毒株可用于柯萨奇病毒A6型疫苗的免疫原性评价或保护性评价，提高疫苗免疫原性评价的准确性和重复性，还可以用于制备柯萨奇病毒感染动物模型，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33及应用。
背景技术
儿童手足口病（Hand-foot-mouth diseases, HFMD）是20年来在全球不同地区，尤其是亚洲-太平洋地区不断出现的儿童群体性的病毒性传染病。自2000年以来，以东亚地区发病率较为集中，重症手足口病主要表现为神经系统临床症状的病例约占1.5~2%，其中还有部分病儿由于神经系统受损而在短时间内发展成为神经源性肺水肿及心血管系统受损导致的死亡，因而形成了一个严重的公共卫生问题。
针对HFMD的病原学研究表明，该疾病可由多种人类肠道病毒引起，其中，除了肠道病毒71型（Enterovirus EV71）之外，主要的病原为柯萨奇A组16型病毒（CoxsackievirusA16）及柯萨奇A组6型病毒（Coxsackievirus A6）。2013年以来我国大部分地区的抽样调查表明，CVA6引起的病例在儿童总发病群体中的比例约为总发病人数的35~39%以上[1-9]。由于EV71和CVA6疫苗的应用，使得CVA6引起的病人比例在各个地区逐步上升。同时，针对CVA6感染病例的临床及流行病学分析亦提示，CVA6感染病人中重症比例亦有所上升。因此，筛选出一株中和能力好、遗传稳定、毒力性强的柯萨奇病毒A6型毒株是非常必要的。
CVA6病毒属于肠道病毒，与EV71、CA16具有相似的结构特征。作为小RNA病毒属的成员，三者的抗原组成模式亦十分相近，均有病毒编码4个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，并由其中的三个蛋白组成的衣壳体共同作用于免疫系统而可以诱导完整的免疫反应。引起HFMD的肠道病毒主要包括四种类型：EV-A、EV-B、EV-C和EV-D。柯萨奇病毒A6型(CV-A6)属于肠道病毒A组，共16个亚型，其中亚型A组11个和B组5个。根据基因型的不同，CV-A6划分为A~E五个分支，目前世界范围内的CV-A6流行株均属于D型，分为D1、D2和D3，D3亚型又可细分为D3a和D3b型。
目前关于手足口病的发病机制还不清楚，特别是CVA6的致病机理尚未报道，筛选抗CVA6药物和疫苗具有重要意义。此外，由于小鼠对临床分离获得的毒株易感性普遍较差，只有个别临床分离病毒能够使小鼠感染。因此，筛选可用于柯萨奇病毒A6型感染动物模型构建的毒株同时具有重要意义。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33及应用，所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33交叉中和能力好、遗传稳定、毒力性强。
本发明提供了一株柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No. V202384。
优选的，所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的繁殖和传代方法，包括以人二倍体细胞作为基质细胞进行繁殖和传代。
优选的，所述人二倍体细胞包括人胚肺二倍体细胞KMB17。
优选的，利用所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33感染人胚肺二倍体细胞KMB17后，于37℃ 5%CO2条件下培养。
本发明还提供了利用上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的基因组RNA制备得到的生物制剂。
优选的，所述基因组RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种抗柯萨奇病毒A6型毒株的抗血清，所述抗血清的制备方法，包括对动物注射上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，收集血清得到所述抗血清。
本发明还提供了一种预防和/或治疗柯萨奇病毒A6型毒株所致疾病的疫苗或药物，活性成分包括上述生物制剂，或上述抗血清。
本发明还提供了上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的灭活毒株作为药物递送介质中的应用。
有益效果：本发明提供了一株柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，属于CVA6病毒。本发明所述毒株CVA6-KM-J33在Vero细胞分离得到，扩增3代后，接种于KMB17细胞上适应性传代。本发明所述毒株对KMB17细胞易感，能够获得较高滴度。本发明所述毒株毒力较强，对乳鼠具有高致病和致死能力，具有良好免疫原性，是一株效果良好的病毒株。该毒株可用于柯萨奇病毒A6型疫苗的免疫原性评价或保护性评价，提高疫苗免疫原性评价的准确性和重复性，还可以用于制备柯萨奇病毒感染动物模型，具有较好的应用前景。
生物保藏信息
柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33（Coxsackievirus CVA6-KM-J33），于2023年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏地址为中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC No. V202384。
附图说明
图1为本发明实施例1中RT-PCR扩增产物电泳图；
图2为本发明实施例1中CVA6-KM-J33基于VP1区核苷酸的种系进化树；
图3为本发明实施例1中内交叉中和能力的检测结果图；
图4为本发明实施例4中病毒株在人二倍体细胞KMB17上生长曲线；
图5为本发明实施例5中不同感染计量下接种CVA6-KM-J33毒株乳鼠的临床表现、生存率（A）、评价临床症状评分（B）图；
图6为本发明实施例5中1日龄乳鼠接种CVA6-KM-J33后不同组织内病毒载量的变化图；图中A为1日龄乳鼠接种剂量为105CCID50/只脑内注射感染CV-A6病毒后各组织病毒载量随感染天数变化情况，B为1日龄乳鼠接种剂量为106CCID50/只脑内注射感染CV-A6病毒后各组织病毒载量随感染天数变化情况，C为1日龄乳鼠接种剂量为107CCID50/只脑内注射感染CV-A6病毒后各组织病毒载量随感染天数变化情况，其中，log的底数均为10；
图7为本发明实施例5中新生乳鼠感染CVA6-KM-J33后脑和肺组织的HE染色结果图；图中A为正常肺组织；B为肺-内皮细胞坏死脱落；C为正常脑组织；D为脑-局部（小脑）点灶性出血，大脑神经元细胞较少，轻度水肿，个别细胞核固缩；
图8为本发明实施例6中实验性灭活疫苗免疫原性评价图，图中A为不同剂量，加免前、后血清中和抗体阳转率；B为三种途径免疫小鼠中和抗体效价比较；35天：加免后第7天。
具体实施方式
本发明提供了一株柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.V202384。
本发明所述毒株CVA6-KM-J33在Vero细胞分离得到，扩增3代后，接种于KMB17细胞上适应性传代。本毒株对KMB17细胞易感，能够获得较高滴度。该毒株毒力较强，对乳鼠具有高致病和致死能力，具有良好免疫原性，是一株效果良好的病毒株。
本发明所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，表明属于CVA6病毒。
本发明还提供了上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的繁殖和传代方法，包括以人二倍体细胞作为基质细胞进行繁殖和传代。
本发明所述人二倍体细胞优选包括人胚肺二倍体细胞KMB17，所述人胚肺二倍体细胞KMB17是中国医学科学院医学生物学研究所自主开发建立的人源性细胞株。本发明优选利用所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33感染人胚肺二倍体细胞KMB17后，于37℃ 5%CO2条件下培养。在本发明所述培养条件下，72~96小时内，细胞病变达75%以上。
本发明还提供了利用上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的基因组RNA制备得到的生物制剂。
本发明所述生物制剂优选包括下述内容中的任一种：
1）编码所述柯萨奇病毒A6型毒株基因组RNA的核酸分子；
2）含有1）所述核酸分子的表达盒；
3）含有1）所述核酸分子的重组载体、或含有2）所述表达盒的重组载体；
4）含有1）所述核酸分子的重组微生物、或含有2）所述表达盒的重组微生物、或含有3）所述重组载体的重组微生物；
5）有1）所述核酸分子的细胞系、或含有2）所述表达盒的细胞系；
6）利用所述毒株构建的动物模型。
本发明所述动物模型优选以小鼠为基础，如以Balb/c小鼠建立动物模型。本发明所述基因组RNA的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种抗柯萨奇病毒A6型毒株的抗血清，所述抗血清的制备方法，包括对动物注射上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，收集血清得到所述抗血清。
本发明对所述动物的类型并没有特殊限定，利用本领域的常规抗血清制备动物即可。
本发明还提供了一种预防和/或治疗柯萨奇病毒A6型毒株所致疾病的疫苗或药物，活性成分包括上述生物制剂，或上述抗血清。
本发明所述柯萨奇病毒A6型毒株可通过多种免疫途径，如皮内、肌肉、皮内途径等都能产生免疫效果，免疫小鼠后抗体效价最高可达到1:1024，具有良好的免疫原性，可应用与制备脱毒苗。
本发明还提供了上述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的灭活毒株作为药物递送介质中的应用。
本发明所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33具有良好的感染性，经灭活后可作为药物递送介质，用于药物的递送。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的分离与鉴定
1、临床样本的处理：将采集自经云南省疾控中心诊断为手足口病的患儿肛拭子样本收集至15ml无菌离心管，加入1ml 0.01M PBS，用振荡仪充分振荡肛拭子临床标本，4000rpm离心20min，吸取上清加入等体积的氯仿，重复混匀后2800rpm离心15min，吸取上清。
2、病毒分离培养：在Vero细胞上进行病毒培养分离，静止培养于37℃，5%CO2条件下，连续观察7天，若在显微镜下观察到80%以上的细胞病变，收集病毒液，以此方式传代3次，可消除氯仿或其他因素造成的细胞病变。
3、病毒收获及在KMB17细胞适应性传代培养：KMB17细胞传代后24~48h内，当细胞面积接近90%时，弃生长液用PBS洗细胞一次，弃PBS后向细胞中加入无血清维持液，轻轻摇晃后吸取维持液，向培养瓶中接种适量病毒液，37℃吸附1h，补加适量维持液，于37℃培养。当显微镜下观察到80%以上的细胞出现明显病变后，将培养瓶至于-30℃冰箱冻存。
4、病毒鉴定：经过3次适应性传代培养的病毒，对收获的病毒液进行初步鉴定，主要包括分子生物学鉴定（核酸序列测定分析亚型）、及交叉中和能力的研究、基因组测序等，初步获筛病毒株。
4.1分子生物学鉴定：采用RT-PCR法鉴定CVA6病毒，将CVA6阳性的病毒株进行VP1核酸序列测定，并根据VP1核苷酸序列进行CVA6基因型分型。
1）选取GenBank中已上传的CV-A6基因序列为参考序列（参考序列基因登录号分别为MN845834.1、MN845849.1），使用NCBI（Nationa lCenter for BiotechologyInformation）网站中Primer-BLAST引物涉及功能设计表1所示的VP1段引物。
表1 RT-PCR扩增引物序列
2）用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取病毒核酸，用宝生物工程（大连）有限公司生产的PrimeScriptOneStepRT-PCRKit试剂盒扩增VP1片段，反应条件为：50℃30min；94℃ 2min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，35循环；72℃ 10min。
3）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段，送上海生工生物工程股份有限公司测序。用MEGA5.0软件进行种系进化分析。
用CVA6 VP1特异性引物扩增阳性样本能观察到大小为914bp的目的条带，再次用EV71、CA16引物扩增未出现任何条带，如图1所示（泳道1为CVA6-1引物扩增产物，泳道2和3为EV71-VP1、CA16-VP1引物扩增产物）。将鉴定为CVA6阳性的病毒株，根据VP1核酸序列进行CVA6基因型分型。结果显示为B3型。CVA6基于VP1区核苷酸序列的种系进化树如图2所示。
4.3中和抗体检测候选毒株确立，在验证CVA6-KM-J33该检测毒株只对CV-A6型免疫血清有特异性中和能力，而对其他肠道病毒如EV-A71、CV-A10及CV-A16免疫血清无交叉反应，如图3所示。从而证明该毒株适用于柯萨奇病毒A6型免疫血清的中和抗体效价的检测。
实施例2柯萨奇病毒A6标准血清制备
1、CVA6参考株病毒液粗纯
将Vero细胞接种于培养瓶中，当细胞面积接种接近90%时，分别接种适量CVA6参考株GS2015-399（来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所），置于37℃ 5% CO2培养箱中吸附1h后，补加适量无血清维持液，静置培养至细胞病变达80%以上时收获。取15-399病毒收获液于100000×g，4℃离心4h，用0.01M PBS重悬沉淀，加入1/2体积的氯仿抽提1次，2800rpm室温离心20min取出上清，即为粗纯的病毒液。
2、标准血清制备
初免时分别将15-399粗纯病毒液与弗式完全佐剂按体积1：1充分混合经皮下多点注射免疫日本大耳兔1ml/只，初免28天后用粗纯病毒液与等体积弗式不完全佐剂充分混合加强免疫4次，对照组注射等剂量PBS，连续观察并记录其生长情况，于初免后第28天、加免后第14天经耳静脉采血，分离血清的中和抗体效价为1：2048～1：8192。
3、阴性血清
未经病毒液免疫的日本大耳兔，经耳静脉采血后分离得到的血清，即为鉴定实验使用的阴性血清。
实施例3柯萨奇病毒A6型毒株的初步纯化、扩增
1、将实施例1初筛病毒株的病毒稀释液接种于6孔细胞培养板中进行纯化。
1.1 细胞准备：提前将KMB17细胞接种于6孔板中培养，长至单层致密时弃去原培养液，清洗细胞表面，洗去残留牛血清与死细胞。
1.2 病毒准备将病毒液进行适当倍数的稀释。
1.3 病毒吸附：接病毒种于6孔板内，0.4ml/孔，同时设置细胞对照，置5% CO2培养箱中37℃吸附1~2h，期间每隔15~20min轻轻摇晃细胞板数次，使病毒接触整个细胞表面。
1.4 覆盖与培养：吸附完毕后，弃去病毒液，病毒对照和细胞对照孔，加入病毒维持液3ml/孔。其余各孔沿壁缓慢加入琼脂糖和病毒维持液混合物3ml/孔，室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层，把加入琼脂糖的培养板倒置于5% CO2培养箱内37±1℃培养，每天观察并记录，蚀斑情况（形态、大小及数量）及病毒对照病变情况。
1.5 蚀斑挑取：当显微镜下看到明显空斑后，用记号笔在空斑对应位置的6孔板下方作标记；于无菌间超净工作台上，用200µl移液器对准标记位置，枪头于液面下吸取20µl混合液体，共挑取10个大小适宜的空斑。
1.6 蚀斑培养：将挑取的10个单个蚀斑，用200μl带滤芯的枪头挑取至含有100μl病毒维持液的1.5 ml EP管中，反复吹打混匀，接种至细胞已长至单层的96孔细胞培养板中，置5% CO2培养 箱中37±1℃培养，每天观察CPE。待细胞出现CPE达75%时，收集上清液，于-20℃冰箱中保存，选择能使KMB17细胞病变最快的3个病毒克隆。此时病毒代次为P2代。以此连续3次蚀斑纯化；
2．鉴定及分析：将第三次挑取的病毒克隆进行扩增，对每次挑取的病毒克隆及第三次挑斑的病毒扩增液进行感染性滴度检测。
2.1 挑取的各克隆株虽来自同一株病毒，但克隆株之间的感染性滴度存在差异，相差范围在1lgCCID50/ml以内。此外，各克隆株之间的感染性滴度随纯化次数增加有所上升，第三次蚀斑纯化后的克隆株感染性滴度最高可达6.25lgCCID50/ml。
2.2 该9份挑斑样品核酸电泳条带单一明亮，大小约为914bp与预期相符（如图1）,9份挑斑样品VP1基因核酸序列比对后未发现碱基突变，因此认为这蚀斑纯化后的9份样品仍为CVA6病毒且VP1区碱基序列和氨基酸水平保持一定稳定性。
实施例4柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33在KMB17细胞上的感染性滴度检测及生长特性分析
将病毒株CVA6-KM-J33在KMB17细胞上进行生长曲线观察，在0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、5d、6d、7d、8d，11个时间点收获病毒液，并对其进行感染性滴度检测。病毒滴定：采用微量细胞病变法检测CV-A6病毒的感染性滴度并观察病毒生长特性，用Karber公式计算结果，步骤如下：
1）KMB17细胞经制备为细胞悬液后进行细胞计数，调整细胞浓度为1.0*105个/ml接种至96孔板中（100µl/孔），于37℃5%CO2培养箱中静置培养24h；
2）CV-A6病毒液用维持液做10倍系列稀释，稀释度为10-1~10-8；
3）将10倍系列稀释好的待测病毒液加到已铺好细胞的96孔板中，每个稀释度设置8个平行复孔，100µl/孔，细胞对照组加入100µl维持液。
4）于37℃5%CO2培养箱中静置培养；
5）其中KMB17细胞上的生长特性分析，逐日观察个稀释度细胞出现CPE情况并记录病变孔数，直到不再有细胞病变为止；
6）根据Karber法计算病毒感染性滴度（lgCCID50/ml），重复检测3次后取均值；
实验结果：如图4所示，生长曲线的横坐标为培养时间，纵坐标为取样时间点对应的感染性滴度。KMB17细胞上的一步生长曲线可知，CVA6-KM-J33病毒株在72h可达到增值高峰，第四天后进入增值平台期并趋于稳定，其感染滴度达6.5CCID50/ml。
实施例5 柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33体内致病力检测
取1日龄SPF级Balb/c乳鼠，6只/组，经脑内途径注射不同剂量的CVA6-KM-J33病毒液，对照组乳鼠注射等剂量的PBS。连续观察18天，记录乳鼠的生长、发病及死亡情况，评价CVA6-KM-J33病毒株不同剂量下对乳鼠致病的严重程度。分别于感染后3、5、9天各处死3只感染乳鼠，取其各脏器组织进行病毒载量检测。对乳鼠的脑、肺、心组织进行组织病理学检查（HE染色）。
1、本实施例以脑内途径注射1日龄乳鼠，剂量组为104CCID50/只、105CCID50/只、106CCID50/只，对照组乳鼠等剂量的PBS，每组6只。乳鼠于注射后3~6天陆续开始发病，最晚发病时间为注射后的第6天。与对照组相比较，不同剂量组小鼠出现了不同程度的发病及死亡情况，发病症状表现如表2所示。
表2临床标准评分表
临床评分和死亡率结果如图5所示，CVA6-KM-J33克隆株扩增液以脑内注射途径对Balb/c乳鼠进行不同剂量（104CCID50/只、105CCID50/只、106CCID50/只）攻毒，高剂量组的乳鼠于3天发病，发病乳鼠症状表现为倦怠、后肢无力、单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，前后肢麻痹，最终至濒死或死亡，于攻毒后第6天全部死亡。而中、低剂量组的乳鼠发病时间较迟缓，发病乳鼠症状不加重且死亡率较低，尤其低剂量组乳鼠攻毒后10天症状逐渐好转，体重开始增长。
2、CVA6-KM-J33株病毒感染乳鼠脏器病毒载量检测
为研究CVA6-KM-J33株病毒不同剂量后不同阶段在乳鼠体内不同器官内的载量和分布，对脑内攻毒后3、5、9天检测病毒载量检测。
2.1滴度标准品制备：取已知滴度的CV-A6病毒(CVA6-KM-J33)（7.0lgCCID50/ml）。
2.2组织总RNA提取：脑内途径的不同剂量组分别于感染后3、5、9天各处死3只感染乳鼠，取其心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓、三叉神经、骨骼肌等充分研磨后取0.01g上述各组织研磨物分别置于1.5ml无菌离心管中，加入0.01M PBS至1ml，9000rpm 4℃离心10min，取离心后上清液用Trizol法提取病毒核酸，检测各组织中病毒载量。
2.3 qPCR体系及反应条件：按One-Step RT qPCR Kit（TAKARA/RR064）试剂盒说明操作，模板量均取4µl，于荧光定量PCR仪（Biorad，CFX-96）上进行一步法RT qPCR，反应总体系为25µl。根据标准曲线绝对定量样品中的病毒载量（CCID50/10mg）。qPCR探针与引物序列、反应程序和体系如下所示。
引物序列
CVA6-qP-F（SEQ ID No.7）:TACCACCGGGARAAACGTCCACG
CVA6-qP-R（SEQ ID No.8）：CGGTCAGYTGCAGTGTTAGT
探针（SEQ ID No.9）：5’-FAM-ACGTGAGAGCTTGGGTACMTAGACCCCTTC-BHQ-3’
反应体系：2X OnestepRT-PCRbufferⅢ12.5μl、ExTaqHS0.5μl、PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μl、RNase Free ddH2O5.5μl、Primer F/R各0.5μl、Probe1μl、模板4μl。
反应程序：425min；9510s；955s，6030s，39循环。
实验结果如图6所示：高剂量（106CCID50/只）组于感染后第3~9天内各器官中病毒载量呈明显上升趋势，第3天心、肝、脾、肾病毒载量均低于5.0lgCCID50/10mg；攻毒后第9天发病乳鼠心、脾、肺、脑、后肢肌、前肢肌病毒载量在6.0~8.5lgCCID50/10mg。中剂量（105CCID50/只）组于感染后第3~9天各器官中病毒载量呈上升趋势；第3天各脏器中病毒载量均增加；感染后第9天发病乳鼠的心脏和骨骼肌（前后肢肌）中病毒载量可达4.0~6.5lgCCID50/10mg，脑、骨骼肌（前后肢肌）中病毒载量高于其他器官中的病毒载量。低剂量（104CCID50/只）组感染后第3、5天成平缓上升趋势，第9天变化趋势不明显。
3、柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33免疫乳鼠后组织病理学检查
CVA6-KM-J33株免疫乳鼠组织病理学检查：观察乳鼠脑、肺组织病理，脏器于10%中性福尔马林固定48h后经石蜡包埋制作石蜡切片，用以进行HE染色。
CVA6-KM-J33株病毒经脑内途径，106CCID50/只剂量感染1日龄SPF级Balb/c乳鼠，于感染后第9天取发病乳鼠及对照组健康乳鼠的脑、肌肉（前肢、后肢）组织进行组织病理学检查。HE染色结果如图7所示，发现感染晚期，出现了全身多脏器的损伤和炎症反应，如炎细胞的围管浸润，组织充血及炎细胞聚集，这些病例改变随时间进展而呈逐渐加重的趋势。脑：病理学检查显示脑局部发生明显的病理变化，局部点灶性出血，局部脑膜及蛛网膜下充血、出血，大脑神经元细胞较少，轻度水肿，个别细胞核固缩。阴性对照脑组织切片并未发现明显的病理变化。肺：HE染色发现乳鼠感染CVA6-KM-J33会导致乳鼠发生病毒性肺炎，表现为充血，血管壁轻度变性，增厚；细胞增生，气管肺泡轻度扩张，内皮细胞坏死脱落，肺泡腔和部分细支气管见少量红细胞和脱落组织细胞，少量炎性细胞。阴性对照肺组织切片并为发现明显病理变化。
实施例6 CVA6-KM-J33病毒株免疫原性评价
为探究CVA6-KM-J33株病毒的免疫剂量，以及不同免疫途径对CVA6-KM-J33株病毒免疫效果的影响，设置肌肉、腹腔、皮内3种免疫途，接种剂量分别为：104CCID50／只、105CCID50／只、106CCID50／只的9种不同组合，免疫6周龄Balb/c小鼠。
血清抗体效价检测结果显示，初免后第7天9个实验组的小鼠中和抗体阳转率均低于50%（1:8作为疫苗效力评价阈值）；随着感染后天数增加，中剂量组和高剂量组小鼠血清中和抗体阳转率均有所上升，初免后第28天，肌肉低剂量组、腹腔低剂量组、皮内低剂量组、肌肉中剂量组的阳转率低于100%，其余实验组的阳转率均达到100%；第28天进行加强免疫，加强免疫后第7天除肌肉低剂量组、腹腔低剂量组、皮内低剂量组外，各实验组抗体阳转率均可升高达100%（图8）。
对数据进行统计学分析，结果发现不同剂量组的肌肉、腹腔、皮内途径免疫组数据差异无统计学意义（t=0.216，p=0.892），因此可将9个实验组数据进行合并分析。从免疫时间点来看，除低剂量组外，加强免疫后第7天小鼠抗体水平相较于初免后第28天均有明显的升高（图8）；从不同免疫途径来看，皮内、肌肉、皮内途径都产生了免疫效果，但肌肉和腹腔途径免疫效果更佳，免疫小鼠后抗体效价最高均为1:1024，皮内途径免疫小鼠抗体效价最高为1:256。（图8）。以上结果提示，中剂量组106CCID50／只、高剂量组107CCID50／只CVA6-KM-J33株病毒免疫原性均较好，CVA6-KM-J33株病毒经腹腔、肌肉途径免疫Balb/c小鼠后，能使小鼠血清中产生较高效价的抗体。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一株柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，保藏编号为CCTCC No.V202384。
2.根据权利要求1所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，其特征在于，所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1或2所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的繁殖和传代方法，其特征在于，包括以人二倍体细胞作为基质细胞进行繁殖和传代。
4.根据权利要求3所述繁殖和传代方法，其特征在于，所述人二倍体细胞包括人胚肺二倍体细胞KMB17。
5.根据权利要求4所述繁殖和传代方法，其特征在于，利用所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33感染人胚肺二倍体细胞KMB17后，于37℃ 5%CO2条件下培养。
6.利用权利要求1或2所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的基因组RNA制备得到的生物制剂。
7.根据权利要求6所述生物制剂，其特征在于，所述基因组RNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
8.一种抗柯萨奇病毒A6型毒株的抗血清，其特征在于，所述抗血清的制备方法，包括对动物注射权利要求1或2所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33，收集血清得到所述抗血清。
9.一种预防和/或治疗柯萨奇病毒A6型毒株所致疾病的疫苗或药物，其特征在于，活性成分包括权利要求6或7所述生物制剂，或权利要求8所述抗血清。
10.权利要求1或2所述柯萨奇病毒A6型CVA6-KM-J33的灭活毒株作为药物递送介质中的应用。
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