CN112280750A

CN112280750A - 具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用

Info

Publication number: CN112280750A
Application number: CN202011135976.1A
Authority: CN
Inventors: 唐熠; 刁有祥; 魏峰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112280750B

Abstract

本发明公开了一株具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用，该病毒已于2020年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：V202019。本发明提供的该新型鹅星状病毒，对目前流行的以雏鸭肾炎为主要病症的鹅星状病毒具有很好的免疫原性。以该新型鹅星状病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鹅星状病毒变异株提供完全保护。

Description

具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用

技术领域

本发明涉及禽星状病毒毒株的分离和应用领域，具体涉及一种具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用。

背景技术

星状病毒(AStV)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链RNA病毒。国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)根据病毒感染的宿主不同将星状病毒科(Astroviridae)划分成两个不同的病毒属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽星状病毒属(Avastrovirus)；其中，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。

2019年5月，我国山东、江苏等地雏鸭群爆发了一种以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于3～20日龄的雏鸭，病鸭以肾脏肿大出血、肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落为主要特征，死亡率最高可达40％，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

鉴于其为新发病，目前对该病的流行病学及致病机制等尚缺乏深入研究，也无有效的疫苗和药物进行预防和治疗，因此，从病原入手，进一步研究分子致病机理和病毒变异机理，开发相应疫苗是防控该传染性疾病的关键。鹅星状病毒的纯化培养一直是病毒及疫苗研究中的难点，能否获得适应体外细胞培养的疫苗株是疫苗研制和生产的关键所在。因此，急需研制一种安全高效能预防该新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

发明内容

针对上述现有技术，本发明从发病的雏鸭中分离得到一株具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒，并对该新型鹅星状病毒的细胞嗜性、致病性和免疫原性进行了考察，为新发的以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要特征的传染性疾病的防治提供了保障。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株鹅星状病毒，该病毒已于2020年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：V202019。

本发明的第二方面，提供上述鹅星状病毒在制备预防家禽肾炎的疫苗中的应用。所述家禽肾炎是由保藏编号为：CCTCC NO：V202019的新型鹅星状病毒引起的。

优选的，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗。

上述应用中，所述家禽为雏鸭或雏鹅。

本发明的第三方面，提供一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的灭活疫苗，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鹅星状病毒株病毒液；所述鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202019。

优选的，鹅星状病毒株病毒液由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒株接种到鸭胚肾细胞(DEK)中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鹅星状病毒株病毒液。

优选的，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

优选的，所述鹅星状病毒株病毒液中的病毒滴度为10^7.0-10^7.6TCID₅₀/0.1ml。

进一步的，所述防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗中还含有佐剂。

本发明的第四方面，提供上述灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒接种到DEK细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鹅星状病毒株病毒液；

(2)将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，乳化，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒具有跨种传播能力，而且对多种细胞具有嗜性，方便进行体外培养，而且，与其他种类的细胞相比，新型鹅星状病毒SDTA在DEK细胞上出现病变时间早，收获时间早，病毒含量高，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗的生产；对新发的以雏鸭肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要病症的传染性疾病具有很好的免疫原性。

(2)以保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，而且免疫保护持续时间长。

附图说明

图1：PCR鉴定结果；图中，M为2000bp Marker，泳道1为GoAStV，泳道2为GoAStV，泳道3为DAStV，泳道4为DHAV，泳道5为DRV，泳道6为TMUV，泳道7为DuCV，泳8为DPV，泳道9为空白对照。

图2：A为新型鹅星状病毒SDTA接种至LMH细胞56h后的图片；B为未接种病毒的对照细胞图片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×Es Taq MasterMix购于北京康为世纪有限公司，DL2000 Marker购于宝生物(大连)有限公司。

实施例1：鹅星状病毒毒株的分离和鉴定

1.流行病学调查：

自2019年5月以来，我国山东、江苏等地雏鸭群爆发了一种以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于3～20日龄的雏鸭，死亡率最高可达40％。对病死的雏鸭进行剖检，主要的病理变化如下：肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落。

2.病料采集与处理：

对山东泰安某鸭场的患病鸭的肾脏等病变脏器进行细菌检验。结果发现，患病鸭肾脏组织未检测到细菌，初步排除细菌感染的可能。

然后取患病雏鸭的肾脏组织，加入无菌PBS，研磨成匀浆，反复冻融3次，离心取上清液，上清液过滤除菌后，经绒毛尿囊膜接种鸭胚，37℃孵育，每天检查存活情况，连续观察5d，收集尿囊液、病变明显的尿囊膜和组织脏器并混匀。继续接种鸭胚，连续传代3次，取第三代尿囊液、尿囊膜及组织脏器混合液进行后续检测。

3.RT-PCR鉴定：

(1)RNA提取：将收集的混合液离心取上清液，按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用。

(2)反转录获得cDNA：所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TM RT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScriptRT Master Mix×2μL，从病毒液中提取的RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s，之后4℃保存。

(3)PCR扩增：

根据美国国家生物技术信息中心建立的基因序列数据库Genbank上所有星状病毒基因序列设计扩增489bp片段的特异性引物一对，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

上游引物：5′-ATTCTTGGCTCGGTTGTC-3′；(SEQ ID NO.1)

下游引物：5′-CCTGTGTTGCTCCTTCTC-3′。(SEQ ID NO.2)

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，52℃，30s，72℃，25s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

同时，利用已报道的特异性引物对常规鸭源病毒检测，包括：鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭星状病毒(DAStV)、鸭甲肝病毒(DHAV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭坦布苏病毒(TMUV)及鸭圆环病毒(DuCV)。

(4)琼脂糖凝胶电泳：

将PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果发现，采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值489bp大小相符的特异性条带，表明分离株的细胞培养物中存在新型水禽星状病毒。另外对分离株进行的常规鸭源病毒检测，包括：DRV、DAStV、DHAV、DPV、TMUV及DuCV，结果均为阴性，并未检测到其他病毒污染(图1)。表明分离株为星状病毒，命名为SDTA-001株。

4.病毒基因组的扩增及序列分析：

以获得的cDNA为模板，对分离毒株SDTA-001株的基因组进行分段扩增，扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果拼接后用Blast进行比对，同时与其他不同种属星状病毒进行同源性分析。

结果显示，SDTA-001株编码区包含ORF1a、ORF1b及ORF2三个开放性阅读框。将该分离株全基因组核苷酸序列和ORF2基因序列与GenBank上已发表的禽源星状病毒和哺乳动物星状病毒基因序列进行比对分析，结果发现，SDTA-001株ORF2基因序列(如SEQ ID NO.3所示)与鹅星状病毒的同源性均在95％以上。由此可以认定：分离株SDTA-001株为鹅星状病毒。

将该毒株命名为新型鹅星状病毒SDTA。并对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：新型鹅星状病毒SDTA

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉，武汉大学

保藏日期：2020年1月12日

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V202019。

实施例2：新型鹅星状病毒SDTA的特性考察

1.病毒的致病性：

1.1对雏鸭的致病性：将20只5日龄的健康雏鸭随机分为两组：实验组和对照组，实验组肌肉注射新型鹅星状病毒SDTA的病毒液，0.2ml/只；对照组注射等量的无菌生理盐水，观察各组雏鸭的临床表现，观察14日。

实验组的雏鸭在攻毒后第4日、第6日、第7日和第9日各死亡一只，死亡率达40％(4/10)。剖检病死雏鸭，可见肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落，内脏器官及关节腔表面尿酸盐沉积。

对照组雏鸭均健活，无任何临床表现，14日后剖检，未见任何病变。

1.2对雏鹅的致病性：将20只5日龄的健康雏鹅随机分为两组：实验组和对照组，实验组肌肉注射新型鹅星状病毒SDTA的病毒液，0.2ml/只；对照组注射等量的无菌生理盐水，观察各组雏鹅的临床表现，观察14日。

实验组的雏鹅在攻毒后第5日、第7日和第10日各死亡一只，死亡率达30％(3/10)。剖检病死雏鹅，可见肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生坏死、脱落，内脏器官及关节腔表面尿酸盐沉积。

对照组雏鹅均健活，无任何临床表现，14日后剖检，未见任何病变。

由此可见，本发明的新型鹅星状病毒SDTA具有跨种传播的能力。

2.病毒的免疫原性：

将新型鹅星状病毒SDTA制成活毒抗原和灭活抗原，分别免疫未接种疫苗的健康5日龄雏鸭，收集免疫后5d、10d、20d，攻毒后7d、12d的血清，采用间接ELISA法检测血清中的抗体。

结果表明：接种活毒抗原雏鸭的抗体水平低于接种灭活抗原的雏鸭；即灭活抗原比活毒抗原具有更好的免疫原性。

将新型鹅星状病毒SDTA制成的灭活疫苗接种成年雌性种鸭，经灭活抗原免疫后的种鸭所产子代均能够产生完全的攻毒保护，说明该新型鹅星状病毒SDTA毒株具有优异的免疫原性。

3.病毒的细胞嗜性：

为了确定新型鹅星状病毒SDTA的细胞嗜性，本研究运用细胞病变观察的方法检测新型鹅星状病毒SDTA在鸭胚肾细胞(DEK)、鸡肝癌细胞(LMH)等不同细胞上的增殖情况，具体如下：

3.1试验方法：

健康细胞形成致密单层后，弃掉生长液，接种新型鹅星状病毒SDTA并吸附1h，期间间隔晃动，保证病毒吸附均匀。加入与生长液等量、含2％新生牛血清的病毒维持液，期间不再更换新的培养液；同时设未接病毒的健康细胞作为对照。

置37℃培养箱中静置培养，每日观察并记录细胞病变情况，75％细胞出现病变时收获，通过冻融释放细胞内病毒，按Reed-Muench法计算病毒含量。

3.2试验结果：

(1)病变情况：

将新型鹅星状病毒SDTA接种至DEK细胞24h后形成明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、聚集、脱落呈现结网状病变，未接病毒的对照细胞正常。新型鹅星状病毒SDTA接种至LMH细胞，56h后形成明显的细胞病变(图2A)；未接病毒的对照细胞正常，未出现细胞病变(图2B)。

(2)病毒含量测定结果：

新型鹅星状病毒SDTA在不同细胞上增殖的病毒含量结果见表1。

表1：新型鹅星状病毒SDTA在不同细胞上增殖的病毒含量

细胞种类	TCID<sub>50</sub>
		DEK	10<sup>7.6</sup>
LMH	10<sup>4.5</sup>

鹅星状病毒的纯化培养一直是病毒及疫苗研究中的难点，能否获得适应体外细胞培养的疫苗株是疫苗研制和生产的关键所在。与现有报道的鹅星状病毒不同的是，本发明的新型鹅星状病毒SDTA具有广泛的细胞嗜性，能感染多种动物细胞并较好的增殖，同时产生明显的细胞病变。因此，本发明的新型鹅星状病毒SDTA可以作为优异的疫苗株。

而且，与其他种类的细胞相比，新型鹅星状病毒SDTA在DEK细胞上出现病变时间早，收获时间早，病毒含量高，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗的生产。

实施例3：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鹅星状病毒SDTA接种到生长良好的DEK细胞中，接种体积比为1：100；37℃吸附1h，然后用含2％新生牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO₂的条件下进行培养，至75％细胞出现病变时收获，获取细胞病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，离心收集上清液得到病毒液。计算TCID₅₀，每0.1ml病毒液中病毒含量为10^7.5TCID₅₀。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(TMUV)、鸭星状病毒(DAstV)、鸭甲型肝炎病毒(DHAV)等，并对种毒进行纯化。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油与司班-80(Span-80)按照94:6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝(Aluminum tristearate)，搅拌至淡黄色且澄清透明后,121℃高压蒸气灭菌备用。

②水相的准备：灭活完全的病毒液与无菌吐温-80(Tween-80)按照96:4的比例振荡混匀，使Tween-80彻底溶解。

③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

实施例4：灭活疫苗的质量检验

将实施例3制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例5：灭活疫苗的安全性检验

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例3制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况；

结果：试验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例6：灭活疫苗的保护性检验

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鹅腿部注射0.2mL新型鹅星状病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鹅的精神状况及死亡情况。

结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鹅星状病毒病的临床症状(肾炎和内脏器官尿酸盐沉积)，未有雏鸭死亡；对照组的雏鸭在攻毒后出现明显的临床症状(肾炎和内脏器官尿酸盐沉积)，死亡只数为3只，结果显示，本发明制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

实施例7：灭活疫苗的免疫持续期测定

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

结果发现，免疫组的抗体水平在第3天的时候开始显著升高，第7天达到高峰，此后45天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鹅提供快速、长期的免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attcttggct cggttgtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgtgttgc tccttctc 18

<210> 3

<211> 2115

<212> DNA

<213> ORF2基因

<400> 3

atggcagaca gggcggtggc cccgcgcgag aaggtgacca agaaggttac aaaagtagtc 60

accgttaaga aaaaacaccc aaagaagaaa ccaaagcaga aagtacataa accccaaaaa 120

ttacccatga aggccgagag gaagcttgag agagaagtga aaggtttgaa gaaaagagta 180

gctggaccac ccgttaatga caaaatgact accacgataa cacttggtca gatcactggg 240

aattcaacag acacactcga ccggaagcat aaatacttca caaatccact catgatgaaa 300

aaccaggaaa atgggcaaac agcaactcct ctaagtataa gggcctcaca atataacttg 360

tggaggatca gaaagctgca tatccgcctt gttccacttg ctggtagagc caatattctt 420

ggctcggttg tcttcctaga tatagaacag gaagctaaca cagctgggcc agagtccata 480

gataccataa aagctcggcc gcatcttgaa ctcccgattg gctcaaaaca tctttggagg 540

gttcaaccca ggctgatgca gggaccccgg caaggatggt ggaatgtaga ccccggggat 600

tcacccaccg actcacttgg tccagcaatc aatatgtgga catatttgaa aacagtaaat 660

gcactttcag cacgggcgca ggcacaacaa gttccctata cttctgccct cttcctggtt 720

gaagcaacgg tcacttatga gttctcgaac tatggtccaa agccagggct ctcactcatg 780

accagtgaaa cactttcagc atcagggaaa acggcaaccc ttgtaaatac ccaggatggt 840

gcacttgctt taacagttag tggcacattg cagagattcc tcgatgagaa ggagcaacac 900

aggcgcgtct caaatgcgca gacctctggt gtcggtgagg tgttttgggc tgtttccaca 960

gaagtggtcg agaccgtagc gagtgcactt ggaggctggg gttggctctt gaaaggagga 1020

tggttcgtga tcagaaaatt gtttggtgct gcttcaaatt ctggttccac ttatctgatc 1080

tattcctcag tttcagacgc ccagatagac agcaggattt atcagacagt tccaccgaac 1140

acgccactac agctggctgc aaaaacagtt aagcttgtac agctaacaca gccaaatgtg 1200

aatacaactg gacaaggtac cactgtcctt tcacgggatg ccgattacct gcctctgcca 1260

gtggcaccga tgcaggttac tccctcgctt gtgtacaact tccagggtga aaggcagagc 1320

actacagaat cgtgctcatt cctggtgttt ggaataccac aggcagaatc caggtcaaga 1380

tacaatgcaa atataacctt caatgttggc tatcgtggaa ggacttcaac atcatttaca 1440

cttggaacac acaattggtg ggctgttatg acactctcac aaacaggagt aatttttgca 1500

ccaccggctg tgggcacagg ggtctgtaat acattggcta cagccataca acacttaaac 1560

cctgagcttg aaacagcagt cctgcgtgtg aataccagta caacatctac tggtgggcta 1620

ataacggaac tcaggaatcg gctcaacatc gctgatgggg actatgtgat ttcaatgggt 1680

gatccgcaag gaaataggtc agcactgtac tttaggaatt cagaccagaa atgggtgtgg 1740

ctctgggctg gcgactctaa ccctggtgaa actttccaaa gttttaagat gccagtccta 1800

attaattggt cagtgtcaga ttcccaggaa caatataatg ctagagtcag gatggtacag 1860

tatgctaatg cacaacagca gactttgaca gaccctgagg aagatgatga tcccctctct 1920

gatgtcactt cgcttttcga tccaacagcg gaagatgaga ctgacttcca cctagcaggc 1980

tcgctcaaga cctctgacta cttaaaagaa gaggctgagt actggaaagc gaaggcgcag 2040

gccttgctta tggagaaggc actaagtgca ccacaagcag gggcagtccg ctttgagaag 2100

ggcggacatg agtga 2115

Claims

1.一株鹅星状病毒，其保藏编号为：CCTCC NO：V202019。

2.权利要求1所述的鹅星状病毒在制备防治雏鸭或雏鹅肾炎的灭活疫苗中的应用；所述雏鸭或雏鹅肾炎是由保藏编号为CCTCC NO：V202019鹅星状病毒引起的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

5.一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鹅星状病毒株病毒液；所述鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202019。

6.根据权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，鹅星状病毒株病毒液由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒株接种到鸭胚肾细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鹅星状病毒株病毒液。

7.根据权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

8.根据权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述鹅星状病毒株病毒液中的病毒滴度为10^7.0-10^7.6TCID₅₀/0.1ml。

9.根据权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗中还含有佐剂。

10.权利要求5-9任一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，乳化，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗。