CN108660116B - 一种导致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鹅星状病毒，该病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：V201808。本发明提供的该新型鹅星状病毒，对目前流行的以雏鹅痛风为主要病症的鹅星状病毒具有很好的免疫原性。以该新型鹅星状病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鹅星状病毒变异株提供完全保护。

Description

一种导致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒及其应用

技术领域

本发明涉及禽星状病毒毒株的分离和应用领域，具体涉及一种导致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒及其应用。

背景技术

星状病毒(AStV)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链RNA病毒，基因组具有感染性，长6.4-7.9kb，该病毒的感染具有一定的流行性，可引起人或动物的肠炎、腹泻，有的伴有呕吐和腹痛。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。

2017年2～12月，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5～20日龄的雏鹅，病鹅内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积，死亡率最高可达50％，给养鹅业造成了巨大的经济损失。

对于该传染性疾病的流行，目前尚无有效的疫苗和药物进行预防和治疗，因此，从病原入手，进一步研究分子致病机理和病毒变异机理，开发相应疫苗是防控该传染性疾病的关键。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种导致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒及其应用。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株鹅星状病毒，该病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：C CTCCNO：V201808。

本发明的第二方面，提供上述鹅星状病毒在制备预防雏鹅痛风的疫苗中的应用。所述雏鹅痛风是由保藏编号为：CCTCC NO：V201808的新型鹅星状病毒引起的。

优选的，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗。

本发明的第三方面，提供上述鹅星状病毒在制备治疗雏鹅痛风的卵黄抗体中的应用。所述雏鹅痛风是由保藏编号为：CCTCC NO：V201808的新型鹅星状病毒引起的。

本发明的有益效果：

本发明提供的鹅星状病毒N-AStV-SDPY株，对目前流行的以雏鹅痛风为主要病症的传染性疾病具有很好的免疫原性。以鹅星状病毒N-AStV-SDPY株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的鹅星状病毒变异株提供完全保护。

附图说明

图1：本发明的病毒分离株N-AStV-SDPY接种鹅胚病变：A正常生长状态下的鹅胚；B为SDPY分离株导致的鹅胚病变。

图2：PCR鉴定结果；图中，M为2000bp Marker，泳道1为空白对照，泳道2为AstV，泳道3为AstV，泳道4为AIV，泳道5为NDV，泳道6为ARV，泳道7为GPV，泳道8为GpoV，泳道9为GoCV。

图3：本发明的病毒分离株N-AStV-SDPY病毒基因组中ORF1a基因遗传进化分析。

图4：本发明的病毒分离株N-AStV-SDPY病毒基因组中ORF1b基因遗传进化分析。

图5：本发明的病毒分离株N-AStV-SDPY病毒基因组中ORF1c基因遗传进化分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，2017年起，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。目前尚无有效的疫苗和药物对该传染性疾病进行预防和治疗。

为了对该传染性疾病进行有效的防控，本发明从病原入手，从病死雏鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离出一株新型病毒N-AStV-SDPY，经鉴定该新型病毒N-AStV-SDPY为鹅星状病毒。目前已报道的星状病毒(如鹅星状病毒Castv-8)通常会导致发生肠炎等症状，但本发明分离的新型鹅星状病毒会导致鹅群发生痛风，其症状明显不同于现有的星状病毒。由于禽星状病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异，在遗传进化时容易发生变异。因此，本发明的新型鹅星状病毒可能发生了变异。本发明对毒株N-AStV-SDPY进行了全基因组测序，并与现有报道的星状病毒进行了同源性分析和遗传进化分析，结果发现，毒株N-AStV-SDPY各基因片段的同源性均小于70％；遗传进化分析表明，毒株N-AStV-SDPY处于一个变异分支；以上结果说明：毒株N-AStV-SDPY不同于其他的星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。

与现有的禽星状病毒相比，本发明的鹅星状病毒N-AStV-SDPY全基因组中的3个基因片段均发生了基因重组和突变，导致病毒发生变异，致病力发生改变，免疫原性增强，将其制成疫苗或药物，能够对当前爆发的以痛风为主要症状的鹅传染性疾病进行有效的防治。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1：鹅星状病毒毒株的分离和鉴定

1.材料与方法

1.1病料采集与处理：

取病死雏鹅肝脏、脾脏和肾脏等组织，按照1:4的比例加入无菌的生理盐水进行匀浆处理，将匀浆液置于冰箱反复冻融3次，6000r/min离心15min后取上清液，经0.22μm滤器过滤细菌后，-20℃保存备用。

1.2主要试剂：

鹅胚购于山东聊城某鹅场，RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×EsTaq MasterMix购于北京康为世纪有限公司，DL2000Marker购于宝生物(大连)有限公司。

1.3引物设计：

根据美国国家生物技术信息中心建立的基因序列数据库Genbank上所有星状病毒基因序列设计扩增601bp片段的特异性引物一对，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

上游引物：5′-TGG TGG TGY TTY CTC AAR A-3′；

下游引物：5′-GYC KGT CAT CMC CRT ARC A-3′。

注：Y、K、M、R为简并碱基。其中Y代表C/T；K代表G/T；M代表A/C；R代表A/G。

1.4病毒分离：

将获取的组织样品处理液经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2mL/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。每天照胚两次，弃掉24h内死亡鹅胚，连续观察6天。将死亡鹅胚置4℃过夜处理后无菌收取尿囊液，并观察胚体变化。组织处理液盲传三代进行后续检测。

1.5 PCR鉴定：

1.5.1 RNA提取：

将1.4中收获的病毒液按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用。

1.5.2反转录获得cDNA：

所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TMRT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScript RT MasterMix×2μL，步骤1.5.1中提取的待测样品Total RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后，4℃保存。

1.5.3 PCR扩增：

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，68℃，30s，72℃，45s进行30个循环，72℃，10min；之后4℃保存备用。

2.结果：

2.1病毒分离：

采集的阳性肝脏、肾脏混合组织匀浆经过处理，经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2mL/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。在接种鹅胚2-5天出现了鹅胚死亡(见图1)，同批次空白对照鹅胚正常。

2.2 PCR鉴定结果：

用引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值601bp大小相符的特异性条带(图2)。表明分离株的细胞培养物中存在新型星状病毒(AstV)。另外对分离株进行的常规鹅源病毒检测，包括：禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、呼肠孤病毒(ARV)、鹅细小病毒(GPV)、鹅多瘤病毒(GpoV)及鹅圆环病毒(GoCV)，并未检测到其他病毒污染(图2)。

最终分离得到一株稳定的毒株，将该毒株命名为N-AStV-SDPY。采用二代测序技术对毒株N-AStV-SDPY进行全基因组序列测定，全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。然后与现有技术中已公布的星状病毒进行同源性比对和遗传进化分析。其中，毒株N-AStV-SDPY的ORF1a基因遗传进化分析如图3所示，结果表明，N-AStV-SDPY株与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)和鸭肝3型(DHV-3)处于同一个大的进化分支上，但N-AStV-SDPY株单独属于一个变异小分支上；与鸡源星状病毒、鸭肝病毒2型、鸭星状病毒CPH株、YP2株及火鸡星状病毒1型(TAstV-1)处于不同的进化分支；与同样能引起肠炎的鹅星状病毒(GAstV)的亲缘关系较远，核苷酸同源性仅为57.3％。同源性分析表明，该分离株N-AStV-SDPY与其他分离株核苷酸同源性为48.8％-63.9％，同源性较低。

毒株N-AStV-SDPY的ORF1b基因遗传进化分析如图4所示。在不同AStV中，ORF1b基因长度差异较小，并且其编码的RdRp蛋白在AStV蛋白中最保守。图4表明，N-AStV-SDPY株与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)和鸭肝3型(DHV-3)处于同一个大的进化分支上，但自己单独属于一个变异小分支上；与鸡源星状病毒、鸭肝病毒2型、鸭星状病毒CPH株、YP2株及火鸡星状病毒1型(TAstV-1)处于不同的进化分支；与同样能引起肠炎的鹅星状病毒(GAstV)的亲缘关系较远，核苷酸同源性仅为61.1％。同源性分析表明，该分离株N-AStV-SDPY与其他分离株核苷酸同源性为58.5％-67.7％，同源性较低。

毒株N-AStV-SDPY的ORF1c基因遗传进化分析如图5所示。图5表明，N-AStV-SDPY株与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)和鸭肝2型(DHV-2)处于同一个大的进化分支上，但自己单独属于一个变异小分支上；与鸡源星状病毒、鸭肝病毒3型、鸭星状病毒CPH株、YP2株及火鸡星状病毒1型(TAstV-2)处于不同的进化分支；与同样能引起肠炎的鹅星状病毒(GAstV)的亲缘关系较远，核苷酸同源性仅为49.0％。同源性分析表明，该分离株N-AStV-SDPY与其他分离株核苷酸同源性为42.7％-62.8％，同源性较低。

综上，毒株N-AStV-SDPY各基因片段同源性均小于70％，最低为42.7％；遗传进化分析表明，N-AStV-SDPY分离株处于一个变异分支，但是与火鸡源分离株处于同一大分支，且与其同源性较高，均在60％以上。

将分离得到的毒株N-AStV-SDPY鉴定为鹅星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。并对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：鹅星状病毒

分类命名：鹅星状病毒N-AStV-SDPY株

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉，武汉大学

保藏日期：2018年4月26日

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V201808。

实施例2：动物回归试验

将无新型鹅星状病毒感染的60只1日龄雏鹅平均分为两组，一组为对照组，另一组为实验组，每组30只。实验组雏鹅5日龄皮下接种病毒液0.2mL，对照组相同方式接种无菌生理盐水0.2mL，实验组与对照组隔离饲养，同时每天记录雏鹅死亡情况，并对死亡雏鹅进行剖检观察。

结果：雏鹅接种后第1天，便开始出现精神沉郁等症状。在接种后第7-10天，雏鹅死亡达到亡高峰期，死亡率为50％，在雏鹅表现出角弓反张等神经症状后便立即死亡。对死亡雏鹅进行剖检，结果表明，死亡雏鹅出现不同程度的肝脏、心脏、腺胃、肾脏与输尿管等内脏器官的尿酸盐沉积现象，同时，肾脏肿胀、出血，与自然感染病例的剖检变化相同。在进行动物试验期间，对照组雏鹅没有出现死亡。

实施例3：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鹅星状病毒N-AStV-SDPY接种到生长良好的鹅胚肾细胞(GKC)中，对该病毒进行大量增殖，获取足够的病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，收取细胞病毒液。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)等，并对种毒进行纯化。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油、硬脂酸铝(Aluminum tristearate)、司班-80(Span-80)按94：2：6混合，搅拌混匀后，高温高压灭菌。

②水相的准备：将灭活的抗原液加入吐温-80(Tween-80)，振荡混匀，使Tween-80彻底溶解，水相中Tween-80的终浓度为2-4％。

③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

实施例4：灭活疫苗的质量检验

将实施例3制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例5：灭活疫苗的安全性检验

取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果：实验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例6：灭活疫苗的保护性检验

取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组30只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鹅腿部注射0.2mL新型鹅星状病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鹅的精神状况及死亡情况。

结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鹅星状病毒病的临床症状，未有雏鹅死亡；对照组的雏鹅在攻毒后出现明显的临床症状(痛风)，死亡只数为5只，结果显示，本发明制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

实施例7：灭活疫苗的免疫持续期测定

取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

结果发现，免疫组的抗体水平在第5天的时候开始显著升高，第10天达到高峰，此后30天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鹅提供快速、长期的免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种导致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7252

<212> DNA

<213> 鹅星状病毒（Goose astrovirus）

<400> 1

tgtagcctct gtgttttcgc ttcctgcgca tcaaggcacg ccttctcacc caaattcata 60

aggtttgcac caatatcggg tgaccatgtt ggtttggtga catcatcggc gaaaaagaga 120

ccatacctcc cattgtcaac cccttttcct cacttgacac tcgtgaggaa aggaagactg 180

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attggtttct ttaaggatct tgtgcgaaaa tgcacccaat agtgttagag agtttcttga 4800

taaacaaatc aacacggttg aggagcacgc tgccagtgaa aatattaact tacctgaggt 4860

cgggcccgac ttcttttctc aaatctggtg agtggcggac cgaaataaaa tggcagacag 4920

ggcggtggcc ccgcgcgaga aggtgaccaa gaaggttaca aaagtagtca ccgttaagaa 4980

aaaacaccca aaaaagaaac caaagcagaa agtatataag ccccaaaaat tacccatgaa 5040

ggccgagagg aagcttgaga aagaagtgaa aggtttgaag aaaagagtag ctggaccacc 5100

cgttaatgac aaaatgacta ccacgataac acttggtcag atcactggga attcaacaga 5160

cacactcgac cggaagcata aatacttcac aaatccactc atgatgaaaa accaggaaaa 5220

tgggcaaaca gcaactcctc taagtataag ggcctcacaa tataacttgt ggaggatcag 5280

aaagctgcat atccgccttg ttccacttgc tggtagggcc aatattcttg gctcggttgt 5340

cttcctagat atagaacagg aagctaacac agctgggcca gagtccatag ataccataaa 5400

agctcggccg catcttgaac tcccgattgg ctcaaaacat ctttggaggg ttcaacccag 5460

gctgatgcag ggaccccggc aaggatggtg gaatgtagac cccggggatt cacctactga 5520

ctcacttggt ccagcaatca atatgtggac atatttgaaa acagtaaatg cactttcaac 5580

acgggcgcag gcacaacaag ttccctatac ttctgccctc ttcctggttg aagcaacggt 5640

cacttatgag ttctcgaact atggtccaaa gccagggctc tcactcatga ccagtgaaac 5700

actttcagca tcagggaaaa cggcaaccct tgtaaatacc caggatggtg cacttgcttt 5760

aacagttagt ggcgcattgc agagattcct cgatgagaag gagcaacaca ggcgcgtttc 5820

aaatgcgcag acctctggtg tcggtgaggt gttttgggct gtttccacag aggtggtcga 5880

gaccgtagcg agtgcacttg gaggctgggg ttggctcttg aaaggaggat ggttcgtgat 5940

cagaaaattg tttggtgctg cttcaaattc tggttccact tatctgatct attcctcagt 6000

ttcagacgcc cagatagaca gcaggattta tcagacagtt ccaccgaaca cgccactaca 6060

gctggctgca aatacagtta agcttgtaca gctaacacag ccaaatgtga atacaactgg 6120

acaaggtacc actgtccttt cacgggatgc cgattacctg cctctgccag tggcaccaat 6180

gcaggttact ccctcgcttg tgtacaactt ccagggtgaa aggcagagca ctacagaatc 6240

gtgctcattc ctggtgtttg gaataccaca ggcagaatcc aggtcaagat acaatgcaaa 6300

tataaccttc aatgttggct atcgtggaag gacttcaaca tcatttacac ttggaacaca 6360

caattggtgg gctgttatga cactttcaca aacaggagta atttttgcac caccggctgt 6420

gggcacaggg gtctgtaata cattggctac agccatacaa cacttaaacc ctgagcttga 6480

aacagcagtc ctgcgtgtga ataccagtac aacatctact ggtgggctaa taacggaact 6540

caggaatcgg ctcaacatcg ctgatgggga ctatgtgatt tcaatgggtg atccgcaagg 6600

aaataggtca gcactgtact ttaggaattc agaccagaaa tgggtgtggc tctgggctgg 6660

cgactctaac cctggtgaaa ctttccaaag ttttaagatg ccagtcctaa ttaattggtc 6720

agtgtcagat tcccaggaac aatataatgc tagagtcagg atggtacagt atgctaatgc 6780

acaacagcag actttgacag accctgagga agatgatgat cccctctctg atgtcacttc 6840

gctttttgat ccaacagcgg aagatgagac tgacttccac ctagcagtct cactcaagac 6900

ctctgactac ttaaaagaag aggctgagta ctggaaagcg aaggcgcagg ccttgcttat 6960

ggagaaggca ctaagtgcac cacaagcagg gacagtccgc tttgagaagg gcggacatga 7020

gtgatctctt cactagcagc cgcggccacg ccgagtagga tcgagggtac agctgcacct 7080

tctcattagg cttgagggag aatcggccct ctctgcctta aattaacccg gtgacagtca 7140

ggtggtcacc cacacaaatc gcgtgcgggt acccctgacc gggtttttgt ttaaagaatc 7200

aaatgtgatt tttaagcatt taaaatcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7252

Claims (4)

1.一株鹅星状病毒，其保藏编号为：CCTCC NO：V201808。

2.权利要求1所述的鹅星状病毒在制备预防雏鹅痛风的疫苗中的应用；所述雏鹅痛风是由保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒感染引起的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗或减毒活疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

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