CN111000993A - 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内水禽疫病中鸭呼肠孤病毒与鸭肝炎病毒混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，即利用分离到的国内流行毒株鸭呼肠孤病毒17117株和鸭肝炎病毒1型16115株、3型16023株作为疫苗制备用毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成，该疫苗的应用能做到一次免疫同时有效预防目前流行1型、3型鸭病毒性肝炎和鸭呼肠孤病毒病。

Description

一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸭病毒性肝炎，是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征，具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病。该病一年四季均可发生，自然暴发时仅发生于雏鸭，对养殖业造成了巨大经济损失。传统的鸭肝炎病毒有三个血清型，分别引起1型、2型和3型鸭肝炎。近年来，由于免疫压力等因素，血清1型鸭肝炎病毒呈现出新的流行态势。中国台湾地区和韩国的学者陆续分离出了与1型鸭肝炎病毒基因组结构相近的典型小RNA病毒，称中国台湾新型和韩国新型，均不与DHV-1产生交叉中和反应，为避免混淆，已将鸭肝炎病毒改称为鸭甲肝病毒(DHAV)，分为血清1型(DHAV-1)、中国台湾新型(DHAV-2) 和韩国新型(DHAV-3)。传统的DHV血清2型和3型分别归类为鸭星状病毒DAstV-1型和 DAstV-2型。近两年来，山东各地发生多起种鸭不明原因产蛋下降，发病日龄为300～500日龄。主要临床症状为发病鸭体温一过性升高，产蛋每天下降1％～2％，全场发病持续约3～4个月，产蛋下降最高为20％～40％，发病后期可见部分鸭主翼羽脱落，自然换羽。剖检病死鸭可见肝脏肿大，卵泡萎缩变形，个别有腹膜炎。病原分离鉴定获得了1型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒，将这两种病毒进行种鸭回归试验，可引起种鸭产蛋下降，剖检肝脏肿大，卵泡萎缩变形。
禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属中的一员，基因组为分节段双链RNA，有10个节段，常见于鸡、火鸡、鸭、鹅及一些鸟类等宿主体内，以病毒性关节炎、肠道病、腱鞘炎、矮小综合征、免疫抑制性疾病及吸收不良综合征等为临床特征。2005年上半年，我国山东、福建、江苏、河北、河南等地饲养的樱桃谷肉鸭，相继发生了一种以脾脏坏死为主要病变的疾病，俗称“脾坏死病”。2011年下半年，在山东、河北、江苏等地樱桃谷肉鸭也发生一种以肝脏不规则坏死或混杂出血斑为特征剖检病变的疾病。2015年以来，山东、江苏、河北等樱桃谷鸭饲养密集区的许多鸭群又发生了以脾脏出血、白色坏死灶或大理石样硬化病变的疾病，病鸭可见肺、心肌、肾、腺胃和肠粘膜等组织出血等病变。种鸭可见跗关节肿大，内有黄色或血样渗出物，严重者关节腔内有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度跛行，给养鸭业造成严重经济损失。病原分离鉴定为鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus，DRV)。该病毒与鸡源呼肠孤病毒、番鸭源呼肠孤病毒进行遗传进化分析，属于不同分支，为一种新型鸭呼肠孤病毒。
发明内容
本发明目的是通过自行分离的一株新型鸭呼肠孤病毒和2株鸭肝炎病毒(血清1型和3型)，提供一种可同时预防鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎的疫苗，一次免疫可预防两种疾病。
本发明的技术方案：
1.本发明所述一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征与该疫苗中含有灭活的鸭呼肠孤病毒和血清1、3型鸭肝炎病毒；
所述的鸭呼肠孤病毒为鸭呼肠孤病毒17117株、血清1型鸭肝炎病毒为鸭肝炎病毒16115 株和血清3型鸭肝炎病毒为鸭肝炎病毒16023株，以上三株病毒已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.18889、CGMCC No.18885和CGMCCNo.18973。保藏日期均为2019年12月27日。
2.本发明所述一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法是用血清1型、3型鸭肝炎病毒接种鸭胚或鸡胚进行病毒繁殖，鸭呼肠孤病毒接种鸡胚或BHK细胞、Vero细胞、LMH细胞、DF-1细胞进行病毒繁殖，病毒液经灭活和浓缩；灭活和浓缩的血清1型鸭肝炎病毒、血清3型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒液按1:1:1的体积比混合制备成水相，再按常规方法制备成灭活佐剂疫苗。
3.本发明所述一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于该二联灭活疫苗抗原的质量标准为：血清1型鸭肝炎病毒接种鸭胚或鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5ELD50/ml；血清3型鸭肝炎病毒接种鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.0ELD50/ml, 接种鸭胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5ELD50/ml；鸭呼肠孤病毒接种鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.0ELD50/ml；鸭呼肠孤病毒可接种BHK细胞或Vero细胞或LMH细胞或DF-1细胞进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5TCID50/ml。
4.本发明所述的一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于用该二联灭活疫苗给种鸭接种有效剂量的能使免疫种鸭和被动免疫雏鸭对鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒流行株产生有效保护。
本发明的积极意义
本发明涉及一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内水禽疫病中鸭呼肠孤病毒与鸭肝炎病毒混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用鸭呼肠孤病毒17117株和鸭肝炎病毒1型 16115株、3型16023株作为疫苗制备用毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明涉及到的鸭呼肠孤病毒株、鸭肝炎病毒株均为国内流行毒株，能够有效预防目前流行疾病。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的鸭肝炎病毒1型16115株、鸭肝炎病毒3型16023株和鸭呼肠孤病毒17117 株，均由本发明人从发病种鸭中分离，经过纯化、鉴定，保管备用，以上三株病毒已于2019 年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.18889、CGMCCNo.18885 和CGMCC No.18973。
具体实施方式
1.病毒来源
(1)生产用毒株鸭肝炎病毒1型16115株和鸭肝炎病毒3型16023株，由本发明人从产蛋期发病种鸭中分离，经过纯化、鉴定，保管备用。
(2)生产用毒株鸭呼肠孤病毒17117株，由本发明人从发病雏鸭中分离，经过纯化、鉴定，保管备用。
2.毒力
鸭肝炎病毒1型16115株 将毒种用灭菌生理盐水稀释10倍，肌肉注射接种1日龄易感鸭10只，0.2ml/只，接种后观察7日，至少有8只死亡。
鸭肝炎病毒3型16023株 将毒种用灭菌生理盐水稀释10倍，肌肉注射接种1日龄易感鸭10只，0.2ml/只，接种后观察7日，至少有9只死亡。
鸭呼肠孤病毒17117株，将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍，肌肉注射接种1日龄易感鸭10只，0.2ml/只，接种后观察7日，至少有9只发病。剖检发病鸭可见脾脏出血，有白色坏死灶或大理石样硬化病变。
3.免疫原性
1)鸭肝炎病毒1型16115株 取7日龄易感鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.2ml，免疫后21日，采集血清，检测中和抗体效价，几何平均滴度≥5log2，免疫原性良好。
2)鸭肝炎病毒3型16023株 取7日龄易感鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.2ml，免疫后21日，采集血清，检测中和抗体效价，几何平均滴度≥5log2，免疫原性良好。
3)鸭呼肠孤病毒17117株 取7日龄易感鸭15只，其中10只各颈部皮下注射疫苗0.2ml，另5只不接种作为对照。免疫后21日，各肌肉注射接种强毒17117株。7日后，取脾脏进行病毒分离。免疫鸭至少7只病毒分离阴性，攻毒对照鸭至少4只病毒分离阳性。
4.鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗的制备
1)鸭肝炎病毒1型16115株生产用毒种制备 将毒种用灭菌生理盐水稀释50～100倍，尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，37℃孵育，收获36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，分装，备用。
2)鸭肝炎病毒3型16023株生产用毒种制备 将毒种用灭菌生理盐水稀释50～100倍，卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，37℃孵育，收获36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，分装，备用。
3)鸭呼肠孤病毒17117株生产用毒种制备
(1)用6～7日龄SPF鸡胚作为病毒繁殖用材料 将毒种用灭菌生理盐水稀释50～100 倍，卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，37℃孵育，收获36～120小时内死亡鸡胚尿囊液及羊水，混合后分装，备用。
(2)用BHK细胞作为病毒繁殖用材料 将毒种按0.1％细胞维持液的量接种到BHK细胞上，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞病变达80％左右时，冻融收获毒液，分装，备用。
(3)用Vero细胞作为病毒繁殖用材料 将毒种按0.1％细胞维持液的量接种到Vero细胞上，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞病变达80％左右时，冻融收获毒液，分装，备用。
(4)用LMH细胞作为病毒繁殖用材料 将毒种按0.1％细胞维持液的量接种到LMH细胞上，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞病变达80％左右时，冻融收获毒液，分装，备用。
(5)用DF-1细胞作为病毒繁殖用材料 将毒种按0.1％细胞维持液的量接种到DF-1细胞上，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞病变达80％左右时，冻融收获毒液，分装，备用。
4)鸭肝炎病毒1型16115株制苗用病毒液制备 将生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，尿囊腔接种9～10日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每日照胚1次，将36小时内死亡鸡胚弃去。以后每日照胚1～2次，死亡鸡胚随时取出，置2～8℃保存。收获接种后36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量。同时按中华人民共和国兽药典(2015年版)(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典2015年版，中国农业出版社，2016.9，本发明以下称《中国兽药典》)规定的方法进行无菌检验，应无菌生长。
5)鸭肝炎病毒3型16023株制苗用病毒液制备 将生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，37℃孵育，不必翻蛋。鸭胚接种后，每日照胚1次，将36小时内死亡鸭胚弃去。以后每日照胚1～2次，死亡鸭胚随时取出，置2～ 8℃保存。收获接种后36～96小时内死亡鸭胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量。同时按《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验，应无菌生长。
3)鸭呼肠孤病毒17117株制苗用病毒液制备
(1)用6～7日龄易感鸡胚作为病毒繁殖用材料 将生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，卵黄囊接种6～7日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每日照胚1次，将36小时内死亡鸡胚弃去。以后每日照胚1～2次，死亡鸡胚随时取出，置2～8℃保存。收获接种后36～120小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量。同时按《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验，应无菌生长。
(2)用微载体培养细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料 在灭菌的微载体和生物反应器内加入细胞培养液，接种制苗用细胞进行悬浮培养，待微载体上的细胞形成致密单层后，接种鸭呼肠孤病毒17117株，继续培养。培养过程中每天按时取样观察细胞病变情况，待细胞病变达80％以上时，收获病毒液，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量。同时按《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验，应无菌生长。制苗用细胞为BHK细胞、Vero细胞、LMH细胞和 DF-1细胞。
(3)用纯悬浮培养BHK细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料 在灭菌生物反应器内加入细胞培养液，接种BHK细胞进行悬浮培养，待细胞密度达到2×106/ml，细胞活力在90％以上时，接种鸭呼肠孤病毒17117株，继续培养。培养过程中每天按时取样观察细胞活力变化情况，待细胞活力下降到50％以下时，收获全悬浮病毒液，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量。同时按《中国兽药典》规定的方法进行无菌检验，应无菌生长。
4)病毒液灭活
向检验合格的病毒液中加入甲醛溶液，一边加一边搅拌，使其最终浓度为0.1％，混匀后37℃进行灭活。灭活后病毒液于2～8℃保存，应不超过1个月。
5)油乳剂灭活疫苗制备
(1)水相制备 取灭菌吐温-80 4份，加入灭活胚液96份(血清1型鸭肝炎病毒、血清3型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒液按1∶1∶1比例混合)，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
(2)油相制备 取优质注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌30min，置室温下保存备用。
(3)乳化 取油相2份放于胶体磨或乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌2～5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。
6)半成品检验
(1)鸭肝炎病毒1型16115株病毒液
病毒含量测定 将灭活前处理的病毒液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别经尿囊腔内接种9～10日龄易感鸡胚或SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚接种0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察7日。弃去24小时内死亡鸡胚，统计24～168小时内死胚，计算ELD50，病毒含量≥108.5ELD50/ml的病毒液，方可用于制苗。
无菌检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。
灭活检验 取9～10日龄易感鸡胚或SPF鸡胚5个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚接种 0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。收获存活鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜，混合研磨再盲传一代，仍不出现特异性死亡，认为灭活完全。
(2)鸭肝炎病毒3型16023株病毒液
病毒含量测定 将灭活前处理的病毒液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别经尿囊腔内接种10～11日龄易感鸭胚，每个稀释度接种5枚，每胚接种0.1ml，置36～ 37℃继续孵育，每日照胚2次，观察7日。弃去24小时内死亡鸭胚，统计24～168小时内死胚，计算ELD50，病毒含量≥108.5ELD50/ml的病毒液，方可用于制苗。
无菌检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。
灭活检验 取10～11日龄易感鸭胚5个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚接种0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸭胚非特异性死亡应不超过1个。收获存活鸭胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜，混合研磨再盲传一代，仍不出现特异性死亡，认为灭活完全。
(3)鸭呼肠孤病毒17117株病毒液
鸡胚培养毒液病毒含量测定 将灭活前处理的病毒液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别经卵黄囊内接种6～7日龄易感鸡胚或SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚接种0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察7日。弃去24小时内死亡鸡胚，统计24～168小时内死胚，计算ELD50，病毒含量≥108.0ELD50/ml的病毒液，方可用于制苗。
细胞培养毒液病毒含量测定 将灭活前处理的病毒液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，分别接种长成良好单层的制苗用细胞，每个稀释度接种4孔，每孔接种0.1ml，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，观察7日，统计细胞病变情况，计算TCID50，病毒含量≥108.5TCID50/ml的病毒液，方可用于制苗。
无菌检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。
灭活检验 取6～7日龄易感鸡胚或SPF鸡胚5个，卵黄囊内接种灭活病毒液，每胚接种 0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。收获存活鸡胚胚液，再盲传一代，仍不出现特异性死亡，认为灭活完全。
7)成品检验
(1)性状
外观 应为乳白色乳剂
剂型 油包水型。取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相应不多于0.5ml。
黏度 按《中国兽药典》规定方法进行检验，应符合规定。
(2)无菌检验
按《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。
(3)安全检验
用1～2周龄易感鸭10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。
(4)效力检验
鸭病毒性肝炎部分 取1～2周龄易感鸭10只，每只颈背部皮下注射疫苗0.3ml，同时设条件相同的鸭5只不免疫作为对照。免疫后21日，采集血清，分别测定鸭病毒性肝炎1型和 3型中和抗体效价。免疫组抗体效价均应不低于1∶32，对照组均应为阴性。
鸭呼肠孤病毒部分 取1～2周龄易感鸭10只，每只颈背部皮下注射疫苗0.3ml，同时设条件相同的鸭5只不免疫作为对照。免疫后21日，所有试验鸭攻击新型鸭呼肠孤病毒强毒， 0.3ml/只。攻毒后7日剖检，取脾脏进行病毒分离。免疫鸭至少7/10只病毒分离阴性，攻毒对照鸭至少4/5病毒分离阳性。
(5)甲醛、汞类防腐剂残留量测定
按《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
实施例
以下实施例是为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——3型鸭肝炎病毒的分离鉴定
病料处理 从发生产蛋下降的种鸭群中采集发病鸭的肝脏和卵泡组织，剪取肝脏和卵泡膜，按1:3比例加入灭菌生理盐水，研磨制成组织悬液，冻融，12000r/min离心5min。收集上清液，过滤除菌，备用。
病料接种 将上述滤液经尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚5枚，0.2ml/胚，置37℃继续孵化。弃去24h内死亡鸭胚，以后每日照胚2次，连续观察至第5日，无菌收获24～120小时死亡鸭胚尿囊液，并观察鸭胚病变。收集的尿囊液毒，低温冷冻保存。
病毒鉴定 取病毒液按照常规方法提取病毒总RNA，反转录合成cDNA，使用引物DHV-3-F/DHV-3-R进行扩增，对扩增产物进行序列测定分析，结果显示分离病毒为鸭肝炎病毒3型。
DHV-3-F:5’-gccaatacaa ggggagtcgc-3’20(序列1)
DHV-3-R:5’-cgaaatgggc gatggttgcg-3’20(序列2)
分离毒纯净性检验：按《中国兽药典》规定方法对分离毒进行无菌和支原体检验，结果均无菌生长、无支原体生长。
分离毒外源病毒检验：取分离毒液分别按常规方法提取RNA和DNA，通过RT-PCR或PCR 检测鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、1型鸭肝炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒，结果均为阴性。取分离毒液，按《中国兽药典》规定方法进行血凝试验，结果病毒无血凝活性。
分离毒毒力鉴定 取DHV-3病毒液，肌肉注射接种产蛋高峰期易感产蛋鸭10只，0.5ml/ 只，同时设条件相同的不接种产蛋鸭10只，肌肉注射无菌生理盐水作为空白对照。统计接种后14日内各组产蛋率，结果空白对照鸭产蛋无明显下降，接种DHV-3病毒液的产蛋鸭产蛋下降40.6％。
实施例2——1型鸭肝炎病毒的分离鉴定
病料处理 从发生产蛋下降的种鸭群中采集发病鸭的肝脏和卵泡组织，剪取肝脏和卵泡膜，按1:3比例加入灭菌生理盐水，研磨制成组织悬液，冻融，12000r/min离心5min。收集上清液，过滤除菌，备用。
病料接种 将上述滤液经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/胚，置37℃继续孵化。弃去24h内死亡鸭胚，以后每日照胚2次，连续观察至第5日，无菌收获24～120小时死亡鸡胚尿囊液，并观察鸡胚病变。收集的尿囊液毒，低温冷冻保存。
病毒鉴定 取病毒液按照常规方法提取病毒总RNA，反转录合成cDNA，使用引物DHV-1-F/DHV-3-R进行扩增，对扩增产物进行序列测定分析，结果显示分离病毒为鸭肝炎病毒1型。
DHV-1-F:5’-acaggagcca agggttat-3’18(序列3)
DHV-1-R:5’-gccaggtggt tgatgtaa-3’18(序列4)
分离毒纯净性检验：按《中国兽药典》规定方法对分离毒进行无菌和支原体检验，结果均无菌生长、无支原体生长。
分离毒外源病毒检验：取分离毒液分别按常规方法提取RNA和DNA，通过RT-PCR或PCR 检测鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、3型鸭肝炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒，结果均为阴性。取分离毒液，按《中国兽药典》规定方法进行血凝试验，结果病毒无血凝活性。
分离毒毒力鉴定 取DHV-1病毒液，肌肉注射接种产蛋高峰期易感产蛋鸭10只，0.5ml/ 只，同时设条件相同的不接种产蛋鸭10只，肌肉注射无菌生理盐水作为空白对照。统计接种后14日内各组产蛋率，结果空白对照鸭产蛋无明显下降，接种DHV-3病毒液的产蛋鸭产蛋下降37.3％。
实施例3——新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定
病料处理 从发生脾脏坏死的樱桃谷种鸭群中采集发病鸭的脾脏组织，剪碎，按1:3比例加入灭菌生理盐水，研磨制成组织悬液，冻融，12000r/min离心5min。收集上清液，过滤除菌，备用。
病料接种 将上述滤液经卵黄囊接种6～7日龄易感鸡胚5枚，0.2ml/胚，置37℃继续孵化。弃去24h内死亡鸭胚，以后每日照胚2次，连续观察至第5日，无菌收获24～120小时死亡鸡胚尿囊液，并观察鸡胚病变。收集的尿囊液毒，低温冷冻保存。
病毒鉴定 取病毒液按照常规方法提取病毒总RNA，反转录合成cDNA，使用引物DRV-F/DRV-R进行扩增，对扩增产物进行序列测定分析，结果显示分离病毒为新型鸭呼肠孤病毒。
DRV-F:5’-gttatcaggg tcggcaacgc tta-3’23(序列5)
DRV-R:5’-tgcgattgac tcagtttcag cgata-3’25(序列6)
分离毒纯净性检验：按《中国兽药典》规定方法对分离毒进行无菌和支原体检验，结果均无菌生长、无支原体生长。
分离毒外源病毒检验：取分离毒液分别按常规方法提取RNA和DNA，通过RT-PCR或PCR 检测鸭坦布苏病毒、1型鸭肝炎病毒、3型鸭肝炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒，结果均为阴性。取分离毒液，按《中国兽药典》规定方法进行血凝试验，结果病毒无血凝活性。
分离毒毒力鉴定取新型DRV病毒液，肌肉注射接种1日龄易感雏鸭10只，0.3ml/只，同时设条件相同的雏鸭10只，肌肉注射无菌生理盐水作为空白对照。攻毒后7日剖检，结果空白对照鸭脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等组织正常；攻毒鸭10/10只脾脏肿大、出血、坏死，部分鸭肝脏、肾脏、胸腺出血，法氏囊萎缩、出血。
实施例4——鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗的制备
1.生产用毒种制备
(1)鸭肝炎病毒1型16115株生产用毒种制备 将毒种用灭菌生理盐水稀释50～100倍，尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，37℃孵育，收获36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，分装，测定病毒含量为108.5ELD50/ml。
(2)鸭肝炎病毒3型16023株生产用毒种制备 将毒种用灭菌生理盐水稀释50～100倍，卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，37℃孵育，收获36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，分装，测定病毒含量为108.13ELD50/ml。
(3)鸭呼肠孤病毒17117株生产用毒种制备
用BHK细胞作为病毒繁殖用材料 将毒种按0.1％细胞维持液的量接种到BHK细胞上，置 37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞病变达80％左右时，冻融收获毒液，分装，测定病毒含量为108.86TCID50/ml
2.制苗用病毒液制备
(1)鸭肝炎病毒1型16115株制苗用病毒液制备 将生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，尿囊腔接种9～10日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每日照胚1次，将36小时内死亡鸡胚弃去。以后每日照胚1～2次，死亡鸡胚随时取出，置2～8℃保存。收获接种后36～96小时内死亡鸡胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量和无菌检验。
按照上述方法制备3批鸭肝炎病毒1型16115株毒液，均无菌生长，病毒含量均≥108.5ELD50/ml。
(2)鸭肝炎病毒3型16023株制苗用病毒液制备 将生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，37℃孵育，不必翻蛋。鸭胚接种后，每日照胚1次，将36小时内死亡鸭胚弃去。以后每日照胚1～2次，死亡鸭胚随时取出，置2～8℃保存。收获接种后36～96小时内死亡鸭胚胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨，离心，取上清，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量和无菌检验。
按照上述方法制备3批鸭肝炎病毒3型16023株毒液，均无菌生长，病毒含量均＞108.5ELD50/ml。
(3)鸭呼肠孤病毒17117株制苗用病毒液制备
用纯悬浮培养BHK细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料 在灭菌生物反应器内加入细胞培养液，接种BHK细胞进行悬浮培养，待细胞密度达到2×106/ml，细胞活力在90％以上时，接种鸭呼肠孤病毒17117株，继续培养。培养过程中每天按时取样观察细胞活力变化情况，待细胞活力下降到50％以下时，收获全悬浮病毒液，装于灭菌容器内，抽样测定病毒含量和无菌检验。
按照上述方法制备3批鸭肝炎病毒3型16023株毒液，均无菌生长，病毒含量均＞108.5TCID50/ml。
3.病毒液灭活
向检验合格的1型、3型鸭肝炎病毒液中加入甲醛溶液，一边加一边搅拌，使其最终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活48小时。向检验合格的鸭呼肠孤病毒液中加入甲醛溶液，一边加一边搅拌，使其最终浓度为0.1％，混匀后37℃灭活60小时。
取鸭肝炎病毒1型灭活毒液和鸭肝炎病毒3型灭活毒液，分别使用易感鸭胚进行灭活检验，均灭活完全。
取鸭呼肠孤病毒灭活液，使用BHK细胞进行灭活检验，灭活完全。
4.油乳剂灭活疫苗制备
(1)水相制备 取灭菌吐温-80 4份，加入灭活胚液96份(血清1型鸭肝炎病毒、血清3型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒液按1∶1∶1比例混合)，充分振摇，使吐温-80完全溶解。
(2)油相制备 取优质注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121℃高压灭菌30min，置室温下保存备用。
(3)乳化 取油相2份放于胶体磨或乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌2～5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相≤0.5ml。
按照上述方法制备3批鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗。
实施例5——灭活疫苗检验
1.性状
外观 均为均匀乳剂
剂型 油包水型。取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相均不多于0.5ml。
黏度 按《中国兽药典》规定方法进行检验，均符合规定。
2.无菌检验
按《中国兽药典》规定方法进行检验，均无菌生长。
3.安全检验
用1～2周龄易感鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.3ml，观察14日，均不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。
4.效力检验
鸭病毒性肝炎部分 取1～2周龄易感鸭10只，每只颈背部皮下注射疫苗0.2ml，同时设条件相同的鸭5只不免疫作为对照。免疫后21日，采集血清，分别测定鸭病毒性肝炎1型和 3型中和抗体效价。免疫组抗体效价均不低于1∶32，对照组均为阴性。
鸭呼肠孤病毒部分 取1～2周龄易感鸭10只，每只颈背部皮下注射疫苗0.2ml，同时设条件相同的鸭5只不免疫作为对照。免疫后21日，所有试验鸭攻击新型鸭呼肠孤病毒强毒， 0.3ml/只。攻毒后7日剖检，取脾脏进行病毒分离。免疫鸭均7/10只以上病毒分离阴性，攻毒对照鸭4/5病毒分离阳性。
5.甲醛残留量测定
按《中国兽药典》规定方法进行测定，均符合规定。
实施例6——鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗对雏鸭的被动免疫保护试验
1.种鸭免疫 取健康易感种鸭20只，随机分为2组，每组10只，第1组肌肉注射免疫鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，每只0.5ml，1个月后加强免疫1次；第2组不接种作为空白对照。隔离饲养。
2.种蛋孵化 种鸭于二次免疫后1个月收集种蛋，非免疫鸭收集同期种蛋，孵化。
3.子代雏鸭攻毒 取1日龄子代雏鸭，按下表1方案进行攻毒。
表1 1日龄被动免疫雏鸭的攻毒方案
Figure BDA0002357748490000131
4.考察指标：
鸭呼肠孤病毒强毒攻毒组，攻毒后观察7日，统计雏鸭的死亡和发病情况，根据死亡和脾脏发病率考察被动免疫雏鸭对鸭呼肠孤病毒的攻毒保护效果。
1型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒强毒攻毒组，攻毒后观察7日，记录雏鸭的发病死亡情况，根据死亡率考察被动免疫雏鸭对鸭肝炎病毒的攻毒保护效果。
5.试验结果1日龄被动免疫雏鸭攻毒后7日对鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为70％，对1 型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒的攻毒保护率均为90％。具体结果见表2。
表2 1日龄被动免疫雏鸭的攻毒保护结果
Figure BDA0002357748490000132
序列表
<110> 齐鲁动物保健品有限公司
<120> 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物DHV-3-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gccaatacaa ggggagtcgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物DHV-3-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cgaaatgggc gatggttgcg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物DHV-1-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
acaggagcca agggttat 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 下游引物DHV-1-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gccaggtggt tgatgtaa 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 上游引物DRV-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
gttatcaggg tcggcaacgc tta 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 下游引物DRV-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
tgcgattgac tcagtttcag cgata 25

Claims (4)

1.一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗中含有灭活的鸭呼肠孤病毒和血清1、3型鸭肝炎病毒；
所述的鸭呼肠孤病毒为鸭呼肠孤病毒17117株、血清1型鸭肝炎病毒为鸭肝炎病毒16115株和血清3型鸭肝炎病毒为鸭肝炎病毒16023株，以上三株病毒已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.18889、CGMCC No.18885和CGMCCNo.18973。
2.如权利要求1所述一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法是用血清1型、3型鸭肝炎病毒接种鸭胚或鸡胚进行病毒繁殖，鸭呼肠孤病毒接种鸡胚或BHK细胞、Vero细胞、LMH细胞、DF-1细胞进行病毒繁殖，病毒液经灭活和浓缩；灭活和浓缩的血清1型鸭肝炎病毒、血清3型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒液按1:1:1的体积比混合制备成水相，再按常规方法制备成灭活佐剂疫苗。
3.如权利要求1所述一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于该二联灭活疫苗抗原的质量标准为：血清1型鸭肝炎病毒接种鸭胚或鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5ELD50/ml；血清3型鸭肝炎病毒接种鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.0ELD50/ml，接种鸭胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5ELD50/ml；鸭呼肠孤病毒接种鸡胚进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.0ELD50/ml；鸭呼肠孤病毒接种BHK细胞或Vero细胞或LMH细胞或DF-1细胞进行繁殖，收获的病毒液毒价≥108.5TCID50/ml。
4.如权利要求1所述的一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗，其特征在于用该二联灭活疫苗给种鸭接种有效剂量的能使免疫种鸭和被动免疫雏鸭对鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒流行株产生有效保护。
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