CN111154730A - 一种鹅星状病毒变异毒株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鹅星状病毒株，该病毒为经典鹅星状病毒FLX变异毒株，保藏编号为CCTCC NO:V201976。本发明所筛选的病毒株用于制备疫苗。本发明通过对临床雏鹅痛风样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鹅星状病毒株，经过透射电子显微镜观察、RT‑PCR试验、血清学试验和动物回归试验，确定所筛选的病毒为经典鹅星状病毒FLX变异毒株，该变异株在血清学和生物学特性上与经典毒株有着显著地差异，该研究为我国养鹅场对该病的综合防控提供基础。

Description

一种鹅星状病毒变异毒株

技术领域

本发明属于疫苗病毒筛选技术领域，具体涉及一种鹅星状病毒变异毒株。

背景技术

鹅星状病毒为单股正链、无囊膜的RNA病毒，病毒基因组全长7.9kb。该病毒是导致动物腹泻的主要致病原之一，除引起腹泻和生长不良外，同时感染机体其它组织脏器，导致致死性肝炎、肾炎、鹅内脏痛风等。自2010年前后，我国广大养鹅地区陆续发生了一种高度致死性内脏痛风病，该病传播迅速，常常导致同一批孵化的雏鹅全部发病，无一幸免，目前该病毒已在全国大面积流行，造成了巨大的经济损失，严重威胁我国养鹅业的发展。该病主要以内脏、关节和肌肉覆盖大量尿酸盐沉积物为特征，患病鹅卧地不起、精神萎靡不振，食欲废绝、剧烈拉稀等症状，发病率高达50％～100％，死亡率可达30％～50％不等，耐过的残鹅生长发育迟滞，大小参差不齐，饲料转化率低，经济损失严重。因此，有必要对鹅星状病毒开展深入研究。

近年来，一些新型星状病毒和星状病毒变异株的出现使得星状病毒的危害有不断加大的趋势，星状病毒感染后常常造成环境的污染，家禽疾病净化困难，该病毒在环境中表现稳定，常规消毒剂对其不敏感，因此，疫苗的研制对该病的防控非常重要。由于该病毒体外繁殖困难，所以常规的灭活疫苗和弱毒疫苗研制困难，Toth通过体外培养的方法获得了DAstV-2，并将其制备成灭活疫苗免疫蛋鸭用于预防商品代鸭肝炎病，Sellers等人利用杆状病毒表达的鸡星状病毒重组衣壳蛋白作为亚单位疫苗免疫种鸡，用于预防商品代肉鸡的生长迟滞与发育不良综合征，效果显著。因为该病首次在我国出现，所以目前国内外均无鹅星状病毒的商品化疫苗。

雏鹅痛风作为近年新流行的鹅新发疫病，其危害巨大，使得养鹅业对鹅星状病毒的防控迫在眉睫，除了严格的生物安全措施外，开发一种有效的疫苗对于该病的综合防控至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹅星状病毒株，该病毒为鹅星状病毒FLX变异毒株；所筛选的病毒株能够用于制备疫苗用于预防鹅星状病毒引起的疾病。

本发明所提供的鹅星状病毒株，为鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株，已经于2019年10月29日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201976；

本发明所筛选的病毒株用于制备疫苗。

所述的疫苗为灭活疫苗。

本发明再一个方面提供一种用鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株作为抗原制备的疫苗。

本发明通过对临床雏鹅痛风样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鹅星状病毒株，经过透射电子显微镜观察、RT-PCR试验、血清学试验和动物回归试验，确定所筛选的病毒为经典鹅星状病毒FLX变异毒株，该变异株在血清学和生物学特性上与经典鹅星状病毒FLX株有着显著地差异，该研究为我国养鹅场对该病的综合防控提供基础。

附图说明

图1：病料接种后鹅胚病变情况图，其中标号1为正常鹅胚；2、3为病料接种F4代120h后死亡鹅胚；

图2：鹅星状病毒粒子的透射电镜观察图(5000×)；

图3：鹅星状病毒的RT-PCR鉴定图；

图4：PCR扩增预期片段序列；

图5：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与经典鹅星状病毒FLX株全基因组核苷酸对比图；

图6：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与经典鹅星状病毒FLX株ORF2氨基酸对比图；

图7：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与经典鹅星状病毒FLX株全基因组核苷酸遗传进化树图；

图8：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与经典鹅星状病毒FLX株ORF2基因氨基酸遗传进化树图。

图9：YB-1攻毒后不同天数的排毒情况图，其中1-7分别代表攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天；

图10：SC-3攻毒后不同天数的排毒情况图，其中1-7分别代表攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的病毒株的筛选过程及理化性质进行详细的描述。

实施例1：病毒株的分离过程

2017年10月至2019年5月，广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等地送检的5-15日龄病、死雏鹅，雏鹅外观跗、趾、指关节肿胀，白色游离尿酸盐沉积，病鹅喜蹲伏、双蹼不敢着地、闭目嗜睡，全身不自主的震颤。剖检可见全身脏器严重的痛风，白色尿酸盐沉积在心脏、肝脏和肾脏等部位，部分病例在腺胃内表面、皮下和胆囊内亦有尿酸盐沉积。

无菌取适量病死雏鹅的肝脏和肾脏，加入5倍体积的无菌生理盐水，剪碎、充分匀浆，8000g离心15min，取上清经0.22μm滤器过滤除菌后，经绒毛尿囊膜途径接种10日龄鹅胚，0.2ml/枚，37℃恒温箱中培养，每天照胚2次，连续观察6天并记录死胚情况。将死胚和不死胚4℃冻胚过夜，收获尿囊液和尿囊膜，以同样的方法用上述尿囊液连续盲传三代。

经绒毛尿囊膜初次传代的F1代鹅胚无明显可见变化，经第二、三代盲传后，鹅胚在接种96h～120h后出现规律性的死亡，随着传代次数的增加，鹅胚死亡越来越明显。无菌打开鹅胚，尿囊膜增厚、略显苍白，胚体鲜红，全身出血，肝脏出血或坏死，无菌收取尿囊膜和尿囊液，经检验无细菌污染和病毒无血凝活性，命名为鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株，-80℃保存备用(图1)。

所筛选的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株，已经于2019年10月29日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201976。

实施例2：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株的鉴定

1、透射电子显微镜观察

取盲传的F3代鹅胚尿囊液200ml，10,000×g离心10min，除去较大的杂质，然后在4℃环境下40,000×g离心3h进一步除去较小杂质，将病毒颗粒用60μl PBS重悬，用1％的磷钨酸负染30s，在透射电镜下观察病毒颗粒结构。

电镜视野中的病毒粒子直径约为30nm，病毒外表面没有囊膜，呈球形，符合星状病毒的结构特点(图2)。

二、PCR鉴定

1、病毒核酸的提取及反转录

在1.5ml离心管中加入300μl病毒绒毛膜研磨上清液，加入700μl Trizol ReagentRNA提取液，混匀，室温放置15min。加入200μl氯仿，充分震荡混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，取上清液500μl转移至经DEPC处理的1.5ml离心管中。加入预冷的异丙醇500μl，-20℃静置30min后，12000rpm离心15min，弃掉上清。加入1ml 75％乙醇，8000rpm离心5min，倒掉液体。倒置于纸上干燥，将沉淀悬于30μl的RNA-free water中，-80℃保存备用。按照反转录酶使用说明书对提取的RNA进行反转录，将合成的cDNA于-20℃保存备用。DNA的提取按照试剂盒(天恩泽TIANDZ编号70701)操作步骤进行。

2、PCR扩增

分别用呼肠孤病毒、星状病毒、小RNA病毒、鹅嵌杯病毒、鹅多瘤病毒和小鹅瘟病毒特异性引物进行RT-PCR检测，采用25μlPCR反应体系：Premix Taq(TaKaRa Taq^TM Version2.0)12.5μl，上、下游引物(上游引物：GTTGAGGGTTTGGAGGCA；下游引物：CGTTGTAAGCCATACATTA均10μM)各1μl，cDNA模板2μl，ddH2O补加至25μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃40s，循环35次；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

3、PCR鉴定结果

PCR反应结束后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果并拍照。电泳结果显示特异性目的片段大小为1076bp，与预期片段大小相符(图4)。表明试验中分离并检测到了鹅星状病毒，尿囊液HA试验均为0，表明不含有血凝性外源病毒污染(禽流感病毒、副黏病毒和腺病毒Ⅲ群)，RT-PCR对呼肠孤病毒GRV、鹅嵌杯病毒GCaV、鹅多瘤病毒GHPV和小鹅瘟病毒GPV外源病毒检测证明鹅星状病毒中不含有其它外源病毒污染(图3)

根据前期的研究，经典鹅星状病毒FLX株在临床上仅仅引起鹅肠炎和腹泻，但该病毒不能在鹅胚上稳定生长，因此无法研究其对鹅胚的致病力问题；本发明分离到的鹅星状病毒经过3代盲传，能够很好地适应鹅胚，并且能够使鹅胚发生不同程度的死亡，因此该分离株对鹅胚是有较强致病力的，因此使得病鹅出现了不同于经典株引起的临床表现，主要表现为全身各脏器的严重尿酸盐沉积现象，这说明本发明分离到的鹅星状病毒的生物学特性较经典株发生了明显改变，尤其是对鹅胚的致病力以及对鹅引起的临床症状上，差异明显。

4、全基因组序列测定及同源性分析

用二代测序技术(Next Generation Sequencing)对所分离得到的鹅星状病毒的全基因组序列进行测定，最终获得鹅星状病毒基因组全长。从GenBank下载已知鹅星状病毒分离株的序列，利用DNAMAN软件，预测各基因节段ORF的位置和数量，推导氨基酸序列，用BLASTn分析各基因编码情况。采用ClustalW1.8比对不同鸡源毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性，通过MEGA6.0构建进化树。将本发明筛选获得的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与GenBank上已发表的鹅星状病毒序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。结果表明，本发明分离到的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株基因组全长7288bp，而经典鹅星状病毒FLX株基因组全长7299bp(序列号：KY271027)，两株病毒全基因组、ORF1a基因、ORF1b基因以及ORF2基因序列均出现了不同程度的碱基突变或缺失(见图4)，其中ORF1a基因高度保守，ORF1b基因相对保守，但编码病毒保护性抗原的衣壳蛋白ORF2基因(4869-6992)变化较大，发生了较大的碱基突变或缺失。本发明分离的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株与经典鹅星状病毒FLX株核苷酸和氨基酸序列同源性比对如下表1-3。

表1：SC-3株与参考毒株核苷酸相似性比较表

表2：SC-3株与参考毒株的氨基酸相似性比较表

表3：SC-3株与参考毒株的氨基酸遗传距离比较表

决定鹅星状病毒抗原性的主要抗原基因ORF2及其编码的VP90蛋白(经典鹅星状病毒FLX株ORF2基因编码的氨基酸序列号：YP009362295)，其同源性分别为73.3％和81.0％，见表1和表2。两株病毒按照星状病毒的分类依据(ORF2编码的氨基酸遗传距离小于0.368～0.781划为同一种)，两者编码的氨基酸遗传距离为0.190，故划为同一病毒种(表3和图6)，但高于星状病毒变异株划分依据下限0.05，全基因组核苷酸同源性低于93％(表1)(ORF2氨基酸遗传距离大于0.05，全基因组核苷酸同源性低于93％作为划分变异株的依据)，故将新分离的鹅星状病毒SC-3株归为鹅星状病毒FLX病毒的变异毒株。因两株病毒的生物学特性发生了明显改变，基于此，本发明依据病毒全基因组核苷酸同源性差异以及ORF2氨基酸遗传距离，两者处于不同的进化分支(图7和图8)，是星状病毒种的变异株。

实施例3、疫苗的制备及病毒中和试验

3.1疫苗的制备

3.1.1鹅星状病毒的繁殖将毒种经典鹅星状病毒YB-1株(YB-1株属于经典鹅星状病毒FLX分支，其LMH细胞适应株由青岛易邦生物工程有限公司分离、鉴定并保存)接种在长满单层的LMH细胞上，连续观察5～6天，繁殖所需的抗原；本发明筛选的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株病毒用灭菌生理盐水作100倍稀释，经绒毛尿囊膜接种10日龄鹅胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将48h内死亡的鹅胚弃去。此后，每4～6h照胚1次，死亡鹅胚随时取出，直至120h，保留48-120h内已死亡和未死亡的鹅胚备用。气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

3.1.2收获将接毒后120h～144h的LMH细胞培养瓶在-20℃反复冻融三次，彻底释放出细胞内的病毒，然后将细胞毒液转移至无菌的离心管中，10000×g离心30min，转移上清至无菌瓶内；将冷却的鹅胚取出，收获鹅胚尿囊膜和尿囊液，吸取胚液放于1L灭菌瓶内，用剪刀和镊子剥离鹅胚绒毛尿囊膜于研钵内充分研磨(加石英砂)，而后将研磨液转移至盛放胚液的灭菌瓶内，于-80℃冰箱反复冻融三次，4℃离心机内5000rpm离心30min，小心的将上清液转移至无菌瓶内。按现行《中国兽药典》对上述两毒液进行无菌检验。收获的上清液灭活前在2～8℃保存。

3.1.3灭活在收获的鹅星状病毒液中加入10％甲醛溶液，使甲醛的最终浓度为0.1％。37℃摇床内，200rpm震荡灭活24小时后取出，放2～8℃保存。

3.1.4半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，确定无菌污染。

(2)病毒含量测定将收获的病毒液(灭活前取样)YB-1株用无菌DMEM培养基作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别接种长满LMH细胞的96孔板，每个稀释度重复5个孔，0.1ml/孔，同时设立正常细胞对照5个孔，0.1ml/孔，37℃培养箱培养，每日观察细胞病变2次，连续观察144h，观察并记录细胞病变情况，计算TCID₅₀，病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml；将收获的病毒液(灭活前取样)SC-3株用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别经绒毛尿囊膜途径接种10日龄鹅胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.1ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察144h。观察并记录每枚胚死亡情况，并计算ELD50,确定病毒含量不低于10^6.0ELD₅₀/0.1ml。

(3)灭活检验准备好6瓶LMH细胞，每瓶接种0.2ml灭活的病毒液YB-1株，每日观察细胞2次，连续观察6日，同时收取细胞液按同样的方法再盲传2代，观察并记录细胞病变情况，结果灭活彻底，无细胞病变。取10日龄鹅胚6个,每个绒毛尿囊膜内接种灭活的病毒液0.2ml，每日照胚2次，观察7日，同时收取胚液和绒毛尿囊膜再照上述方法盲传2代，观察并记录鹅胚死亡情况，结果灭活彻底，无死胚。

3.1.5灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备：将灭活的鹅星状病毒YB-1株抗原液、经典鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株株抗原液各96份分别与灭菌后的吐温-80 4份混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

3.1.6疫苗成品检验

3.1.6.1性状

外观：疫苗为乳白色乳剂；

剂型：为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

3.1.6.2安全检验分别用用7日龄SPF鸡10只和7日龄雏鹅10只，每只颈部皮下注射二联疫苗1.0ml，同时分别设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡和鹅采食、饮水及临床情况。不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

结果表明，试验组和对照组鸡和鹅发育正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。说明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

3.1.6.3效力检验

用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射鹅星状病毒疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组的抗体效价不低于6.0log2VN抗体。对照组应均为阴性。

3.2病毒交叉中和试验

将鹅星状病毒YB-1株和SC-3株，经继代和纯化按上述方法制成灭活疫苗，分别免疫21日龄SPF鸡，免疫剂量0.5ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血分离血清。将YB-1株、SC-3株病毒液分别稀释至200TCID₅₀/0.1ml、200ELD₅₀/0.1ml，逐一与YB-1株和SC-3株的阳性血清等体积混合，37℃震荡中和1小时后，YB-1株每个中和组接种LMH细胞5孔，0.1ml/孔，每日观察细胞病变情况，连续观察7天；SC-3株每个中和组接种10日龄鹅胚5枚，0.1ml/枚，每隔24h照胚一次，弃掉24h以内死亡的鹅胚，连续观察至7天。结果发现，SC-3株阳性血清与YB-1株阳性血清对自身的中和能力较强，但对彼此的中和能力较差，两者的抗原相关性R值只有0.22(表4)，属于不同的血清型。

表4：鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株、经典鹅星状病毒YB-1株的血清交叉中和试验结果表

注：*表示病毒；**表示血清，R值大于0.8为同一血清型，R值在0.25～0.8之间为同一血清型不同亚型，R值小于0.25为不同血清型。

4、攻毒保护试验

将经典鹅星状病毒YB-1株和鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株分别在LMH细胞和鹅胚绒毛尿囊膜上进行培养，并进行TCID₅₀和ELD₅₀的测定，使用传代培养后的F3代毒液制备抗原，毒株抗原滴度分别为10^-6.0TCID₅₀/0.1ml、10^-6.0ELD₅₀/0.1ml，用终浓度1.5‰的甲醛37℃灭活24h，按照油相：水相＝2:1的比例制备成灭活疫苗。将70只1日龄的雏鹅分为7组，10只/组，免疫组鹅分别于5日龄、15日龄和28日龄颈部皮下注射YB-1、SC-3鹅星状病毒灭活疫苗，0.5ml/只，并设攻毒对照组(不做免疫，只攻毒)和空白对照组(不免疫，不攻毒)，于45日龄用YB-1、SC-3鹅星状病毒腿肌注射攻毒，1ml/只(YB-1＝10^-7.0TCID₅₀，SC-3＝10^-7.0ELD₅₀)。每日观察鹅群精神状态、采食及发病情况，并在攻毒后第2、4、6、8、10、12、14天采集每只鹅泄殖腔拭子，用RT-PCR的方法检测排毒情况，并记录试验数据(表5、表6和图9、图10)。

表5：试验分组设计表

表6：鹅星状病毒病毒YB-1、SC-3攻毒后的排毒情况表

攻毒保护试验结果表明，星状病毒YB-1株攻毒对照组鹅从攻毒后第2天开始100％排毒，采食量下降，5只鹅出现拉稀现象，其它无异常；YB-1株免疫组能够对YB-1株本毒攻毒提供完全的保护，该组鹅未表现任何临床症状，不排毒，精神正常；SC-3株免疫组对YB-1株攻毒保护较差，该组鹅有3只拉稀，并且伴有采食量减少，所有鹅在攻毒后第4天陆续开始排毒(较攻毒对照延迟排毒，说明有部分交叉保护效果)，但无死亡。本发明筛选的鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株攻毒对照组鹅从攻毒后第2天开始100％排毒，采食量下降，所有鹅出现剧烈的拉稀现象，有5只鹅精神萎靡；SC-3株免疫组能够对SC-3株本毒攻毒提供完全的保护，该组鹅未表现任何临床症状，不排毒，精神正常；YB-1株免疫组对SC-3株攻毒保护很差，该组鹅从攻毒后第2天全群拉稀，采食量减少，大部分鹅有打蔫现象，精神状态较差，所有鹅于攻毒后第2天陆续开始排毒，但无死亡。综上所述，鹅星状病毒YB-1株和SC-3株之间的交叉保护性较差，且鹅星状病毒SC-3株毒力较强，引起鹅只明显的精神萎靡和拉稀现象，说明本发明分离到的鹅星状病毒SC-3株为经典鹅星状病毒YB-1株的变异毒株，即鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株，本分离株与经典毒株在攻毒保护上有着显著的差异，鉴于目前我国养鹅地区流行鹅星状病毒FLX变异毒SC-3株，应使用该变异株制备疫苗，方能对该流行毒引起的腹泻等临床疾病起到很好的预防作用。

Claims (4)

1.一种鹅星状病毒株，其特征在于，所述的鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201976。

2.权利要求1所述的鹅星状病毒株在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

4.一种灭活疫苗，其特征在于，所示的灭活疫苗中的抗原为权利要求1所述的鹅星状病毒株。

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