CN116042537A - 禽呼肠孤病毒株qyh2020-qd、病毒液及制备方法、应用 - Google Patents

禽呼肠孤病毒株qyh2020-qd、病毒液及制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种禽呼肠孤病毒株QYH2020‑QD，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020‑QD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45270。所述禽呼肠孤病毒株QYH2020‑QD具有高病毒滴度和优良的免疫原性。将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020‑QD用于禽用疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，禽群保护率高；可以有效防治禽呼肠孤病毒感染，为养禽企业因禽呼肠孤病毒引起的相关疫病防治奠定基础。

Description

禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD、病毒液及制备方法、应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD、病毒液及制备方法、应用。
背景技术
呼肠孤病毒是具分节段的双链RNA基因组的一类病毒，分布广，病毒粒呈球形，大小在60-80纳米之间的20面体结构。禽呼肠孤病毒可引起禽的多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和吸收不良综合征。同时，禽呼肠孤病毒的感染也会增加其他疾病的感染几率，直接影响禽类，尤其是肉鸡和蛋鸡的经济效益，给养禽业带来巨大的经济损失。
我国禽呼肠孤病毒的相关疫苗较为单一。随着病毒变异等因素发生，禽呼肠孤病毒相关疫病的防治困难逐年增加。
发明内容
本发明自主分离得到禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD具有高病毒滴度和优良的免疫原性。将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD用于禽用疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，禽群保护率高；可以有效防治禽呼肠孤病毒感染，为养禽企业的禽呼肠孤病毒相关疫病防治奠定基础。
本发明提供了一种禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45270。
本发明提供了一种病毒液，所述病毒液含有所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD。
优选的，所述病毒液中的病毒含量≥107.5TCID50/0.1ml。
本发明提供了所述病毒液的制备方法，包括如下步骤：
S1、将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD接种鸡肝癌细胞(LMH)，液体培养基中培养，得到培养液；
S2、对步骤S1所述培养液除杂，得到所述病毒液。
优选的，步骤S1所述培养的温度为36-38℃，CO2含量为4％-6％，时间为48-72h。
优选的，步骤S2所述除杂依次包括冻融和离心的步骤；所述离心后，收取的上清液即为所述病毒液。
本发明提供了所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD或者所述病毒液在制备禽用疫苗中的应用。
优选的，所述禽用疫苗包括禽呼肠孤病毒灭活疫苗。
本发明还提供了一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗，所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗的有效抗原成分包括所述禽呼肠孤病毒毒株QYH2020-QD。
优选的，所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗包括31-32份所述病毒液，62-63份矿物油、0.6-0.7份硬脂酸铝、3-3.5份司本80和1.5-2份吐温80。
有益效果：
本发明提供了一种禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45270。所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD具有高病毒滴度和优良的免疫原性。将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD用于禽用疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，禽群保护率高；可以有效防治禽呼肠孤病毒感染，为养禽企业的禽呼肠孤病毒相关疫病防治奠定基础。
生物保藏说明：
禽呼肠孤病毒Avian orthoreovirus，于2022年09月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.45270。
具体实施方式
本发明提供了一种禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45270。所述禽呼肠孤病毒在LMH细胞中增殖速度快，毒价高，禽呼肠孤病毒达到107.5-108.0TCID50/0.1ml，免疫原性好，对家禽和环境均安全。
本发明提供了一种病毒液，所述病毒液含有所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD；优选的，所述病毒液中的病毒含量≥107.5TCID50/0.1ml。
本发明提供了所述病毒液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：S1、将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD接种鸡肝癌细胞(LMH)，液体培养基中培养，得到培养液；S2、对步骤S1所述培养液除杂，得到所述病毒液。
在本发明中，步骤S1所述培养的温度为36-38℃，优选为37℃，CO2含量为4％-6％，优选为5％，时间为48-72h，优选为60-65h。步骤S1所述培养基优选为1％的FBS培养基。本发明对所述培养基的来源不作特别限定，本领域常规市售符合要求的产品均可。步骤S2所述离心的参数优选为3000rpm，5min。所述离心后，收取的上清液即为所述病毒液。
在本发明更优选的具体实施方式中，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD的培养条件为：接种于长势良好的单层LMH细胞上，使用1％FBS培养基，37℃，5％CO2培养48-72h，观察细胞病变，当80-90％以上的细胞出现变圆、崩解等典型细胞病变时，收获病毒液。
本发明提供了所述禽呼肠孤病毒毒株QYH2020-QD或者所述病毒液在制备禽用疫苗中的应用。所述禽用疫苗的类型优选包括禽呼肠孤病毒灭活疫苗。所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗的有效抗原成分包括所述禽呼肠孤病毒毒株QYH2020-QD。
优选的，所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗还包括矿物油、硬质酸钠、司本80和吐温80。在本发明中，所述病毒液的用量优选为31-32份，更优选为31.67份；所述矿物油的用量优选为62-63份，更优选为62.7份；所述硬脂酸铝的用量优选为0.6-0.7份，更优选为0.66份；所述司本80的用量优选为3-3.5份，更优选为3.3份；所述吐温80的用量优选为1.5-2分，更优选为1.67份。本发明对上述除病毒液外的其他各原料来源不作特别限定，本领域常规市售符合疫苗制作原料要求的产品均可。
本发明提供了一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)灭活：采用甲醛灭活所述病毒液。
(2)油相制备：取矿物油、硬脂酸铝，混合均匀、加热后加入司本80，加热混匀，冷却后得到油相。
(3)水相制备：将灭活的病毒液和灭菌的吐温80充分混匀，作为水相溶液。
(4)乳化：取油相，水相，混合放入乳化罐中，3500r/min搅拌30分钟，完成乳化制备。
本发明提供的禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD在LMH细胞中培养，毒价高，达到0.1ml禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株107.5-108.0TCID50，免疫原性好，对家禽(尤其是肉鸡、蛋鸡)和环境安全。所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD用于制备灭活疫苗，免疫后抗体水平高，持续时间长，保护率高，能较好的控制病毒性关节炎的发生与流行，显著提高养禽业的经济效益。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株的筛选与鉴定
1、病毒分离与鉴定：病料取自2020年青岛某鸡场发病鸡群临床症状为出现病毒性关节炎、矮小综合征等的病鸡关节及肝脏组织，加1ml无菌PBS缓冲液后研磨，12000转离心10min，取上清，用0.22μm滤芯过滤后接种到LMH细胞中，每天观察病变情况，9天后细胞90％病变后冻融收获，获得病毒液F1代。F1代病毒液按照1:1000接种到LMH细胞中，65h收获病毒液F2代，对收获的病毒液F2代提取DNA。采用试剂盒：Dneasy血液及组织核酸提取试剂盒(250)，按照说明书进行提取。对得到的模板使用ARV引物进行PCR。在紫外灯照射下切取特异性条带，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，连接并转化于大肠杆菌感受态细胞。将阳性样品进行基因测序，并进行遗传进化分析。
2、病毒克隆：对分离到的禽呼肠孤病毒进行蚀斑克隆。准备好已经长满的LMH细胞，把分离到的禽呼肠孤病毒做稀释处理，稀释到10-6，10-7，10-8稀释度，接种到LMH细胞中，吸附1h，弃吸附液，覆盖2％的低温琼脂(含有1％胎牛血清的培养基配制)，5天左右可观察到蚀斑，使用枪头把蚀斑挑出，接种到LMH细胞中，90％病变后收获。对收获的病毒液进行病毒鉴定，方法同上述PCR鉴定，PCR产物送去北京擎科生物科技有限公司进行测序，同上述进行基因比对，重复病毒克隆、病毒PCR鉴定。得到禽呼肠孤病毒F1代种毒，命名为禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株。
3、外源检测：利用已建立的PCR，RT-PCR等检测方法，对分离毒株中是否含其他常见杂病毒进行检测。检测项目包括禽流感病毒、网状内皮增生症病毒、禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒(NDV)、马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合征病毒、禽痘病毒和禽腺病毒等。
按常规方法配制不同浓度(0.8％-2％)的鸡、鸭和大鼠红细胞。检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果显示，分离病毒均不具有凝集鸡、鸭和大鼠红细胞的能力，即使改变不同红细胞的浓度也不能使之凝集。
4、种毒传代：按照体积比1:1000进行LMH细胞接种传代，细胞病变后，病毒液中出现圆球状病变，90％病变后进行冻融，3000转5min收取上清，-20℃保存备用，标记为F2代种毒，如此反复传到10代。
5、F1代禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株种毒毒力测定
采用LMH细胞96孔板测量种毒效价，将禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株稀释到10-9，每个稀释度0.9ml培养基(含1％FBS)加0.1ml上一稀释度病毒液，接种到96孔板中，每孔0.1ml，每个稀释度接种8孔，接种10-4到10-9，培养7天后观察病变情况。结果禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株效价为107.8TCID50/0.1ml。
6、致病力检测
(1)致细胞病变作用
将禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株F1、F5和F10代病毒液，接种于单层LMH细胞，接种量为0.1％，置37℃，5％ CO2培养，接种后每12小时观察一次，观察至72小时，记录细胞病变。结果显示：禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株接种后24小时左右逐渐开始出现细胞病变，接种65小时后，约有80-90％细胞病变死亡，形成圆球状病变，72h细胞全部病变死亡。
(2)对SPF鸡致病力
将20只14日龄SPF鸡随机分成2组，每组10只。其中一组静脉接种灭菌生理盐水稀释的QYH2020-QD株病毒液，每只0.1ml(病毒含量为106.0TCID50/0.1ml)，另一组，接种等量的灭菌生理盐水做为正常对照组。接种后每天观察各组鸡只临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。
接种第1天后个别鸡只开始发病，出现腿瘸、关节肿大等症状，到第7天全部出现腿瘸、关节肿大等症状，且发育不良。
接种生理盐水对照组鸡只的精神状态、采食和饮水均正常，100％存活。
具体结果见表1：
表1QYH2020-QD株对14日龄SPF鸡的致病性试验
实施例2禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗的制备
1、病毒液的制备：正常LMH细胞长满后按照体积比1:1000进行接种，使用1％FBS培养基37℃培养，60-65h时待细胞90％病变后进行冻融处理，3000转5min离心，收取上清，即为禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株病毒液。
2、病毒含量检测：使用实施例1中的检测方法进行检测，病毒含量每0.1ml禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株病毒液的病毒含量≥107.5TCID50。
3、灭活及检验：向已检验的禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株病毒液中加入最终含量为0.15％的甲醛，37℃灭活24小时。灭活完成后取样做无菌检验及灭活检验，灭活病毒液置2-8℃保存，应不超过7日。取灭活病毒培养液，按1％接种长势良好的LMH细胞24孔培养板中，37℃培养、5％CO2，每12小时观察一次，观察至168小时，其后盲传1代，检测样品孔应均不出现细胞病变，判定为灭活完全。
4、油佐剂灭活疫苗制备：
1)油相制备：取矿物油95份、硬脂酸铝1份混合均匀、加热后加入司本80 5份，加热混匀，冷却后得到油相。
2)水相制备：将灭活的禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株的病毒液95份和灭菌的吐温805份充分混匀，作为水相溶液。
3)乳化：取油相、水相(油相和水相的体积比为2:1)放入乳化罐中，3500r/min搅拌30分钟，完成乳化制备。
4)封装：定量分装，加盖密封，并贴标签，置2-8℃保存。
实施例3禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗检验
按照实施例2中方法制备禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗(批号20210301，20210302，20210303)。
1、性状：
外观：乳白色均匀乳剂。
剂型：油包水型，取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，除第一滴外，均未扩散。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。
2、无菌检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明，无菌生长。
3、免疫攻毒保护效力检验：取10日龄SPF鸡40只，分成4组，每10只，1-3组分别颈部皮下接种3批禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗(批号为：20210301，20210302，20210303)，每只0.5ml。同时设非免疫攻毒对照组，颈部皮下注射0.5ml/只灭菌生理盐水。于免疫后14天分别静脉注射灭菌生理盐水稀释的禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株，每只0.1ml(病毒含量为2×106.0TCID50/0.1ml)，连续观察14日。如有死亡，对死亡鸡只进行剖检，攻毒14后将全部存活鸡只逐一剖检，观察关节及内脏有无病变。
结果表明：免疫禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗组鸡只精神状态、采食、饮水等正常，解剖后关节及各脏器正常，未出现关节积液等情况。具体结果见表2：
表2三批次禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗攻毒保护效力试验结果
4、双倍接种剂量安全试验
按照实施例2中方法制备禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗(批号20210301，20210302，20210303)，将40只14日龄SPF鸡分成4组，每组10只，实验1、2、3组分别接种批号20210301、20210302、20210303的禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗，剂量为1ml/只，对照组颈部皮下注射1ml/只灭菌生理盐水在相同条件下饲养管理，连续观察14天，将存活鸡全部剖杀，观察关节、呼吸道及内脏有无病变。
结果表明：接种14天内，未观察到临床异常，各组剖检后未观察到呼吸道及肝脏病变。具体结果见表3
表3三批次禽呼肠孤病毒QYH2020-QD株灭活疫苗双倍接种安全试验结果
组别 免疫日龄 只数 剂量 接种途径 结果判定
20210301 14 10 1ml 颈部皮下 正常
20210302 14 10 1ml 颈部皮下 正常
20210303 14 10 1ml 颈部皮下 正常
对照 14 10 1ml 颈部皮下 正常
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD，其特征在于，所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45270。
2.病毒液，其特征在于，所述病毒液含有权利要求1所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD。
3.根据权利要求2所述的病毒液，其特征在于，所述病毒液中的病毒含量≥107.5TCID50/0.1ml。
4.权利要求2或3所述病毒液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD接种LMH细胞，液体培养基中培养，得到培养液；
S2、对步骤S1所述培养液除杂，得到所述病毒液。
5.根据权利要求4所述病毒液的制备方法，其特征在于，步骤S1所述培养的温度为36-38℃，CO2含量为4％-6％，时间为48-72h。
6.根据权利要求4所述病毒液的制备方法，其特征在于，步骤S2所述除杂依次包括冻融和离心的步骤；所述离心后，收取的上清液即为所述病毒液。
7.权利要求1所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD或者权利要求2或3所述病毒液在制备禽用疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述禽用疫苗包括禽呼肠孤病毒灭活疫苗。
9.禽呼肠孤病毒灭活疫苗，其特征在于，所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗的有效抗原成分包括权利要求1所述禽呼肠孤病毒株QYH2020-QD。
10.根据权利要求9所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗，其特征在于，所述禽呼肠孤病毒灭活疫苗包括31-32份权利要求2所述病毒液，62-63份矿物油、0.6-0.7份硬脂酸铝、3-3.5份司本80和1.5-2份吐温80。
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