CN116286670A - 一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用，所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株，其保藏编号为CCTCC No：V202167。本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备灭活疫苗和卵黄抗体。本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株具有优异的免疫原性，能够在LMH细胞上稳定传代，以其作为免疫抗原制备的灭活疫苗以及卵黄抗体，安全性好，对当前地方流行的新型鸭呼肠孤病毒引起的鸭脾坏死症有更好的保护作用，该产品具有良好的商品化开发前景。

Description

一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的 应用

技术领域

本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用。

背景技术

呼肠孤病毒广泛存在于家禽中，以鸡群感染的报道最为多见。临床上可引起鸡的肠炎、肝炎、神经症状、心肌炎、呼吸系统疾病和关节炎、腱鞘炎等多种疾病形式。早在1950年，Kaschula等在南非观察到番鸭呼肠孤病毒感染的病例，到20世纪70年代，该病在法国流行并成为番鸭的主要病毒病之一。1997年，我国的广州、福建、浙江等地区也出现了类似的疾病，俗称“番鸭肝白点病”或“花肝病”。到2000年胡奇林等首次分离并初步鉴定该病原为一种新型RNA病毒。吴宝成等于2001年确定该病毒为呼肠孤病毒。此后在全国范围内都有该病发生的报道出现。2006年前后，我国部分地区北京鸭商品代肉鸭群发生一种以脾脏斑块样坏死为主要特征的传染性疾病，鸭群无明显特异性症状，剖检可见特征性病变为脾脏表面有出血斑或坏死灶，被称为“鸭脾坏死症”。通过系统的实验室诊断，证实该病由一种与番鸭呼肠孤病毒相关的新型鸭呼肠孤病毒引起。

新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)属呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属，能引起雏鸭“脾坏死症”，主要临床症状表现为患鸭精神沉郁，食欲减退，羽毛蓬乱，脚软，两腿无力，多蹲伏，部分病鸭有拉稀症状，排白色稀粪，病鸭耐过后生长发育明显迟缓，成为僵鸭，影响养殖效益。其主要病理变化是脾脏肿大、坏死，表面有明显出血班或坏死灶，随病程发展，坏死灶进一步增大，并形成肉芽肿结构，感染后期，坏死区域被增生的网状细胞及内皮细胞替代。

2011年山东地区开始出现新型鸭呼肠孤病毒病，之后几年呈现区域性流行，发病率较低，但从2017年开始该病的发病率迅速上升，发病区域也不断扩大，各品种鸭均可感染，给山东省的鸭养殖业造成了很大的困扰。

目前国内、外对于鸭呼肠孤病毒病的商品化产品，仅有番鸭呼肠孤灭活疫苗一种，随着病毒的变异发展，目前新型鸭呼肠孤病毒已逐步呈大范围流行趋势，现有产品对于流行毒株无法取得良好的保护效果。因此筛选发生变异的流行毒株是新型鸭呼肠孤病毒病防控的重要环节。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用，即提供一株发生了变异的新型鸭呼肠孤病毒株。

本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株，于2021年8月19日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V202167。

本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备灭活疫苗；

本发明再一个方面还提供一种灭活疫苗，其中的抗原中使用了灭活的新型鸭呼肠孤病毒DE株；

再一个方面，本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备卵黄抗体；

所述的卵黄抗体可用于制备用于预防或治疗鸭脾坏死症的制品。

本发明所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株具有优异的免疫原性，能够在LMH细胞上稳定传代，以其作为免疫抗原制备的灭活疫苗以及卵黄抗体，安全性好，对当前地方流行的新型鸭呼肠孤病毒引起的鸭脾坏死症有更好的保护作用，该产品具有良好的商品化开发前景。

附图说明

图1为分离毒株的透射电镜观察图；

图2为分离毒株的抗原蛋白σC的氨基酸序列比对结果；

图3为分离毒株的遗传进化分析结果；

图4为分离毒株在LMH细胞上的细胞病变；其中，图A为正常生长状态下的LMH细胞；图B为分离毒株在LMH细胞上出现的细胞病变。

具体实施方式

本发明从山东省聊城市东阿县的雏鸭养殖场采集的病料中进行病毒分离鉴定，成功获得一株免疫原性良好的新型鸭呼肠孤病毒，可用于灭活疫苗及卵黄抗体的制备。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：病毒株的分离鉴定

1、流行病学调查

自2011年起山东地区的雏鸭养殖出现了一种病毒传染性疾病，病鸭无明显特异性症状，主要表现为精神沉郁、不愿走动，采食量降低，病鸭耐过后生长发育不良，成为僵鸭，严重影响养殖效益。剖检观察发现主要病理变化为肝脏、脾脏的肿大、出血、斑块样坏死。

2、病毒分离

在山东省聊城市东阿县发病雏鸭养殖场取样，死亡病鸭中剖检见肝脏、脾脏肿大、出血、斑块样坏死的病症。

取病变的肝脏、脾脏组织，加入5倍体积灭菌生理盐水，充分研磨，反复冻融2次后8000r/min离心30分钟，取上清用0.22μm无菌滤器过滤除菌，经尿囊腔接种9日龄鸭胚，每胚0.1ml，36～37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的鸭胚，收获24～168小时死亡鸭胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸭胚尿囊液。

3、病毒鉴定

3.1核酸检测

取200μl病毒液，用天根生化科技(北京)有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号DP315)，提取病毒DNA及RNA。RNA进行反转录获得cDNA，反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的PrimeScript^TM RT Master Mix(货号RR036A)。获得的病毒DNA及cDNA置于4℃保存。

分别检测新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭性状病毒、H5、H7、H9亚型禽流感病毒、禽腺病毒等水禽常见病毒病。

PCR反应体系：采用20μl体系进行扩增，模板DNA 3μl，上、下游引物各0.5μl，2×Premix Taq 10μl，采用ddH₂O补充至20μl体系。混匀瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为94℃，5min，之后94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

PCR结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，仅新型鸭呼肠孤病毒扩增出相应的目的片段，与预期目的片段大小相符。对扩增出的目的片段进行测序后，通过NCBI BLAST比对分析，确定该分离毒株与新型鸭呼肠孤病毒的序列同源性最接近，将该分离毒株命名为DE株。

3.2红细胞凝集试验

分别无菌采集SPF鸡和鸭血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的DE株的病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。

结果显示：分离毒株DE株均不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。

3.3理化特性检验

参照《动物病毒学》中的检验方法，将DE株的病毒液分别经氯仿、乙醚、盐酸(pH3.0)、温度(60℃，1小时)处理后，接种9日龄鸭胚(0.1ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。37℃培养7日。

结果显示：乙醚、氯仿处理不影响病毒鸭胚中的增殖，鸭胚出现死亡，PCR检测结果呈阳性；而盐酸与热处理组鸭胚的死亡率明显降低。从而说明，本发明分离到的病毒株DE株为无囊膜病毒，对酸和温度敏感，核酸类型为RNA。

3.4电镜观察

将DE株的病毒液以3000r/min离心20分钟，取上清以40000r/min离心3小时，再取沉淀用PBS重悬后置于铜网上，经2％磷钨酸负染1～2分钟，利用透射电镜进行观察。

结果如图1所示：该分离毒株DE株呈球形、正十二面体对称、无囊膜、双层衣壳，直径70nm左右，呈典型新型鸭呼肠孤病毒特征。

3.5特异性检测

以DE株作为抗原制备灭活疫苗，接种SPF鸡，首免剂量0.5ml/只，加强免疫剂量为1.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，3免后14天进行采血，分离血清，经0.22μm滤器过滤除菌后保存备用。

将DE株进行10倍稀释，与阳性血清等体积混合，于37℃中和1小时后，接种9日龄鸭胚，0.1ml/胚，接种后观察7日。

结果显示中和组鸭胚全部健活，未中和对照组鸭胚全部死亡，表明该分离毒株DE株具有良好的特异性。

3.6致病性研究

(1)对不同品种鸭的致病性

将DE株以肌肉注射途径分别接种2日龄樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭各10只，0.5ml/只，攻毒后7日，全部剖检，观察内脏病变情况。

结果显示各组鸭均10/10出现肝脏、脾脏肿大、出血及斑块样坏死。

(2)对不同日龄鸭的致病性

将DE株以肌肉注射途径分别接种9日龄、35日龄樱桃谷鸭各10只，0.5ml/只，攻毒后7日，全部剖检，观察内脏病变情况。

结果显示9日龄组10/10出现肝脏、脾脏肿大、出血及斑块样坏死；35日龄组仅2/10出现脾脏有坏死点、轻微出血。

上述试验结果表明，该分离毒株DE株对各品种鸭均具有致病性，随雏鸭日龄增大，致病性逐渐减弱。此规律与新型鸭呼肠孤病毒自然感染致病的规律相一致。

3.7免疫原性研究

将继代后的DE株病毒液经纯化进行了免疫原性试验。该毒株制成灭活疫苗免疫成年雌性种鸭，免疫后1月龄所产子代均能够产生完全的攻毒保护，表明该分离毒株DE株具有较好的免疫原性。

3.8抗原蛋白σC的序列分析

参考GenBank登录的新型鸭呼肠孤病毒基因组序列，针对σC基因设计引物，对分离毒株的σC基因片段进行扩增，将获得的扩增产物克隆至pMD18-T载体，鉴定正确后测序。

测序结果显示，DE株的σC基因片段大小为966bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。将SEQ ID NO:2在NCBI数据库中进行比对分析发现，DE株与禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒的同源性较低，与新型鸭呼肠孤病毒的同源性最高，比对参考毒株详见表1。

表1：比对毒株信息表

注：表中ARV代表禽呼肠孤病毒，MDRV代表番鸭呼肠孤病毒，NDRV代表新型鸭呼肠孤病毒。

抗原蛋白σC氨基酸序列比对结果如图2所示，分离毒株DE株与新型呼肠孤病毒091株、TH11株、HN5d株、HN5d株分别存在8-22个氨基酸的区别。

进一步将该分离毒株与表1中所述毒株进行遗传进化分析，结果如图3所示，该分离毒株明显在新型鸭呼肠孤病毒分支中，且与新型鸭呼肠孤病毒HN5d株亲缘性最近。

上述结果表明，本发明分离得到的DE株是新型鸭呼肠孤病毒的一个新毒株。

4、毒种保藏

将该分离毒株命名为新型鸭呼肠孤病毒DE株，于2021年8月19日保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V202167。

实施例2：新型鸭呼肠孤病毒DE株灭活疫苗的制备

1、新型鸭呼肠孤病毒DE株的细胞适应性

按照常规细胞培养方法培养鸡肝癌细胞(LMH)，待25cm²细胞瓶中的细胞铺满单层时，换细胞维持液，按1:100比例接种分离毒，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，观察出现细胞病变的时间，至80％以上细胞出现病变时，冻融1次，以5000r/min离心10分钟收集上清，获得继代病毒液。按上述方法连续传代，获得传代稳定的细胞毒株，建立病毒种子批。

2、抗原制备

将新型鸭呼肠孤病毒DE株按1:1000比例接种LMH细胞单层，当80％以上细胞出现病变时，冻融1次，离心收获病毒液。测定病毒含量应不低于10^6.5TCID₅₀/0.1ml，并按《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

3、灭活疫苗制备

将抗原置于灭菌容器内，按病毒液体积的0.2％加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，37℃灭活24小时，灭活后的病毒液置2～8℃保存，取样进行无菌检验与灭活检验。

取检验完成的抗原液96份，加入4份灭菌冷却后的吐温-80，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，作为疫苗水相。

取矿物油94份、硬脂酸铝2份混合均匀并加热至80℃，再加入6份司本-80，至温度达到121℃时维持40分钟，冷却后作为疫苗油相。

将水相与油相按1:2的比例乳化配苗，制备灭活疫苗。

4、分装

将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，粘贴标签，置2～8℃保存。实施例3新型鸭呼肠孤病毒DE株灭活疫苗的检验

参照《中国兽药典》相关检验方法对实施例2制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活苗进行检验。

1、性状

外观：乳白色均匀乳剂。

剂型：油包水型。

取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。

2、无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3、安全检验

用2～4周龄SPF鸡10只，每只皮下注射疫苗2.0ml(颈后部两侧皮下各注射1.0ml)，观察14日，注射部位是否出现红肿热痛等炎症反应，观察期结束全部剖检，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果显示：观察期内试验鸡均健活，精神状态良好，剖检观察，注射部位疫苗吸收良好，无红肿、坏死等组织病变。结果证明本灭活疫苗安全。

4、效力检验

用健康开产种鸭30只，随机分为3组，每组10只。第1组为免疫组，各肌肉注射疫苗1.0ml；第2组为不免疫攻毒对照组；第3组不免疫不攻毒设为空白对照组，同条件下隔离饲养。免疫后28日起收集种蛋入孵，各组同期孵化的雏鸭随机选取10只，免疫组与攻毒对照组雏鸭，各肌肉注射新型鸭呼肠孤病毒，0.5ml/只，攻毒后7日全部剖检，观察内脏病变情况。

结果显示：免疫组雏鸭10/10保护，剖检观察各组织脏器未见明显病变；攻毒对照组雏鸭9/10剖检可见脾脏肿大、出血或坏死，3/10肝脏有针尖大小坏死点；空白对照组雏鸭全部健活。结果表明本灭活疫苗具有较好的免疫保护力。

5、甲醛残留量测定

按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。

实施例4：DE株灭活疫苗与番鸭呼肠病毒灭活疫苗的免疫对比试验

目前市场上并没有针对新型鸭呼肠孤病毒的疫苗产品，仅有针对番鸭呼肠病毒的活疫苗产品。因此为了评价本发明提供的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的免疫效果，利用之前自主分离鉴定的一株番鸭呼肠孤病毒流行毒株LZ株制备得到灭活疫苗，与新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗进行免疫对比试验。

1、灭活疫苗制备

按照实施例2所述方法制备得到番鸭呼肠病毒LZ株的灭活疫苗，与本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒DE株的灭活疫苗进行对比。

2、免疫

将上述2种疫苗分别免疫开产种番鸭各60只，免疫后30日，收集2种疫苗免疫组所产鸭蛋，及未进行免疫鸭蛋同时进行孵化。

3、雏鸭攻毒

孵化的雏鸭于2日龄进行攻毒试验。各免疫组分别选取20只健康雏鸭，随机分为2组，10只/组，分别用DE株病毒液和LZ株病毒进行攻毒，攻毒剂量均为2×10^3.5TCID₅₀，另取10只未免疫组孵化雏鸭，不攻毒作为空白对照。同条件下隔离饲养观察7日，全部剖杀，观察内脏病变情况，结果见表2。

表2：雏鸭攻毒剖检结果表

从表1的结果可知，番鸭呼肠孤病毒LZ株与新型鸭呼肠孤病毒DE株无交叉保护作用；番鸭呼肠孤病毒LZ株灭活疫苗对新型鸭呼肠孤病毒DE株不具备保护作用，而新型鸭呼肠孤病毒DE株灭活疫苗对新型鸭呼肠孤病毒具有良好的免疫原性。

通过免疫攻毒试验可知，本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗对于当前鸭呼肠孤病毒流行毒株具有保护作用。

实施例5：新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备

1、产蛋鸡群的选择

选择符合下列标准的健康开产蛋鸡。

(1)按照鸡群0.5％的比率抽样采血检测抗体，根据NY/T 536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》进行检测，鸡群鸡白痢沙门氏菌血清学检查(血清平板凝集试验，SPA)阳性率应≤0.1％。

(2)按照鸡群0.5％的比率抽样采血检测抗体，根据NY/T 553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡群鸡支原体血清学检查(血清平板凝集试验，SPA)阳性率应≤0.1％。

(3)按照鸡群0.5％的比率抽样采血检测抗体，根据NY/T 1247-2006《禽网状内皮组织增生病诊断技术》进行检测，鸡群禽网状内皮组织增生病血清学检查(酶联免疫吸附试验，ELISA)应为阴性。

(4)按照鸡群0.5％的比率抽样采血检测抗体，根据GB/T 26436-2010《禽白血病诊断技术》进行检测，鸡群禽白血病血清学检查(酶联免疫吸附试验，ELISA)应为阴性。

(5)鸡群有合理的免疫程序及用药，无重大疫病发生。

2、免疫程序

首免，健康开产蛋鸡，每只颈部皮下注射油乳剂灭活疫苗2.0ml。

二免，在首免后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉多点注射油乳剂灭活疫苗2.0ml。

三免，在二免后21日进行第3次接种，每只鸡腿部肌肉多点注射油乳剂灭活疫苗2.0ml。

维持接种，在三免后3个月，若实际生产需要，可维持接种1次，每只胸部肌肉多点注射油乳剂灭活疫苗2.0ml。

3、采蛋

第3次免疫后21日，抽样测定高免卵黄中的抗体中和效价。中和效价不低于1:1024时，方可收集高免蛋，置10～15℃贮存，应不超过10日。

4、卵黄抗体的制备

(1)蛋壳消毒

将收集的高免蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。蛋壳污染严重者，预先选出，单独用消毒水冲洗干净后，再浸泡消毒1次。

(2)打蛋分离卵黄

采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活I

充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，加入等体积的灭菌注射用水，搅拌均匀，62～65℃热灭活30分钟，冷却至室温。

(4)酸化

将原卵黄6倍体积的酸化水(用盐酸将pH值调为4.2的注射用水)，预降温至4℃，缓缓加入灭活I的卵黄液，边加边搅拌，4℃静置8～24小时，以8000r/min低温离心15分钟，分离上清液。

(5)萃取

在上清液中加入终浓度为0.2％正辛酸，搅拌均匀，室温放置5～10小时。

(6)过滤

用适宜的方法过滤使其澄清。

(7)灭活II

计量加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌均匀，室温放置24小时，期间搅拌4～6次。

(8)过滤除菌

加入适量氢氧化钠调节pH值为6.8～7.2，用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，置2～8℃保存。

5、半成品检验

(1)无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

(2)抗体效价测定

将半成品用含2％新生牛血清的MEM作2倍系列稀释，取1:64、1:128、1:256、1:5124个稀释度分别与含200TCID50/0.1ml新型鸭呼肠孤病毒DE株病毒液等量混合，置37℃中和60分钟，每个稀释度接种已长成良好单层的LMH细胞96孔板4孔，每孔0.1ml；另设病毒对照(病毒液与含2％新生牛血清的MEM等量混合)与空白对照(含2％新生牛血清的MEM)，各接种4孔，每孔0.1ml。置37℃、5％CO2培养箱中培养5日，观察细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算其半数保护量(PD50)。病毒对照孔应全部出现CPE，空白对照孔应无CPE，能使50％细胞保护的最高抗体稀释倍数即为抗体的中和效价。中和效价不低于1:128。

6、分装

将检验合格的半成品无菌定量分装，加盖密封。

实施例6新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的检验

1、性状

本品为澄清液体。放置48小时后瓶底有少许沉淀。pH值6.8～7.2。

2、装量检查

按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。

3、无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

4、支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。

5、外源病毒检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，并用鸭胚检查法和鸭胚成纤维细胞检查法进行检验，无外源病毒污染。

6、安全检验

用1～3日龄健康易感鸭10只，每只皮下注射本品1.0ml，观察14日，结果试验鸭全部健活。用18～22g清洁级昆明鼠10只，每只皮下注射本品0.5ml，观察14日，结果试验鼠全部健活。结果表明，注射本发明所述卵黄抗体安全。

7、效力检验

(1)中和效价测定

将成品用含1％新生牛血清的乳化液作2倍系列稀释，取1:64、1:128、1:256、1:5124个稀释度分别与含200TCID50/0.1ml新型鸭呼肠孤病毒DE株病毒液等量混合，置37℃中和60分钟，每个稀释度接种已长成良好单层的SPF鸡胚成纤维细胞96孔板4孔，每孔0.1ml；另设病毒对照(病毒液与含1％新生牛血清的乳汉液等量混合)与空白对照(含1％新生牛血清的乳汉液)，各接种4孔，每孔0.1ml。置37℃、5％CO₂培养箱中培养5日，观察细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算其半数保护量(PD₅₀)。病毒对照孔应全部出现CPE，空白对照孔应无CPE，能使50％细胞保护的最高抗体稀释倍数即为抗体的中和效价。经测定其中和效价为1:128。

(2)用鸭检验

取1～3日龄健康易感鸭30只，随机分为3组，每组10只。第1组为空白对照组，不注射任何药品；第2组为抗体注射组，每只颈部皮下注射抗体0.5ml；第3组为攻毒对照组，每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。抗体注射后第5日，第2组和第3组各腿部肌肉注射新型鸭呼肠孤病毒DE株病毒液0.2ml/只(约含2×10^3.5TCID₅₀)，观察7日并剖检。

结果显示：空白对照组全部健活；抗体注射组10/10保护，剖检观察各组织脏器未见明显病变；攻毒对照组10/10出现脾脏肿大、出血或坏死等一项或以上病变。结果表明本研究制备的卵黄抗体对该病毒具有100％的保护效力。

8、辛酸残留量测定

测定结果表明辛酸残留量不高于0.10％。

9甲醛残留量测定

按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。

实施例7新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体与番鸭呼肠孤病毒卵黄抗体交叉中和试验

1、卵黄抗体制备

按照实施例5所述方法制备得到番鸭呼肠孤病毒LZ株卵黄抗体，与本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒DE株卵黄抗体进行对比，测定其中和效价。

2、分别将2种卵黄抗体用含2％新生牛血清的MEM培养基作2倍系列稀释，取1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512共8个稀释度分别与含200TCID₅₀的2种毒株的病毒液等量混合，置37℃中和60分钟，每个稀释度接种长成良好单层的LMH细胞96孔板4孔，每孔0.1ml；另设病毒对照和空白对照。置37℃、5％CO₂培养箱中培养5日，观察细胞病变。

3、结果

新型鸭呼肠孤病毒DE株卵黄抗体对DE株病毒液的中和效价达到1:150.4，对LZ株病毒液的中和效价＜1:4；

番鸭呼肠孤病毒LZ株卵黄抗体对DE株病毒液的中和效价＜1:4，对LZ株病毒液的中和效价达到1:128。

上述试验结果表明，番鸭呼肠孤病毒LZ株的卵黄抗体与新型鸭呼肠孤病毒DE株的卵黄抗体无交叉保护作用。目前国内、外均未有鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体商品化产品，利用传统的番鸭呼肠孤病毒毒株制备的卵黄抗体，对于新型鸭呼肠孤病毒并没有保护作用，因此筛选免疫原性良好的流行毒株，并以此作为抗原制备卵黄抗体，是新型鸭呼肠孤病毒病防控的关键环节。本发明分离获得的新型鸭呼肠孤病毒DE株免疫原性良好，其作为免疫抗原制备的卵黄抗体对于当前鸭呼肠孤病毒流行毒株具有显著的保护作用。

Claims (7)

1.一种新型鸭呼肠孤病毒株，其特征在于，所述的新型鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC No：V202167。

2.权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株在制备灭活疫苗中的应用。

3.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中的抗原包含了灭活的权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株。

4.权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株在制备卵黄抗体中的应用。

5.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是使用权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株作为抗原制备的。

6.权利要求5所述的卵黄抗体在制备用于预防或治疗鸭脾坏死症的制品中的应用。

7.一种用于预防或治疗鸭脾坏死症的制品，其特征在于，所述的制品包含有药理有效浓度的权利要求5所述的卵黄抗体。

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