CN106075426B - 一种小鹅瘟病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，使用的番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201620。本发明通过筛选出具有毒性小，免疫原性高的番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV‑M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染；免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，能有效预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。制备的疫苗具有高效、安全性好优点。

Description

一种小鹅瘟病毒疫苗
技术领域
本发明属于病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种小鹅瘟病毒灭活疫苗。
背景技术
鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100％死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80％。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。如果对死亡的番鸭处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。因此，就需要筛选出效价高、免疫原性好的番鸭源小鹅瘟病毒来制备疫苗。而且，由于病毒变异导致使用的疫苗效价降低，也需要筛选出变异的病毒株来制备疗效更高的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗及其应用；所提供的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。
本发明的番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，使用的番鸭源小鹅瘟病毒，为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:V201620。
其中的番鸭源小鹅瘟病毒是经过甲醛溶液灭活的；
上述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量应不低于106.50ELD50；
上述灭活疫苗的制备方法如下：
1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；
2)水相制备：将灭活的YBGPV-M株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBGPV-M株病毒含量不低于106.50ELD50；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染；免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，能有效预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。制备的疫苗具有高效、安全性好优点。
附图说明
图1：基于VP基因的YBGPV-M与国内外已公布的GPV毒株遗传进化树图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1、YBGPV-M株的筛选
2013年从福建省某鸭场的雏番鸭群中出现了以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征的疫病，发病率50％～80％，病死率45％～70％，临床上使用抗菌素、番鸭细小病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情。发明人无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，将肝脏、脾脏及胰腺用无菌生理盐水匀浆制成20％悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为106.50ELD50/0.2ml,最小免疫剂量为102.0ELD50/0.2ml，该病毒仅与小鹅瘟病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:V201620。
对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20～22nm左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65℃加热处理30min病毒滴度不受影响，37℃作用1小时仍稳定，对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番鸭源小鹅瘟病毒抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。
对筛选鉴定的YBGPV-M株的结构蛋白基因VP进行了测序,VP基因全长2199bp，编码约732个氨基酸；将其与GenBank中收录的30个GPV VP基因序列进行遗传进化树(图1)及核苷酸序列同源性分析，发现本发明获得YBGPV-M株VP基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源性介于85.9％～90.3％之间；结果表明筛选病毒的VP蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP基因存在着氨基酸差异。
实施例2制备疫苗
1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。
2.灭活将YBGPV-M株病毒液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
3.半成品检验
(1)无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
(2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。
(3)灭活检验将YBGPV-M株灭活后的病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时。
三、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。
(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备将灭活检验合格的YBGPV-M株病毒液与无菌生理盐水适当比例混合，使每0.2ml水相中含YBGPV-M株病毒含量不低于104.5ELD50。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
四、疫苗成品检验
(1)性状
外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(4)安全检验用1日龄健康易感雏番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml(左右各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(5)效力检验
①免疫攻毒法取1日龄雏番鸭20只，随机分成两组，每组10只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组10只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照组同时攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，连续观察15日，免疫组鸭均应至少8只保护，对照组鸭均应至少9只发病。
②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭1日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒YBGPV-M株，每只肌肉注射0.2ml。免疫组子代保护率应不低于8只，对照组发病率应不低于9只。
③对地方流行毒株的攻毒保护(毒株的筛选)将各地方流行毒株分别制备灭活疫苗，取90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭1日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只肌肉注射0.2ml。观察攻毒保护情况。
实施例3
一、制苗用抗原的制备
1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～168小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表1)。
表1毒液的制备
毒株名称 制苗材料 接种胚数(枚) 胚日龄 收获毒液(ml)
YBGPV-M株 番鸭胚 100 11 3400
2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
3.疫苗半成品检验
(1)无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
(2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50为106.67ELD50/0.2ml。
(3)灭活检验将病毒液尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。
二、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2)。
(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBGPV-M株病毒含量不低于106.50ELD50。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
(4)分装定量分装，加盖密封。
表2疫苗乳化和分装
Figure BDA0001021651630000061
三、疫苗成品检验
(1)性状
外观乳白色乳剂。
剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。
(2)装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。
(3)无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。
(4)安全检验用1日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml(左右各1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(5)效力检验
①1日龄雏番鸭20只，随机分成两组，每组10只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一组10只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照组同时攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，连续观察15日，结果免疫组鸭9只保护，对照组鸭10只全部发病。(见表3)。
表3疫苗效力检验结果
Figure BDA0001021651630000071
②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒YBGPV-M株，每只肌肉注射0.2ml。免疫组子代保护9只，对照组全部发病。
③对地方流行毒株的攻毒保护(毒株的选育)90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只肌肉注射0.2ml。结果表明，用YBGPV-M株制备的番鸭小鹅瘟灭活疫苗相比较其它毒株制备的灭活疫苗，能抵御各地方分离毒的攻击(参见表4)。此外，用YBGPV-M株制备的番鸭小鹅瘟灭活疫苗对于YBGPV-M株的攻毒实验表明，YBGPV-M株制备的疫苗的免疫效果最好，推测是由于YBGPV-M株基因发生变异导致的。
表4对地方流行毒株的攻毒保护
Figure BDA0001021651630000081
Figure BDA0001021651630000091
上述结果表明，本发明制备的疫苗能有效的预防目前各地流行的番鸭小鹅瘟的感染，且对于初发的抗原病毒具有更佳的免疫效果。

Claims (2)

1.一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V201620；所述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量不低于106.50ELD50。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭源小鹅瘟病毒经过甲醛溶液灭活。
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