CN102908618B - 鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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本发明涉及鸭病毒性肝炎二价疫苗的生产方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的鸭病毒性肝炎1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备菌株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。此疫苗免疫动物能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保护率高等优点。

Description

鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀和出血为特征性病变。1～3周龄的雏鸭易感，发病严重，传播迅速，雏鸭通常出现症状后的1小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率90%～95%，已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。
鸭肝炎病毒（DHV）血清型DHV有4个独立的血清型，1型、2型、3型和新型。范书才等（范书才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报,2009,10）通过试验证明目前在我国同时存在1型和新型DHV流行。血清中和试验表明，1型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个型的DHV中，1型与新型DHV流行最广泛，毒力最强；对3周龄内的雏鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行，致死率低（约20%）。
对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫，为此我们进行了鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗二价灭活疫苗的研制工作。研制结果表明，我们研制的二价灭活疫苗二价灭活疫苗效价高，安全性好，保护率高，为预防鸭病毒性肝炎病奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是制备1型和新型鸭病毒性肝炎的两种抗原，并进行合理配制成1型和新型鸭肝炎病毒油乳剂灭活疫苗，用此疫苗动物，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，此疫苗具有效价高、保护率高、安全性好等优点。
本发明所涉及的二价灭活疫苗含有鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株的灭活病毒，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。
制备该二价灭活疫苗采用的技术手段：
选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出效价高、免疫原性好制苗用毒株——鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株。
制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的主要步骤为：
用鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，经孵化、收获死亡胚胚体和胚液、研磨、冻融后收取病毒液，再经超滤浓缩、甲醛溶液灭活制成YBH1株灭活病毒液和YBHX株灭活病毒液，将其混合后加油佐剂经乳化制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。
本发明详细描述
一、生产用毒株
制苗免疫原用鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)1型YBH1株和新型YBHX株，均由本申请人2008年从山东省某鸭场病死鸭的肝脏中分离、鉴定、保管和供应。以上2个鸭肝炎病毒(duckhepatitis virus)毒株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBH1株为CGMCC No.6441，YBHX株为CGMCC No.6442。
二、疫苗（免疫原）的制备
1．制苗用病毒液的制备
（1）YBH1株毒液制备将生产用毒种YBH1株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。
（2）YBHX株毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。
2．浓缩将收获的YBH1株和YBHX株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称“现行《中国兽药典》”）规定进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。每0.2ml病毒含量均应不低于106.3ELD50。浓缩后的胚液随即进行灭活。
3．灭活分别将浓缩后的YBH1株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%（体积比）甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时）后取出，置2～8℃保存，应不超过3个月。
4．鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗半成品检验
（1）无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
（2）病毒含量测定
1）浓缩后YBH株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。
2）浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。
（3）灭活检验分别将YBH1株和YBHX株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12～13日龄易感鸭胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时。
5．灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计）。
油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 6份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
水相制备将灭活检验合格的YBH1株和YBHX株病毒液适当比例混合，使每0.2ml水相中含YBH1株和YBHX株病毒含量均不低于106.1ELD50。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相≤0.5ml。
三、疫苗成品检验
1．性状
（1）外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
（2）剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
（3）稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
（4）黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
2．装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
3．无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
4．安全检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
5．效力检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定鸭肝炎1型和新型中和抗体效价。免疫组抗体效价，应均不低于1:64，对照组应均为阴性。
本发明所涉及微生物
本发明涉及鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)YBH1株和YBHX株，以上2个毒株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBH1株为CGMCCNo.6441，YBHX株为CGMCC No.6442。
本发明的积极意义
本发明涉及鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的生产方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备菌株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。此疫苗能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，具有高效、安全性好、保护率高等优点。
实施例
实施例1
（一）疫苗（免疫原）制备：
1制苗用病毒液的制备
YBH1株病毒液制备将生产用毒种YBH1株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。
YBHX株病毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。
表1毒液的制备
  毒株名称   胚品种   接种胚数(枚)   胚日龄   收获胚液(ml)
  YBH1株   SPF鸡胚   100   10   1100
  YBHX株   易感鸭胚   100   12   1200
2浓缩将收获的YBH1株和YBHX株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。YBH1株病毒液每0.2ml病毒含量为106.3ELD50，YBHX株病毒液每0.2ml病毒含量为106.5ELD50。浓缩后的胚液随即进行灭活。（参见表2）。
表2毒液浓缩
Figure GDA00002309891300051
3灭活分别将浓缩后的YBH1株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%（体积比）甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时）后取出，置2～8℃保存。
4疫苗半成品检验
（1）无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
（2）病毒含量测定
1）浓缩后YBH株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD50，为106.3。
2）浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD50，为106.5。
（3）灭活检验分别将灭活后的YBH1株和YBHX株病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12～13日龄易感鸭胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时，鸡胚和鸭胚均无死亡。
5灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表3）。
（1）油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 6份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
（2）水相制备将灭活检验合格的YBH1株和YBHX株病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBH1株和YBHX株病毒含量，分别为106.1ELD50和106.3ELD50。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
（3）乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
（4）分装定量分装，加盖密封。
表3疫苗乳化和分装
Figure GDA00002309891300061
实施例2
——疫苗成品检验
1性状
（1）外观乳白色乳剂。
（2）剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。
（3）稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。
（4）黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为61.6cp。
2装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。
3无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。
4安全检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验鸡和对照鸡全部健活，且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。
5效力检验用28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定鸭肝炎1型和新型病毒中和抗体效价。免疫组10只鸡中1型和新型病毒中和抗体效价均有7只鸡为1:64，3只鸡为1:128，对照组5只鸡均为阴性。（参见表4）。
表4疫苗效力检验结果
Figure GDA00002309891300071
6甲醛残留量测定按现行版《中国兽药典》附录进行测定，甲醛残留量为0.07%。

Claims (2)

1.一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有鸭病毒性肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株的灭活病毒，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，所述鸭病毒性肝炎病毒1型YBH1株保藏号为CGMCCNo.6441，新型YBHX株保藏号为CGMCCNo.6442。
2.权利要求1所述鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：
（1）鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.6441、CGMCCNo.6442；
（2）用鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，经孵化、收获死亡胚胚体和胚液、研磨、冻融后收取病毒液，再经超滤浓缩、甲醛溶液灭活制成YBH1株灭活病毒液和YBHX株灭活病毒液，将其混合后加油佐剂经乳化制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。
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