CN104940921B - 一种包含鸡α-干扰素蛋白的H9亚型禽流感病毒灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含鸡α干扰素蛋白的新型H9亚型禽流感病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为含有鸡α‑干扰素蛋白和灭活的H9亚型禽流感病毒QDY1株。本发明筛选的H9亚型禽流感病毒具有毒性小，且免疫原性高的特点。本发明将H9亚型禽流感病毒(QDY株)接种鸡胚后收取病毒液，经甲醛溶液灭活后与提取纯化的鸡α干扰素蛋白混合，加油佐剂乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能刺激机体快速产生抗体，提高抗体水平，延长抗体持续期，预防H9亚型禽流感病毒引起的疾病。此疫苗具有高效、安全性好的优点。

Description

一种包含鸡α-干扰素蛋白的H9亚型禽流感病毒灭活疫苗

技术领域

本发明属于生物兽药技术领域，具体涉及一种包含鸡α-干扰素蛋白的新型H9亚型禽流感疫苗。

背景技术

H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是大肠杆菌混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。已有的禽流感(H9亚型)疫苗已在临床广泛使用，但存在抗体水平较低和抗体整齐度方面的问题，从而影响到疫苗的防治效果。

干扰素是一类由T淋巴细胞和NK细胞产生的低分子可溶性多功能糖蛋白，能增强细胞毒性T细胞功能，促进B细胞分化和活化，诱导动物细胞产生多种抗病毒、抗肿瘤活性的细胞因子，具有良好的免疫调节作用。鸡α-干扰素对某些病毒(腺病毒，流感病毒，水疱性口炎病毒等)的生长及繁殖有较强的抑制作用，可作为一种活化机体细胞的抗病毒生物制剂，同时也可作为免疫佐剂提高疫苗的保护效力。

已有的研究资料，未见鸡α-干扰素蛋白与H9亚型禽流感病毒抗原联合制备疫苗的报道。2004年贾立军等检测了表达的鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用，试验中将表达鸡γ干扰素的重组鸡痘病毒和表达禽流感HA的重组鸡痘病毒联合作为活疫苗苗使用，结果鸡γ干扰素联合免疫组的效价低于单独使用灭活疫苗的效价。(贾立军,刘秀梵,张艳梅等.鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用.农业生物技术学报[J],2004,12(4):427～430.)2009年李志中等报道了鸡γ干扰素作为单独的免疫增强剂，在新城疫活疫苗免疫前、后使用以及与疫苗同时使用的效果(李志中凌红丽等.鸡γ干扰素联合新城疫活疫苗对肉鸡免疫效果的研究.中国动物检疫[J].2009,11:37-3)。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含鸡α-干扰素蛋白的新型H9亚型禽流感疫苗,所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。

本发明的包含鸡α-干扰素蛋白的H9亚型禽流感疫苗，，包括抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒株和鸡α-干扰素蛋白。

其中H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒QDY株(Avian influenza virus)，已于2015年4月29日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201517。

其中的H9亚型禽流感病毒经过甲醛溶液灭活；

上述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含量不低于为10^6.0EID₅₀/0.3ml；鸡α-干扰素蛋白的效价为10^4.0～10^6.0单位/0.3ml。

本发明将H9亚型禽流感病毒QDY株接种鸡胚后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，再添加适当比例的鸡α-干扰素蛋白液制备抗原液，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

具体实施方式

本发明筛选出效价高、免疫原性好的禽流感毒株(QDY株)经灭活与鸡α-干扰素蛋白混合制备抗原，加入油佐剂，制备了新型的禽流感病毒灭活疫苗。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施例1、制苗用抗原毒株(H9亚型禽流感病毒QDY株)的筛选

2013年从山东城阳地区发病鸡群中，无菌采集发病鸡的心、脾等脏器和喉头、泄殖腔拭子，灭菌平皿中无菌条件下进行研碎，按1:5的比例加入含4000单位/ml双抗的生理盐水，于-20℃反复冻融3次。棉拭子直接放入含1万单位双抗的生理盐水中，2～8℃作用4h，脏器及棉拭子均3500rpm离心10min，取上清，混合后接种10日龄的SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚。鸡胚置37℃孵育，每天早晚各照检一次，及时取出死胚置4℃冰箱中保存，弃去24h内的死亡胚，至96h时取出全部鸡胚。逐胚收集鸡胚尿囊液，血凝试验检测病毒效价，连续传代3次。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^8.9EID₅₀/0.1ml，该病毒仅与H9亚型禽流感病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。

将筛选QDY株保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M201517。

对筛选的QDY株的基因HA进行测序,结果HA全长为1683bp，编码560个氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，QDY株的结构基因HA与已公开的禽流感病毒的HA存在差异位点，同源性为97.5％～98.8％；表明本发明所筛选的QDY株为一新型的H9亚型禽流感病毒株。

为了检测上述氨基酸的差异对QDY株抗原性的影响，用其来制备抗原来检测其免疫原性。

实施例2：制苗用抗原的制备

1.制苗用病毒液的制备 将生产用毒种(QDY株)经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml,36℃～37℃孵育，每日照胚2次,取24小时后死亡的鸡胚,至96小时无论死亡与否全部收获，置4～8℃冷却12～24小时,收获鸡胚液，混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2.制苗用鸡α-干扰素蛋白的制备 发酵罐通气培养，按发酵罐容积70％配制培养基，用1mol/L NaOH调节pH值至7.0～7.2，按培养基总体积0.02％加入消泡剂。灭菌后按1％～2％接种量接种生产用菌种，按总体积0.1％的比例加入10％的硫酸卡那霉素注射液，36℃培养，2.5小时后，每隔10分钟取样测OD600nm值，待菌液的OD600nm值达到0.6～0.8之间时，再按总体积0.1％的比例加入10％的硫酸卡那霉素注射液，同时加入灭菌0.5mol/Lα-乳糖溶液，使其终浓度达到0.03mol/L，诱导表达5小时。整个培养过程中通过调节进气量和搅拌速度来控制溶氧35％～50％。培养结束后，快速冷却发酵液至15℃以下。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿重加10ml生理盐水进行菌体重悬，超声波破菌，破菌时温度控制在15℃以下。在显微镜下检查破菌液，待99％以上菌体破碎后停止破菌。破碎后的菌液离心，收集上清液，硫酸铵法提取纯化鸡α-干扰素蛋白，经过滤除菌，4℃保存备用。

3.灭活 将病毒液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

4.半成品检验

(1)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)病毒含量测定 将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-95个稀释度，分别尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于2⁴，判为感染并计算EID₅₀。

(3)灭活检验 将灭活后的病毒液尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于2⁴，判为感染并计算EID₅₀。

(4)鸡α-干扰素蛋白含量检测 参照细胞病变抑制法，检测蛋白对于VSV病毒的抑制效果，计算鸡α-干扰素蛋白效价。

实施例3：

一、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备 将鸡α-干扰素蛋白使用生理盐水稀释成2×10^4.0～2×10^6.0单位/0.1ml；将灭活的H9亚型禽流感病毒液使用生理盐水稀释至不低于2×10^6.0EID₅₀/0.1ml。分别取鸡α-干扰素蛋白液和灭活的H9亚型禽流感病毒液各1份，混合配成制苗用抗原液。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

二、疫苗成品检验

(1)性状

外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(2)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(3)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

(4)安全检验 用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

(5)效力检验

①用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组抗体效价，应不低于2⁸，对照组应均为阴性。

②对地方流行毒株的攻毒保护 35日龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射疫苗，0.3ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对照组均采血测定抗体并随机分为5组，攻毒6株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射0.1ml。结果表明，用QDY株灭活病毒液和适当效价的鸡α-干扰素蛋白制备的H9亚型禽流感病毒灭活疫苗，能抵御各地方分离毒的攻击(参见表1)。

表1 对地方流行毒株的攻毒保护

③疫苗的特异性检测：

用本发明的QDY株作为病源进行攻毒实验，对象分别为免疫了目前市售的H9亚型禽流感病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的H9亚型禽流感病毒存在遗传背景上的差异。

④与未加鸡α-干扰素的灭活疫苗免疫效果比较使用鸡α-干扰素蛋白制备的H9亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.3ml/只；另1组使用未加鸡α-干扰素的灭活疫苗免疫，同样免疫剂量，于免疫后7日、14日、21日、28日、35日、42日、60日采血检测抗体。结果，使用鸡α-干扰素蛋白制备的灭活疫苗免疫组抗体出现时间早于未加鸡α-干扰素的灭活疫苗免疫组，抗体水平显著高于未加鸡α-干扰素的灭活疫苗免疫组，平均抗体最高可提高2²(详见表2)。

表2:与未加鸡α-干扰素的灭活疫苗免疫效果比较

Claims (5)

1.一种疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其特征在于，所述的抗原中含有鸡α-干扰素蛋白和灭活的H9亚型禽流感病毒株；

所述的H9亚型禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒QDY株，其保藏编号为CCTCC NO:V201517。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的H9亚型禽流感病毒经过甲醛溶液灭活。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的H9亚型禽流感病毒的含量不低于为10^6.0EID₅₀/0.3ml。

4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的鸡α-干扰素蛋白的效价为10^4.0～10^6.0单位/0.3ml。

5.权利要求1所述的疫苗，其制备方法如下：

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：

将鸡α-干扰素蛋白使用生理盐水稀释成2×10^4.0～2×10^6.0单位/0.1ml；将灭活的H9亚型禽流感病毒液使用生理盐水稀释至不低于2×10^6.0EID₅₀/0.1ml；分别取鸡α-干扰素蛋白液和灭活的H9亚型禽流感病毒液各1份，混合配成制苗用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；

3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。