CN105031638B - 一种鸡新城疫、禽流感和传染性法氏囊三联灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒株；并用该病毒株来制备鸡新城疫、禽流感三联灭活疫苗，其中抗原毒株包括H9亚型禽流感病毒QDY株(Avian，已于2015年4月29日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201517。本发明的鸡新城疫、H9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊三联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种疾病，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

Description

一种鸡新城疫、禽流感和传染性法氏囊三联灭活疫苗

技术领域

本发明属于生物兽药技术领域，具体涉及一种新型鸡新城疫、传染性法氏囊、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗。

背景技术

H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是新城疫、大肠杆菌混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。

低致病H9亚型禽流感的发生是潜在性的，分布极为广泛，危害持久和难以控制，给养禽业带来灭顶之灾，对人类的威胁同样严重。目前已有的禽流感(H9亚型)疫苗已在临床广泛使用，但存在抗体水平较低和抗体整齐度方面的问题，影响到疫苗的防治效果。而且，疫苗制造用的毒株为多年前的流行毒株，随着时间推移和环境变化，禽流感(H9亚型)临床流行毒株已经发生抗原变异，使用原有毒株制造的疫苗免疫产生的抗体，无法针对流行毒株提供完全的免疫保护，临床应用效果不佳。因此，H9N2禽流感的研究工作非常重要，迫切需要从临床上分离到免疫原性好、与现在流行毒株抗原性接近的毒株来制造疫苗，为禽流感(H9亚型)的防治奠定基础。

新城疫是一种引起禽类的以呼吸道、消化道黏膜出血为特征的高度接触性、急性败血性传染病。同时感染其他病原如H9亚型禽流感，可引起的内源性感染，将会使产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，是危害我国养禽业的主要疫病之一。

鸡传染性法氏囊病是由病毒引起的主要危害幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病，可引起严重的免疫抑制，其危害非常严重，造成较大的经济损失。本病的突出表现是鸡群突然发病，采食量锐减，死亡率增高。鸡群的饲养管理条件越差，发病年龄越小，或伴发有其他疾病，如新城疫、禽流感等，死亡率就越高。

本发明从全国各地临床发生H9亚型禽流感的养殖场分离H9N2禽流感，并对其临床流行病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好、与现有流行毒株同源性高的H9亚型禽流感病毒(QDY株)。本发明应用筛选到的新型H9亚型禽流感病毒与新城疫Lasota毒株、传染性法氏囊病毒(VP2蛋白)制备一种新型的三联灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒株；并用该病毒株来制备鸡新城疫、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病毒三联灭活疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂。

本发明的抗原毒株包括：H9亚型禽流感病毒QDY株(Avian influenza virus)，已于2015年4月29日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201517；

新城疫病毒Lasota株，来源于采用中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC AV1615；

传染性法氏囊病毒抗原是VP2蛋白，表达蛋白的菌株为E.coli BL21/pET28a-VP2，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定、保管，菌株保藏编号NO：M204038。所述的疫苗佐剂为白油佐剂。

上述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含量不低于10^7.0EID₅₀/0.3ml；新城疫病毒的含量不低于10^8.0EID₅₀/0.3ml；每0.3ml疫苗中传染性法氏囊病毒VP2蛋白的滴度(AGP效价)应≥1:16。

本发明将H9亚型禽流感病毒(QDY株)、新城疫病毒Lasota株，分别接种鸡胚后收取病毒液，同时将表达传染性法氏囊VP2蛋白的基因工程菌接种培养基后，诱导表达并提取VP2蛋白，经甲醛溶液灭活，经适当比例混合后加油佐剂混合乳化制成疫苗。

本发明的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊三联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种疾病，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

具体实施方式

本发明筛选出效价高、免疫原性好的H9亚型禽流感毒株(QDY株)，接种于10日龄的鸡胚中进行培养，收获含病毒的尿囊液灭活；采用新城疫病毒Lasota株(中国兽医微生物菌种保藏管理中心CVCC AV1615)接种于鸡胚培养，收获尿囊液灭活，将表达传染性法氏囊VP2蛋白的基因工程菌(中国典型培养物保藏中心NO：M204038)接种培养基后，诱导表达并提取VP2蛋白，经甲醛溶液灭活，将三种灭活抗原按一定比例混合，加入油佐剂，制备了新型的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊三联灭活疫苗。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1、制苗用抗原毒株(H9亚型禽流感病毒QDY株)的筛选

2013年从山东城阳地区已接种了H9亚型禽流感病毒疫苗的发病鸡群中，无菌采集发病鸡的心、脾等脏器和喉头、泄殖腔拭子，灭菌平皿中无菌条件下进行研碎，按1:5的比例加入含4000单位/ml双抗的生理盐水，于-20℃反复冻融3次。棉拭子直接放入含1万单位双抗的生理盐水中，2～8℃作用4h，脏器及棉拭子均3500rpm离心10min，取上清，混合后接种10日龄的SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚。鸡胚置37℃孵育，每天早晚各照检一次，及时取出死胚置4℃冰箱中保存，弃去24h内的死亡胚，至96h时取出全部鸡胚。逐胚收集鸡胚尿囊液，血凝试验检测病毒效价，连续传代3次。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^8.9EID₅₀/0.1ml，该病毒仅与H9亚型禽流感病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。

将筛选QDY株保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M201517。

对筛选的QDY株的基因HA进行测序,结果HA全长为1683bp，编码560个氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，QDY株的结构基因HA与已公开的禽流感病毒的HA存在差异位点，同源性为97.5％～98.8％；表明本发明所筛选的QDY株为一新型的H9亚型禽流感病毒株。

上述的结果证明筛选的QDY株符合制备疫苗的标准，用筛选的QDY株与新城疫病毒Lasota株(中国兽医微生物菌种保藏管理中心,编号CVCC AV1615)、传染性法氏囊VP2蛋白(中国典型培养物保藏中心NO：M204038)制备三联疫苗。

实施例2：鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备及检验

1.制苗用抗原液的制备

1.1禽流感(H9亚型)抗原液的制备

1.1.1禽流感(H9亚型)病毒的繁殖将毒种(QDY株)用灭菌生理盐水作20000倍稀释，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至72小时，无论死亡与否，全部取出，照胚将已死亡的鸡胚和仍健活的鸡胚分开，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

1.1.2收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价,红细胞凝集价低于1:256(微量法)者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

1.1.3灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存。

1.1.4半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)病毒含量测定将收获的病毒液(灭活前取样)用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-95个稀释度，分别尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.1ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于2⁴，判为感染并计算EID₅₀,病毒含量应不低于10^8.5EID₅₀/0.1ml。

(3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个,每个尿囊腔内接种灭活的病毒液0.2ml，每日照胚2次，观察5日，测定HA，同时收取胚液再盲传1代，观察5日，测定HA并记录鸡胚病变。结果应灭活彻底，无血凝效价。

1.2新城疫抗原液的制备

1.2.1新城疫(Lasota)病毒的繁殖将生产用毒种(Lasota株)按1：10000比例稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，照胚将已死亡的鸡胚和仍健活的鸡胚分开，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

1.2.2收获方法同上1.1.2项。

1.2.3灭活方法同上1.1.3项。

1.2.4半成品检验方法同上1.1.4项，其中灭活前新城疫病毒的含量应不低于10^8.4EID₅₀/0.1ml。

1.3传染性法氏囊VP2蛋白的制备

1.3.1菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2Mα-乳糖，使终浓度达到0.02M，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

1.3.2纯粹检验及活菌计数菌液培养完成后取样作纯粹检验及活菌计数。，按《中华人民共和国兽药典》进行。

1.3.3破菌培养结束用沉淀离心设备收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次。将收集的菌体按1克湿菌加4毫升PBS液进行重悬。在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。

1.3.4灭活将收集的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2～8℃保存，不超过7天；-15℃以下保存，不超过60天。

1.3.5半成品检验

(1)VP2含量检测按取上清液进行琼脂扩散试验。

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

实施例3：

一、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

1.油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

2.水相制备将灭活的鸡新城疫病毒胚液、H9亚型禽流感病毒胚液、传染性法氏囊VP2蛋白以适当比例混合,使每0.1ml水相中含鸡新城疫病毒量不低于10^8.0EID₅₀、H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.5EID₅₀、传染性法氏囊VP2琼扩效价不低于1：64。取灭菌后的吐温-804份，加入混合抗原液96份，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解。

3.乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

二、疫苗成品检验

1.性状

外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2.装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3.无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4.安全检验 用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射三联疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

5.效力检验

5.1 H9亚型禽流感部分效力检验

5.1.1抗体检测用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射三联疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组的抗体效价应不低于2⁸。对照组应均为阴性。

5.1.2对地方流行毒株的攻毒保护28日龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射三联疫苗，0.3ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对照组均采血测定抗体并随机分为5组，攻毒6株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射0.1ml。结果表明，用QDY株制备的三联灭活免疫后，能抵御各地方分离毒的攻击(参见表1)。

表1对地方流行毒株的攻毒保护

5.1.3与目前市售的H9亚型禽流感病毒疫苗免疫效果比较使用QDY株制备的三联灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.3ml/只；另1组使用目前市售的H9亚型禽流感病毒疫苗，同样免疫剂量，于免疫后7日、14日、21日、28日、35日、42日、60日采血检测抗体。结果，使用QDY株制备的三联疫苗的免疫组抗体水平显著高于目前市售疫苗免疫组的抗体，抗体最高可提高2²(详见表2)。

表2:与市售H9亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫效果的比较

5.14用本发明的QDY株作为病源进行攻毒实验，对象分别为免疫了目前市售的H9亚型禽流感病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的H9亚型禽流感病毒存在遗传背景上的差异。

5.2鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法和免疫攻毒法进行检验。用21日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射三联灭活疫苗0.3ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》附录进行HI抗体效价测定。记录免疫组和对照组抗体效价。同时每只鸡肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒(CVCC AV1611株)10^5.0ELD50，观察14日，记录免疫组和对照组情况。结果，使用三联灭活疫苗免疫组均能抵抗新城疫强度的攻击，保护率为100％。

表3:新城疫的攻毒保护结果

5.3传染性法氏囊部分效力检验取21日龄SPF鸡各20只，10只各肌肉或颈部皮下注射三联灭活疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，用琼脂免疫扩散试验检测IBD抗体水平。同时每只点眼攻击鸡传染性法氏囊病强毒BC6/85株毒液0.1ml(约含100个BID)。攻毒后，每日观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。结果，使用三联灭活疫苗免疫21天后，10/10抗体阳性，其中8/10的免疫鸡抗体≥1:8。将所有免疫鸡和对照鸡经点眼途径攻毒后，对照鸡9/10发病，其中1至死亡，免疫鸡均10/10无临床症状，剖检时9/10以上的鸡无肌肉出血、法氏囊肿大现象。

Claims (2)

1.一种疫苗，其特征在于，抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒株、灭活的鸡新城疫病毒株和传染性法氏囊病毒的VP2蛋白抗原；

所述的H9亚型禽流感病毒株是保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒QDY株，其在疫苗中的含量不低于10^7.0EID₅₀/0.3ml；

所述的鸡新城疫病毒株为新城疫病毒Lasota株，其在疫苗中的含量不低于10^8.0EID₅₀/0.3ml；

所述的传染性法氏囊病毒VP2蛋白的滴度≥1:16/0.3ml。

2.权利要求1所述的疫苗的制备方法，是将H9亚型禽流感病毒株、新城疫病毒Lasota株分别接种鸡胚后收取病毒液，同时将表达传染性法氏囊VP2蛋白的基因工程菌接种培养基后，诱导表达并提取VP2蛋白，经甲醛溶液灭活，经混合后加油佐剂混合乳化制成疫苗。