CN109929815A - 人造的禽副黏病毒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域。它描述了一类人造的禽副黏病毒。该人造病毒的基因组含有骨架序列（是某个禽副黏病毒的基因组序列）和流感病毒血凝素基因的部分序列（此部分序列不编码锚定到病毒囊膜的多肽）。与既往类似的人造禽副黏病毒不同，该人造禽副黏病毒不改变其囊膜结构。因此，这类人造病毒如果用作人与动物的流感疫苗（是活疫苗）毒株，能在病毒囊膜结构方面，保证这类人造病毒在被接种的动物体内正常增殖，从而保证其免疫效果。这类人造病毒的基因组除了插入流感病毒基因部分序列，还可以插入另一类别的病毒的某个蛋白质编码序列，从而使得被接种这类人造病毒的动物，针对另一类别的病毒，也产生特异性的免疫应答反应。

Description

人造的禽副黏病毒

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及人造的动物病毒，可以用作人或动物的流感疫苗毒株。

背景技术

在本发明申报前，用于人或动物流感疫苗的毒株分为自然的病毒（即非人造的病毒）、以自然的病毒为实物基础进行改造的病毒、不以自然的病毒为实物基础而制备的人造的病毒。其中，人造的病毒包括人造的禽流感病毒、人造的禽副黏病毒、人造的其他病毒。人造的禽流感病毒和人造的禽副黏病毒都已经用于中国H5亚型禽流感的防控。其中，人造的禽副黏病毒是作为家禽使用的活疫苗，用来预防H5亚型禽流感。这类活疫苗在被接种的动物体内增殖，从而诱导动物体内发生免疫应答反应。

在本发明申报前，人造禽副黏病毒技术（称为副黏病毒反向遗传操作技术）已经成熟，并广泛用于副黏病毒的基础研究和多种病毒性传染病的疫苗研究。因此，许多实验室不以自然的病毒为实物基础，不依赖于任何遗传资源，按照本说明书，都能够制造相应的禽副黏病毒。

人造的禽副黏病毒基因组含有骨架序列和外源基因序列。其骨架序列与各类自然的病毒的基因组的序列进行比对，与禽副黏病毒的基因组序列最为相似；换言之，本发明所述的人造的病毒的基因组是以禽副黏病毒基因组为骨架的。

禽副黏病毒（avian paramyxovirus）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）内各种病毒的总称。迄今，人类已经发现十余个型的禽副黏病毒，每型对应一种病毒。1型禽副黏病毒（avian paramyxovirus1或avian avulavirus 1）又称为新城疫病毒（Newcastle disease virus）。

迄今，人造的用作流感疫苗毒株的禽副黏病毒中，有些以1型禽副黏病毒基因组为基因组骨架的，有些以其他型的禽副黏病毒基因组为基因组骨架的。不以1型禽副黏病毒（新城疫病毒）的基因组为骨架，而以其他型的禽副黏病毒的基因组为骨架，插入流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）基因，而制造的禽副黏病毒，作为流感疫苗毒株，能够避免家禽体内针对1型禽副黏病毒（新城疫病毒）的母源抗体的抑制作用。

流感病毒HA基因包括编码区和非编码区，其完整的编码区包括四个部分：信号肽编码序列、HA1序列（编码HA1蛋白）、裂解位点序列、HA2序列（编码HA2蛋白）。宿主体内产生的针对流感病毒的保护性抗体大多数是结合到HA1蛋白。HA2蛋白的末端含有一段能够锚定到病毒囊膜的多肽。

禽副黏病毒的基因组是单链负股RNA，依次含有N基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，它们依次编码N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白。在本发明申报前，用作流感疫苗毒株的人造的禽副黏病毒都是在禽副黏病毒的基因组中，插入流感病毒完整的HA基因编码区。这个完整的HA基因编码区编码了锚定到病毒囊膜的一段多肽（即HA2蛋白末端一段多肽），因此该人造的禽副黏病毒所产生的HA蛋白能够锚定到病毒的囊膜上，从而改变禽副黏病毒的囊膜结构（自然的禽副黏病毒的囊膜上没有流感病毒的HA蛋白）。这种改变有可能会抑制该病毒的增殖。因此，如果这类人造病毒作为疫苗（指活疫苗）毒株，则该病毒可能在被接种的动物体内的增殖受到抑制，从而可能降低疫苗的免疫效果。

在本发明申报前，用作流感疫苗毒株的人造的禽副黏病毒都是在禽副黏病毒的基因组中，只插入一个类别的流感病毒HA基因，没有插入另一类别的病毒的某个蛋白质的编码基因。因而不能引起宿主针对另一类别的病毒，产生特异性的免疫应答反应。

发明内容

在本发明申报前，人造的用作流感疫苗毒株的禽副黏病毒都是在禽副黏病毒的基因组中，插入流感病毒完整的HA基因编码区，这类人造的禽副黏病毒所产生的HA蛋白能够锚定到病毒的囊膜上，从而改变禽副黏病毒的囊膜结构，这种改变最终可能降低这类活疫苗的免疫效果。

在本发明申报前，用作流感疫苗毒株的人造的禽副黏病毒都是在禽副黏病毒的基因组中，只插入一个类别的流感病毒HA基因，没有插入另一类别的病毒的某个蛋白质的编码基因，因而不能引起被接种的动物针对另一类别的病毒，产生特异性的免疫应答反应。

以上是本发明所要解决的两个技术问题。

本发明所述的人造的禽副黏病毒，其基因组是以某个禽副黏病毒的基因组为骨架，在这个禽副黏病毒的基因组中插入流感病毒HA基因部分序列，且该序列不编码锚定到病毒囊膜的多肽。因此它所产生的HA蛋白不会锚定到病毒的囊膜上，从而不会改变禽副黏病毒的囊膜结构，因此在病毒的囊膜结构方面，避免了抑制此病毒的增殖。这类人造病毒如果作为疫苗（指活疫苗）毒株，则该病毒在被接种的动物体内的增殖，不会因为囊膜结构发生改变而受到抑制，从而保证了疫苗的免疫效果。

本发明所述的人造的禽副黏病毒中，有些在其基因组中，除了插入流感病毒HA基因外，还插入另一类别的病毒的某个蛋白质的编码基因（也不编码锚定到病毒囊膜的多肽）。因此，该人造的病毒如果作为活疫苗毒株，能使被接种的动物针对另一类别的病毒，也产生特异性免疫保护能力。这另一类别的病毒可以是流感病毒，也可以是其他病毒。举例说来，这类人造的病毒的基因组中，除了插入H5亚型禽流感病毒的HA基因的HA1序列外，还可以插入H7亚型禽流感病毒的HA基因的HA1序列，两者可以在一个开放阅读框架下融合表达，也可以在各自开放阅读框架下独立表达。另举一例，这类人造的禽副黏病毒的基因组中，除了插入H5亚型禽流感病毒的HA基因的HA1序列外，还能插入属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）的传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）的VP2基因。

本发明所述的人造的用作流感疫苗毒株的禽副黏病毒，可以是1型禽副黏病毒（新城疫病毒），也可以是2型或其他型的禽副黏病毒。

本发明所述的人造的用作流感疫苗毒株的禽副黏病毒，其制造方法与已经报道的人造禽副黏病毒的制造方法相似，并且可以采取以下步骤：第一步，制备能够表达T7 RNA聚合酶的细胞系（以下称之为T7细胞系），制备表达禽副黏病毒N基因的质粒（以下称之为质粒N），制备表达禽副黏病毒P基因的质粒（以下称之为质粒P），制备表达禽副黏病毒L基因的质粒（以下称之为质粒L），制备包含T7 RNA聚合酶启动子和禽副黏病毒完整基因组的质粒（以下称之为质粒G，其中的禽副黏病毒基因组插入了流感病毒HA基因部分序列，有时还插入另一类别的病毒的某个基因）；第二步，将质粒N、质粒P、质粒L、质粒G共转染T7细胞系，转染后孵育一段时间（通常是数十小时；在这数十小时内，T7细胞系表达T7 RNA聚合酶、禽副黏病毒N蛋白、P蛋白、L蛋白；T7 RNA聚合酶将质粒G的禽副黏病毒基因组转录成病毒的RNA；此病毒的RNA在禽副黏病毒N蛋白、P蛋白、L蛋白作用下，启动禽副黏病毒的复制和增殖）；第三步，再将转染孵育的细胞培养液接种7到11日龄鸡胚的尿囊腔，再孵育鸡胚3日，然后收获尿囊液，其中就含有大量的所设计的人造的禽副黏病毒。此项操作技术已经成熟，并广泛用于副黏病毒的基础研究和多种病毒性传染病的疫苗研究。因此，许多实验室按照本说明书都能够制造相应的禽副黏病毒。

具体实施方式

以下用两个实施例，阐明本发明的目的、技术方案及优点。此处所描述的实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1所述的人造的禽副黏病毒是以2型禽副黏病毒的基因组为基因组的骨架。其制造采取以下步骤：第一步，制备T7细胞系（能够表达T7 RNA聚合酶），制备质粒N（能够在真核细胞内表达2型禽副黏病毒N基因），制备质粒P（能够在真核细胞内表达2型禽副黏病毒P基因），制备质粒L（能够在真核细胞内表达2型禽副黏病毒L基因），制备质粒G（质粒G包含T7 RNA聚合酶启动子，也包含2型禽副黏病毒完整基因组。该基因组插入了H5亚型禽流感病毒HA基因的信号肽序列和HA1序列以及终止密码子；插入位点在2型禽副黏病毒基因组中P基因和M基因之间；插入H5亚型禽流感病毒HA基因部分序列后，基因组中P基因、流感病毒HA基因部分序列、M基因都有自己独立的基因起始序列、起始密码子、终止密码子、基因终止序列、基因间隔序列）；第二步，将质粒N、质粒P、质粒L、质粒G共转染T7细胞系，转染后孵育数十小时；第三步，再将转染孵育的细胞培养液接种7到11日龄鸡胚的尿囊腔，再孵育鸡胚3日，然后收获尿囊液，其中就含有大量的实施例1所述的人造的禽副黏病毒。制备此人造的禽副黏病毒的技术已经成熟，并广泛用于副黏病毒的基础研究和多种病毒性传染病的疫苗研究；因此许多实验室按照本说明书都能够制造实施例1所述的禽副黏病毒。此人造病毒用作流感疫苗毒株而制备的活疫苗，接种小鸡，可以用来预防抗原匹配的H5亚型高致病性禽流感病毒的攻击。

实施例2所述的人造的禽副黏病毒也是以2型禽副黏病毒的基因组为基因组的骨架。它与本实施例1不同之处仅仅在于：将H5亚型禽流感病毒HA基因完整的编码区的HA2序列换成H7亚型禽流感病毒HA基因的HA1序列，然后将此置换后的序列（含有H5亚型流感病毒HA基因信号肽编码序列、HA1序列、裂解位点序列，以及H7亚型禽流感病毒HA基因的HA1序列）替代实施例1的H5亚型禽流感病毒HA基因部分序列，插入到2型禽副黏病毒基因组中P基因和M基因之间。实施例2所述的人造的禽副黏病毒制作步骤同本实施例1。该病毒用作流感疫苗毒株而制备的活疫苗，接种小鸡，可以用来预防抗原匹配的H5亚型和H7亚型高致病性禽流感病毒的攻击。

Claims (5)

1.人造的禽副黏病毒，其特征是该病毒同时满足以下条件：该病毒是人工制造的；该人造病毒的基因组含有骨架序列和流感病毒血凝素基因的部分序列；该人造病毒基因组的骨架序列与各类自然产生的动物病毒的基因组的序列相比，与禽副黏病毒的基因组序列最为相似；该人造病毒基因组的流感病毒血凝素基因部分序列不编码锚定到病毒囊膜的多肽；所述的禽副黏病毒（avian paramyxovirus）是2018年国际病毒分类标准所规定的副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）内各种病毒的总称，它分为若干个型，每型对应一种病毒，其中1型禽副黏病毒又称为新城疫病毒；所述的流感病毒是2018年国际病毒分类标准所规定的正黏病毒科（Orthomyxoviridae）的甲型流感病毒属（Alphainfluenzavirus）、乙型流感病毒属（Betainfluenzavirus）、丙型流感病毒属（Gammainfluenzavirus）、丁型流感病毒属（Deltainfluenzavirus）内的各种病毒的总称，其中甲型流感病毒属的病毒又分为若干亚型。

2.如权利要求1所述的禽副黏病毒，其特征是所述的人造病毒的基因组的骨架序列与各类非人造的病毒的基因组的序列相比，与2型禽副黏病毒的基因组序列最为相似。

3.如权利要求1所述的禽副黏病毒，其特征是在其基因组的流感病毒血凝素基因部分序列之前或者之后，插入另一类别病毒的一段基因序列，所插入的另一类别病毒的一段基因序列不编码锚定到病毒囊膜的多肽。

4.如权利要求3所述的禽副黏病毒，其特征是同时满足以下条件：在其基因组的流感病毒血凝素基因部分序列之前或者之后，插入另一类别流感病毒的血凝素基因部分序列，即其基因组中含有两个类别的流感病毒血凝素基因部分序列；所述的流感病毒两个类别是禽流感病毒H5亚型和H7亚型，或者是禽流感病毒H5亚型和H9亚型，或者是禽流感病毒H5亚型、H7亚型或H9亚型的两个抗原性差异较大的毒株，或者是人流感病毒H1亚型和H3亚型；所插入的血凝素基因部分序列都不编码锚定到病毒囊膜的多肽。

5.如权利要求3所述的禽副黏病毒，其特征是在其基因组的流感病毒血凝素基因部分序列之前或者之后，插入属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）的传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）的VP2基因的全部或部分编码序列，所插入的VP2基因序列不编码锚定到病毒囊膜的多肽。