TWI495724B - 流行性感冒病毒的救援技術（二） - Google Patents
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Description
流感病毒(正黏病毒科)是具有片段化基因組(Taubenberger和Layne，Molecular Diagnosis第6卷No. 4 2001)的有包膜負鏈RNA病毒。基於其核蛋白和基質蛋白之間的顯著抗原差異，將其分為兩個屬：一個屬包含A型和B型流感病毒，而另一個屬由C型流感病毒組成。所述三種病毒類型在病原性和基因組組織上也不相同。A型發現於廣泛的恒溫動物中，但B型和C型主要是人的病原體。根據血凝素(HA)和NA表面糖蛋白的抗原特徵對A型流感病毒進一步分類，所述NA表面糖蛋白是病毒體表面突出物。目前有15種HA和9種NA亞型。A型流感病毒感染廣泛的動物，包括禽類、豬、馬、人和其他哺乳動物。水生禽類充當了所有已知A型流感病毒亞型的天然儲存庫，並且可能是人大流行性流感株系的遺傳材料源。
與相關的副黏病毒不同，流感病毒具有片段化的RNA基因組。A型和B型流感病毒具有相似的結構，而C型流感病毒更具趨異性。其中A和B型病毒各包含8個分開的基因片段(各編碼至少一個蛋白)，C型包含7個分開的片段，其中合併了A和B型的片段4和6。A和B型流感病毒覆蓋有三種蛋白：HA、NA和基質2(M2)。C型流感病毒只具有一種表面糖蛋白。各流感RNA片段被核蛋白(NP)包裹以形成核糖核苷酸核蛋白(RNP)複合體。三個聚合酶蛋白與RNP複合體的一個末端結合。RNPs被具有基質蛋白(基質1)的膜包圍。所述膜的磷脂部分來源於細胞宿主的膜。在病毒顆粒內部也發現了非結構性蛋白2(NS2)。針對流感病毒的命名系統，世界衛生組織(WHO)的指導方針如下。首先，指出病毒類型(A、B或C)，然後是宿主(如果是非人類)、分離的地方、分離的編號和分離的年份(通過斜扛分隔)。對於A型流感病毒，在括弧內注明HA和NA亞型。例如，包含於最近的2000至2001季度的三價疫苗的株系是：A/Panama/2007/99(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)和B/Yamanashi/16/98。自1977年以來，已有兩種A型亞型流感病毒H1N1和H3N3在人中共迴圈。
流感病毒在複製期間積累了點突變，因為其RNA聚合酶複合物不具有校正活性。改變表面糖蛋白抗原部分的氨基酸的突變可能為病毒株系提供選擇性的有利方面，以允許其避開已存在的免疫性。HA分子通過結合某些宿主細胞上的受體啟動感染。抗HA蛋白的抗體阻止受體結合並且非常有效地阻止相同株系的再感染。通過抗原性飄移或抗原性轉變，HA可逃避之前已獲得的免疫性，在所述抗原性飄移中，當前迴圈的HA基因的突變干擾了抗體結合，而在抗原性轉變中，所述病毒獲得了HA新亞型。在HA分子中，抗原性飄移壓力是不均等的，正選擇變化主要發生在HA蛋白的球狀頭部。在HA中，這些變化積累的程度也超過NA中積累的程度。在其他流感蛋白中變化的發生更加緩慢。同樣，在人適合的流感株系中抗原性飄移壓力是最大的，在豬和馬適合性株系中抗原性飄移壓力居中，在禽類適合性株系中抗原性飄移壓力是最小的。
因為流感病毒具有片段化的基因組，所以在相同的宿主中用兩種不同的株系共感染可導致新的重排流感病毒株系的產生，所述重排株系包含親本基因片段的不同重組。已知在野生鳥類中存在15種HA亞型，其提供了新的人HAs源。通過抗原性轉化在人迴圈中出現的具有新亞型的流感株系曾經是過去的1957和1968年中兩次流感大流行的原因和很可能是1918年流感大流行的原因。與所有已知的有關大流行流感病毒出現相關的一致，大流行株系必須具有在抗原性上不同於當前流行的HA的HA；該HA不能已在人中迴圈60-70年；並且所述病毒必須可在人與人之間傳染。1957年和1968年中，大流行是由於HA轉化導致的，在這兩種情況下，大流行株系的HAs與禽類株系緊密相關。儘管大流行的一個必要條件是HA必須改變，但病毒的其餘部分可以或必須改變的程度是未知的。只能獲得1957和1968年的大流行病毒用於直接研究，1918年的大流行流感病毒可通過使用分子考古學來進行表徵。在1957年，三個基因：HA、NA和聚合酶複合物(PB1)的亞基被鳥類樣基因替換。在1968年，只有HA和PB1被替換。
可通過病毒分離、血凝素抑制(HI)檢測、通過免疫測定進行的抗原檢測、血清學檢驗、分泌物中NA活性的驗證或基於分子的測定法進行流感感染的特異性診斷。可將唾液、鼻咽抹拭物或用緩衝鹽水溶液漱洗的鼻咽洗出液作為樣品進行收集。流感診斷的標準曾經是培養後進行免疫學表徵。血清學分析提供了精確的但溯及以往的用於流感感染的方法，因為其要求收集急性的和康復期的血清。
流感病毒可培養在含胚雞蛋或許多組織培養系統中。胰蛋白酶(用於HA的切割啟動)的加入允許流感病毒在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞和其他細胞系中增殖。用於疫苗生產的主要方法仍是在蛋中培養流感病毒。細胞系中的培養通常用於初級的人流感病毒(A型和B型)分離。許多人流感病毒可直接在含胚蛋的尿囊腔中培養。一些A型和B型流感病毒要求在羊膜腔中進行初始培養，然後再適應在尿囊腔中培養。在培養分離後，使用免疫測定法或免疫熒光最後確定大部分流感分離株。流感病毒的HA分子結合呼吸細胞表面上的唾液酸殘基以使病毒進入。
通過利用流感病毒在體外凝集紅細胞的能力在抗原性上表徵流感株系。抗HA抗體可抑制凝集。因此，血凝抑制(HI)測定法是用於表徵流感株系的一個標準方法。HI測定法用於確定樣品株系是否是與最近的疫苗株系免疫學相關(即，交叉反應的)的。將確定的血清類型(通常在白鼬中產生的)以兩倍稀釋的系列加入小孔中，然後實驗室工作人員通過觀察懸浮的與凝聚成團的紅細胞的比值來給測定小孔打分。在大多數情況下，成組的血清用於將樣品株系與疫苗和參照株系匹配，在任何給定的流感活動期，通過HI測定法，絕大多數樣品株系被成功地匹配。
在鑒定單個病毒株系的抗原特徵上，WHO提供了指導方針，WHO合作中心也提供了指導，並且可為希望獲得其的機構提供這些株系。根據免疫學系譜可對樣品株系進行分類，例如A/Moscow/10/99(H3N2)樣、A/New Caledonia/20/99(H1N1)樣和B/Beijing/184/93樣病毒。對於在HI測定法中未能表徵的樣品株系，實驗室工作人員必須將其接種到白鼬中以產生株系特異性抗血清。當準備好新的抗血清後，如上所述再次進行HI測定。如果新的血清在交叉反應性上顯示顯著的差距(通常定義為樣品和疫苗株系之間的4倍差異)，那麽將其合併入常規的實驗室組中並用於尋找新的流行性株系。因此，HI測定法在用於疫苗株系選擇的流感病毒監視努力中是極其重要的並且是估計抗原性飄移最普遍使用的方法。
通過單個基因片段的序列比較可從遺傳上表徵流感株系，WHO指導方針和WHO合作中心對包含流感病毒基因組的單個RNA片段的性質的鑒定提供了指導；也提供指導鑒定下列的性質：A型和B型流感病毒核酸片段，編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)；和C型流感病毒核酸片段，編碼核蛋白(NP)、鹼性聚合酶1(PB1)、鹼性聚合酶2(PB2)、血凝素-神經氨酸酶樣糖蛋白(HN)、基質蛋白(M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)。
如果需要參照株系，例如用於抗原性分析、核酸序列比較和鑒定疫苗病毒，可求助於位於45 Poplar Road，Parkville，Victoria 3052，澳大利亞(傳真：+61 3 9389 1881，網址：http//www.influenza centre.org)的WHO流感鑒定和研究合作中心；WHO流感鑒定和研究合作中心，國家傳染病研究所，Gakuen 4-7-1，Musashi-Murayama，東京208-0011，日本(傳真：+81 42 5610812或+81 42 5652498)；WHO監視、流行病學和流感控制合作中心、疾病控制和預防中心，1600 Clifton Road，Mail stop G16，亞特蘭大，GA 30333，美國(傳真：+1 404 639 23 34)；或WHO流感鑒定和研究合作中心，國家醫學研究所，The Ridgeway，Mill Hill，倫敦NW7 1AA，英國(傳真：+44 208 906 4477)。在WHO的網站http：//www.who.int/influenza
和地理資訊系統,FluNet，http：//www.who.int/flunet
上可獲得更新的流行病學資訊。
對流感的影響和其預防的健康和經濟利益的意識在不斷地增長，過去十年已看到接種的用途和益處，並且產生了大量的抗流感藥物。在許多國家，由於更長的預期壽命的原因，更多的人處於並發症的風險中，在流感大流行期間健康保健系統的負擔受到更廣泛的承認，更頻繁的國際旅行已為病毒的傳播提供了機會，同時新的藥物的引入已增加了預防和治療疾病的選擇。大約50個國家具有政府資助的國家流感免疫專案，並且所述疫苗在許多其他國家是可獲得的。疫苗應用的特定推薦是可變的，但通常包括對年長的和超過6個月大的個體每年進行免疫，所述個體由於已存在的慢性醫學狀況的原因，處於增加的嚴重疾病的風險中。在一些國家，疫苗用於減少流感對處於增加的醫學風險的人的傳播。成員國家需要考慮流感預防工作在其全體公共衛生優先背景中的利益。
滅活的疫苗分為幾種類型，視其是否包含完整的病毒顆粒、部分破壞的病毒顆粒(分裂疫苗)或純化的包膜抗原(亞基疫苗)而定。一些亞基疫苗已和佐劑或遞送系統結合。
少數國家已批准針對某些靶群體的活的減毒流感疫苗。在俄羅斯聯邦，一種疫苗的兩種不同製劑已用於健康的成人和孩子中，並且另一種活疫苗已進行廣泛的測試但仍未被批准。在活的減毒疫苗能更廣泛地獲得之前，其通常不會被推薦用於流感預防。
已發展了兩類抗病毒劑用於預防和治療流感。M2抑制劑，即金剛烷胺和金剛乙胺，被限定用於治療A型流感病毒並且據報道在流感預防方面也是有效的。然而兩種藥物都導致一些副作用，在使用金剛烷胺的情況下，更容易產生顯著的神經學上的副作用。神經氨酸酶抑制劑，例如紮那米韋和奧塞米韋，在許多國家近來被批准用於治療A型和B型流感，並且已報道在預防方面是有效的。在接受這兩類抗病毒劑的患者中已檢測到抗性突變體。儘管目前並不認為這是個重要的公共衛生問題，但當這些藥物在非常大的規模上使用時，情形將發生變化。
WHO維持著由位於82個國家的110個國家流感中心以及位於亞特蘭大(美國)、倫敦(英國)、墨爾本(澳大利亞)和東京(日本)的4個WHO流感鑒定和研究合作中心合作運行的國際監視專案。這些中心為具有大流行潛能的新出現的株系提供早期預警系統。該系統非常重要，因為如果流感疫苗不包含目前迴圈的株系那麽其功效將會降低。WHO發佈疫苗組合物的推薦組合物，如可在由世界衛生組織出版的Weekly Epidemiological Record(例如參見2004，79，第9期，第88頁或http：//www.who.int/wer
)中查到的，在二月份用於北半球的疫苗和在九月份用於南半球的疫苗。由於在赤道地區的流感季節模式還不明確，流行病學因素將影響這些推薦疫苗(二月或九月)中何種疫苗適合用作用於赤道國家的疫苗。
所述合作中心對國家中心提供的流感分離株系進行抗原和遺傳分析。當觀察到抗原變異的迹象時，將該變異與流行病學資料進行比較以估計變體的流行病學重要性。通過使用成組的在接種之前或之後收集的人血清，將代表性的分離株與當前的疫苗株系進行比較，從而估計目前的疫苗是否預期能抵抗這些病毒。根據WHO公開的每年的推薦疫苗，培育了高生長速率的株系並作為參照病毒提供給生產者以幫助產生用於疫苗生產的種子病毒。流感疫苗的安全性和功效檢測包括病毒的滅活、微生物滅菌、用於破壞所述病毒的化學物質的測量和推薦的抗原的濃度確定。一般推薦疫苗要遵照WHO的要求，然而，國家控制機構應當批准用於各國的特異性疫苗病毒。國家公共衛生機構負責有關疫苗使用的推薦。WHO也公開了用於預防流感病毒感染的推薦疫苗。(參見WER No. 35，2002，pp. 281-288.)。
在含胚雞蛋中生產流感疫苗已超過50年，但近來在發展用於疫苗生產的細胞培養系統上作出了大量的努力。含胚雞蛋中的常規標準方法學非常繁瑣並且具有一些主要的不利方面：需要數百萬的雞蛋；在美國每個季度超過100萬個雞蛋，雞蛋必須單個地接種和收穫；要求許多過濾和離心步驟進行繁瑣的純化以確保疫苗不含卵蛋白，從而最大限度地減小過敏的風險；要求許多難以自動化並且非常費力的生產步驟，更不用說費時和遭受污染。
因此在工業上長期存在對發展疫苗生產技術的需求，所述生產技術證明要優於目前的疫苗生產技術，即，通過發展利用特異性細胞系的生產方案以取代現有的疫苗生產方法學，所述細胞系能夠支援流感病毒生長並適合在自動化的生物反應器中、在生物載體上或在其他細胞培養系統中生長。
通常，良好表徵的傳代細胞系，例如VERO細胞或其他靈長類動物來源的細胞，被建議用於流感病毒疫苗的生產。然而，註冊機構今天仍回避用於人用途的靈長類動物細胞中生產的疫苗。越來越多地，這些機構建議所有來自靈長類動物細胞(例如Vero)的產品不含有殘留的完整細胞並且對在這些細胞中生產的產物中的殘留材料(例如靈長類動物細胞DNA)水平表示持續的關注。儘管世界衛生組織(WHO)目前接受在腸胃外施用時每劑10ng來自傳代細胞系的殘留DNA的限定，但基於個案基礎，註冊機構仍要考慮由殘留的靈長類細胞材料例如DNA施加的風險水平。
長期以來，由於缺少可獲得的有效的反向遺傳學系統，阻礙了A型流感病毒的基礎研究。儘管事實上發展了最早的針對A型流感病毒的用於負鏈RNA病毒的反向遺傳學技術，但只有到最近才實現從重組DNA中專門地拯救出該病毒。重組流感病毒通過用成組的八個質粒(各基因組病毒RNA(vRNA)片段通過RNA聚合酶I從所述質粒轉錄)和成組的四個額外的表達核蛋白(NP)和聚合酶蛋白PB1、PB2和PA的質粒轉染真核細胞產生。據報道使用該12-質粒系統的病毒生產效率相對較低。當編碼血凝素(HA)、神經氨酸酶(HA)、基質蛋白1和2(M1和M2)和非結構蛋白2(NS2)的5個額外質粒共表達時，上清液中病毒的滴度可增加。這些12和17-質粒系統的簡潔修飾是提供雙向載體將轉染的質粒數目減少至8個。使用該系統後，可從同一質粒中合成負鏈vRNA和正鏈mRNA。
產生重組A型流感病毒的能力促進了未來流感病毒的研究，然而，由於絕大部分(如果不是全部)用於疫苗生產的細胞系統由於聚合酶(參與逆向遺傳學系統)和最常用的細胞種類之間的不相容性導致不允許或僅極少量允許上述重組病毒的複製，還未發現使用重組A型病毒以充分地提高疫苗產品滴度的實際解決方案，所述重組A型病毒通過逆向遺傳學技術獲得。
A型流感病毒是負鏈RNA病毒。這意味著在一輪複製周期中，產生三種類型的RNA：反義vRNA、有義cRNA和有義mRNA。與病毒RNA(vRNA)不同，mRNA被加帽並且具有poly(A)尾巴。mRNA的poly(A)尾巴的第一A殘基與基因組中的U殘基短片段匹配，所述U片段被認為是轉綠終止/聚腺苷醯信號。據認為，當聚合酶到達該U殘基片段時，其進行相反方向滑動的重復迴圈並通過這種方式產生完整的mRNA poly(A)尾巴。
本發明提供了能夠應用於不同物種的細胞類型的用於流感病毒的反向遺傳學系統。聚合酶I是轉錄核糖體RNA的核仁中的酶並且在正在生長的細胞中大量表達。rRNA，與vRNA相似，不具有帽和poly(A)尾巴，因此聚合酶I可用於從cDNA產生vRNA。通過聚合酶I的病毒cDNA的轉錄允許產生具有正確5’和3’末端的病毒樣RNAs。然而，儘管聚合酶II的轉錄機器通常與來自不同物種的基因相容，但聚合酶I轉錄表現出嚴格的(儘管不是絕對的)種特異性。該種特異性是由轉錄因數與啟動子之間的相互作用和在較低的程度上由所述因數間的蛋白-蛋白相互作用提供的。基於聚合酶I的反向遺傳學系統的種特異性是疫苗發展的主要不利方面，因為除了人以外的細胞種類的聚合酶I啟動子例如犬類或禽類的聚合酶I啟動子還未曾被描述，而在工業上，良好確定的犬類(即Madin Darby犬腎(MDCK)細胞)或禽類細胞(雞胚胎成纖維細胞(CEF))通常用於流感病毒疫苗生產。
本發明提供了包含流感病毒基因片段和噬菌體聚合酶啟動子的核酸或所述核酸的互補鏈。與Neumann和Kawaoka(Virology 287，243-240，2001)的發現相反，本發明為該基於噬菌體聚合酶的反向遺傳學技術學在有關質粒載體和其包含的元件方面提供了顯著的靈活性，所述發現表明：與非片段病毒相反，所述非片段病毒明顯例外地是流感病毒，其中T7聚合酶被認為不起作用，除了來自克隆的cDNA的聚合酶和核蛋白外，其產生包括八個病毒RNAs的增加的合成複雜性。例如，我們使用噬菌體T7的RNA聚合酶產生vRNA或cRNA樣RNA分子，但也可使用各種其他的RNA聚合酶例如噬菌體SP6 RNA聚合酶。在優選的實施方案中，本發明提供了包含流感基因片段和T7啟動子的核酸或所述核酸的互補鏈，從而允許我們將本發明的系統建立在於T7啟動子的控制之下的流感病毒基因片段的表達的基礎上。在一個實施方案中，缺少聚合酶終止子。優選地，在緊鄰啟動子之後給所述核酸提供了一個或兩個額外的鳥嘌呤殘基。為了疫苗目的，提供了根據本發明的核酸，所述核酸包含來源於流感病毒的基因片段，所述病毒是由WHO推薦用於疫苗目的的病毒。在優選的實施方案中，本發明提供了A型流感病毒的基因片段和T7啟動子的核酸或所述核酸的互補鏈。特別是在雙向系統中，優選地，根據本發明的核酸不包含T7終止子。因為所述聚合酶優選地表達自與表達所述病毒的質粒一起轉染的質粒，此處提供的系統並不限定於特定物種。儘管基於T7聚合酶的反向遺傳學系統有時用於非片段負鏈病毒的拯救，但基於噬菌體聚合酶技術的片段化流感病毒的反向遺傳學系統之前從未被成功地利用過。有時試圖通過在轉錄起始位點引入G殘基以增強T7聚合酶驅動的轉錄來克服使用T7聚合酶轉錄cDNA的反向遺傳學系統中的一個限制因素。該方法已用於例如RV、VSV和SV的拯救，然而，Zobel等人(Virology. 1994 Jul;202(1)：477-9；Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11;21(16)：3607-14)明確指出需要精確地確定A型流感基因片段的5’和3’以使病毒聚合酶正確地發揮作用；因此明顯地在轉錄位點無空間加入額外的核苷酸，從而與在轉錄起始位點引入G殘基衝突。然而，令人驚奇的是，在本發明優選的實施方案中，我們提供了根據本發明的核酸，在所述核酸上，在緊接著T7啟動子的位置至少提供了至少一個額外的鳥嘌呤殘基。甚至更優選地，在緊接著T7啟動子之後提供了兩個額外的鳥嘌呤殘基。此外，本發明還提供了具有T7聚合酶的Madin Darby犬腎(MDCK)或雞胚胎成纖維(CEF)細胞。特別地，本發明提供了具有至少一個根據本發明的核酸的細胞。本發明有助於多質粒系統例如17-質粒或12-質粒或8-質粒系統的使用，並且，因為本發明提供了具有根據本發明的核酸的細胞，所述核酸額外地被提供以T7聚合酶，所述核酸優選地表達自與一個或多個能夠表達根據本發明的流感病毒基因片段的質粒一起轉染的質粒，因此所述系統不限定於特定物種。此處也提供了根據本發明的細胞的用途，其中所述T7聚合酶包含細胞核定位元信號。在優選的實施方案中，此處提供的細胞是非靈長類動物細胞，因此避免了將靈長類動物DNA引入來源於根據本發明的核酸或細胞的細胞材料或疫苗中。優選地，使用MDCK細胞或CEF細胞。本發明的有利方面是反向遺傳學系統不需要輔助病毒，所有通過轉染提供的病毒顆粒包含想要的核酸並且可被使用而不用在隨後的疫苗生產系統中建立克隆步驟。本發明也第一次提供了包含根據本發明的核酸的複製型病毒顆粒。在美國5,166,057中，還未提供這種能夠複製的病毒顆粒，在本發明之前，其他試圖將T7系統用於片段化流感病毒的努力也未獲成功。如此處提供的具有大約104
病毒滴度的病毒顆粒的細胞培養組合物可在經轉染的細胞培養物中在無病毒複製的情況下容易地獲得，當病毒複製時所述細胞培養物的病毒滴度可被提高至>107
。在無輔助病毒的情況下實現根據本發明的顆粒的複製特別有用。這種細胞培養組合物可有利地用於生產藥物組合物，所述細胞培養組合物包含細胞或來源於本發明細胞的材料或者病毒或來源於本發明病毒顆粒的材料，所述藥物組合物用於產生抵抗流感病毒感染受試者的免疫學保護作用。可以肯定的是，在美國5,166,057中還未提供如此處提供的這些細胞。因此，本發明也提供了用於生產複製型流感病毒顆粒的方法，所述方法包括培養具有至少一個根據本發明的核酸的細胞。優選地，用於所述方法的至少一個核酸包含至少一個，但優選地7或8個流感基因片段和噬菌體聚合酶啟動子或所述核酸或酸的互補鏈。更優選地，所述片段不包含噬菌體聚合酶終止子，由此有利地該片段在緊接著啟動子的位置被提供以至少一個額外的鳥嘌呤殘基，或在緊接啟動子的位置被提供以二個額外的鳥嘌呤殘基。優選地，所述片段來源於由WHO推薦的用於疫苗目的的流感病毒，例如A型流感病毒的基因片段。最後，本發明提供了可用上面公開的方法獲得的複製型流感病毒顆粒。因此本明也提供了用於產生抗流感病毒對受試者感染的免疫保護的方法，所述方法包括為有此需要的受試者提供此處提供的組合物。將該組合物優選地配製為疫苗，即，通過將病毒顆粒或來源於該顆粒的病毒蛋白(亞基疫苗)與恰當的藥物載體例如鹽溶液或佐劑(例如，鋁鹽或其他普遍使用的賦形劑(參見例如http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf
.))混合。
本發明係為一種包含流感基因片段和噬菌體聚合酶啟動子的核酸或所述核酸的互補鏈。
本發明亦為一種被提供以至少一個上述核酸的細胞。
本發明又為一種病毒顆粒，包含上述核酸。
本發明又為一種被額外地提供以噬菌體聚合酶的細胞。
本發明又為一種組合物，包含上述細胞或來自上述細胞的材料或來自上述病毒顆粒的病毒或材料。
本發明係為一種用於產生抵抗流感病毒感染受試者的免疫學保護作用的方法，其包括為有此需要的受試者提供上述組合物。
本發明又為一種上述組合物用於生產藥物組合物的用途，所述藥物組合物用於產生抵抗流感病毒感染受試者的免疫學保護作用。
本發明亦為一種麥丁達比(Madin Darby)犬腎(MDCK)或雞胚成纖維(CEF)細胞，其被提供以噬菌體聚合酶，較佳為T7聚合酶。
第1圖，用於基於T7pol的反向遺傳學系統的構建體。克隆策略的詳述參見說明書。
第2圖，用編碼GFP小基因組(0.6μg)、T7pol(0.6μg)和A型流感病毒聚合酶基因(各1μg)的構建體轉染的293T細胞的FACS分析。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。在X軸上，顯示以有義(S)和反義(AS)方向排列的被轉染的GFP小基因組構建體，並標明額外G核苷酸的數目。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第3圖，經轉染的293T細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組、4μgA型流感病毒聚合酶構建體、和0.6μg野生型T7pol(C)、含有核定位元信號(N)的T7 pol或以1：1比例(C/N)的兩種構建體來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。
第4圖，經轉染的293T或BSR-T7細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的GFP小基因組的構建體和4μg A型流感病毒聚合酶構建體來進行轉染。顯示了細胞的GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。用或不用表達T7pol的質粒轉染細胞，所述聚合酶含有核定位元信號(293T和293T N比較或BSR-T7和BSR-T7 N的比較)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第5圖，經轉染的293T細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組(AS-2G)或有義GFP小基因組(S-0G)的構建體和0.6μg表達具有核定位元信號的T7pol的質粒和4μg表達A型流感病毒聚合酶基因的質粒來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第6圖，經轉染的293T和MDCK細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組(AS-2G)的構建體、0.6μg表達具有核定位元信號的T7pol的質粒和4μg表達A型流感病毒聚合酶基因的質粒來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分的GFP表達水平(平均熒光強度)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
實施例1
使用基於T7 RNA聚合酶的反向遺傳系統產生重組A型流感病毒
導言
長期以來，由於缺少可獲得的有效的反向遺傳學系統，阻礙了A型流感病毒的基礎研究。儘管事實上發展了最早的針對A型流感病毒(7，18)的用於負鏈RNA病毒的反向遺傳學技術，但只是到最近才實現從重組DNA中專門地拯救該病毒(9，20)。
A型流感病毒是負鏈RNA病毒。在病毒複製周期中，產生三種類型的RNA：反義基因組病毒RNA(vRNA)、與基因組RNA互補的有義RNA(cRNA)和有義信使RNA(mRNA)。儘管vRNA和cRNA基本上不含修飾的末端，但mRNA被加帽並且具有poly(A)尾巴(16)。
RNA聚合酶I是轉錄核糖體RNA(rRNA)的核仁中的酶並且在正在生長的細胞中大量表達。與vRNA相似，rRNA不具有帽和poly(A)尾巴(23)。Hobom和同事成功地使用PolI產生具有精確的5’和3’末端的人工流感病毒vRNA樣片段。在PolI啟動子-終止子盒背景中克隆的cDNA的轉錄允許產生具有正確的5’和3’末端的vRNA樣分子(29)。隨後的涉及輔助流感病毒的研究證明這些基因組vRNA分子可被識別並且通過流感病毒聚合酶複合體進行複製並被包裝入後代流感病毒中。該系統允許產生流感病毒，所述流感病毒包含其中一個病毒基因片段內的突變或額外的基因片段，因此允許對病毒基因和其產物進行研究。作為使用輔助病毒的結果，要求選擇轉染子病毒，這是非常麻煩的。
Neumann等人設計了用於從克隆的cDNA(20)完整地回收A型流感病毒的PolI系統。將編碼A型流感病毒的全長vRNAs的cDNAs克隆入人PolI啟動子和小鼠PolI終止子之間。原則上，將這8個質粒導入真核細胞應當導致所有8個流感vRNAs的合成。用這8個vRNA表達質粒和表達病毒核蛋白以及來自RNA聚合酶II(PolII)啟動子控制下的聚合酶蛋白PB2、PB1和PA的質粒共轉染人胚胎腎細胞(293T)。由細胞PolI合成的vRNAs被包裝入RNPs並且可以每ml(pfu/ml)上清液超過1x103
蝕斑形成單位的感染性病毒的量回收。用表達其他病毒結構蛋白的質粒共轉染導致病毒產量的顯著增加，即3x104
至5x107
pfu/ml(20)。Fodor等人報道了相似的用於回收A型流感病毒(9)的系統。該系統依賴於8個編碼所有8個vRNA cDNAs的質粒，所述cDNAs在側翼連接人PolI啟動子，但其包含δ型肝炎病毒核酶(HδVrib)序列而非PolI終止子序列。這些質粒與四個表達2型腺病毒主要晚期啟動子控制下的PB1、PB2、PA和NP蛋白的質粒共轉染Vero細胞。通過使用等量的各表達質粒，Fodor等人報道了從106
經轉染的細胞(9)中獲得1-2個感染性病毒顆粒的拯救率。我們已設計了相似的反向遺傳學系統來產生重組流感病毒A/PR/8/34。我們得出在經轉染的細胞培養物中在無病毒複製的情況下可獲得大約104
的病毒滴度，當病毒複製時，所述病毒滴度可提高至>107
(4)。因為這些PolI驅動的系統要求12-16個質粒的共轉染，因此使用可高效轉染的細胞系是有效地生產重組病毒所必需的。
後來，Hoffmann等人發展了用於產生僅來自8個質粒(12)的A型流感病毒的雙向PolI-PolII轉錄系統。在該雙向系統中，將vRNA cDNA插入在人PolI啟動子和小鼠PolI最小終止子序列之間。將該完整盒插入PolII啟動子和多聚腺苷醯位點之間。這使得可以從單個構建體中分別轉錄來自PolI和PolII啟動子的vRNA和mRNA。8個PolI-PolII質粒(各編碼一個A型流感病毒基因片段)在和Madin Darby犬腎(MDCK)細胞共培養的293T細胞中的共轉染導致感染性A型流感病毒的回收，產量高達2x107
pfu/ml上清液(12)。mRNA和vRNA的合成都使用一個模板，這減少了要求用於病毒產生的質粒數目。據報道在該系統中病毒產生的效率與單向(12-16質粒)PolI系統中的效率相似。
儘管PolII啟動子通常與來自不同種類的轉錄機器相容，但來自PolI啟動子的轉錄表現嚴格的(儘管不是絕對的)種特異性。該種特異性是由轉錄因數與啟動子之間的相互作用和在較低的程度上由所述因數間的蛋白-蛋白相互作用提供的(23)。
基於PolI的反向遺傳學系統的種特異性形成了主要的不利方面。上述的反向遺傳學系統使用了人PolI啟動子，從而將重組病毒的產生限制在靈長類動物來源的細胞例如293T細胞或Vero細胞中。儘管對幾種物種包括人、小鼠、大鼠和豬(8，14，17)的PolI啟動子已進行了表徵，但對其他許多物種仍不瞭解。犬和禽類細胞常規地用於A型流感病毒的研究和疫苗生產中，但犬和禽類PolI啟動子仍未得以描述。為提高流感病毒反向遺傳學技術的靈活性，我們試圖發展通用的反向遺傳學系統。我們已選擇設計基於在噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子(pT7)控制之下表達A型流感病毒的基因片段的系統。因為可通過轉染或通過使用穩定修飾的細胞系將噬菌體T7 RNA聚合酶(T7pol)提供給細胞，所以該系統並不被限定於來自特定物種的細胞。
將基於T7pol的反向遺傳學系統用於拯救非片段化負鏈病毒。Schnell等人第一次從克隆的cDNA(27)中單獨地拯救出非片段化負鏈病毒。製備編碼狂犬病毒(RV)的全長反基因組RNA的cDNA克隆。該cDNA在緊接著T7pol終止子序列(tT7)的位置側翼連接pT7和HδVrib序列。通過T7pol轉錄後，通過所述HδVrib序列在3’末端的自溶性切割產生精確的基因組3’末端。將該質粒和編碼在pT7控制下的病毒N蛋白以及聚合酶L和P蛋白的質粒共轉染入表達T7pol的細胞中。該方法導致重組RV的拯救，但只從大約2x107
個經轉染的細胞(27)中拯救出一個。其後，曾描述過用於副黏
病毒科、彈狀病毒科和非片段NSV的線狀病毒科家族(10)的類似系統。
為了成功地回收來自cDNA的非片段負鏈病毒，通常產生有義反基因組RNA(cRNA)而非反義vRNA。據認為，裸露的反義vRNA和編碼病毒蛋白的有義mRNA的同時存在將導致雜交，阻止了基因組裝配成核糖核蛋白複合體(RNPs)(27)。負鏈病毒通常不會遭遇這種問題，因為其總是以RNP形式保持其基因組，所述形式防止了雜交。已報道了用編碼反義基因組RNA的cDNA回收仙台病毒(15)、人3型副流感病毒(6)和人metapneumovirus(11)；然而，效率顯著低於通過用有義RNA獲得的結果。該原理也已用於重組流感病毒的拯救。Hoffmann等人(13)也確定了來自反基因組有義RNA的重組流感病毒生產的效率。與只在細胞質中複製的非片段化和片段化負鏈病毒相反，A型流感病毒可從基因組和反基因組載體中拯救，並且具有相似的效率。
使用pT7的病毒拯救系統中的一個限制因素是在+1至+3位點的殘基可影響轉錄。據觀察，通過在pT7(22)的下游直接導入2或3個G殘基可增加cDNA的轉錄。該觀察結果已用於例如重組RV(27)、水皰性口炎病毒(28)、呼吸道合胞病毒(3)和人metapneumovirus(11)的拯救。很明顯，對於這些病毒，在基因組的一個末端加入G殘基不會影響病毒複製但對T7pol驅動的轉錄具有正效應。
基於T7pol的系統已廣泛地用於流感病毒的反向遺傳學研究(18)，但基於質粒的重組流感病毒的生產至今仍未得以描述。此處我們第一次描述了這種用於重組流感病毒生產的基於T7pol的反向遺傳學系統。
材料和方法
細胞和病毒
將Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞培養在含有10% FCS、100 IU/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、2 mM穀氨醯胺、1.5 mg/ml碳酸氫鈉、10 mM Hepes和非必需氨基酸的EMEM(BioWhittaker)中。將293T細胞培養在含有10% FCS、100 IU/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、2 mM穀氨醯胺、1 mM丙酮酸鈉和非必需氨基酸的DMEM(BioWhittaker)中。BSR-T7細胞是穩定地表達T7 RNA聚合酶(2)的幼年倉鼠腎細胞系。將BSR-T7細胞培養在含有10% FCS、100 IU/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、2 mM穀氨醯胺、1 mM丙酮酸鈉和0.5mg/ml G418(Life Technologies，Breda，The Netherlands)的DMEM中。
將適合於在含胚雞蛋中複製但可能不在哺乳動物細胞培養物中最優複製的流感病毒A/PR/8/34以低感染多樣性在培養於Episerf培養基(Gibco BRL)中的MDCK細胞中傳代7次，所述培養基含有10 IU/ml青黴素和10μg/ml鏈黴素。第七次傳代後，常規地獲得108
TCID50
/ml的病毒滴度。
293T細胞的轉染
基本上按(24)所描述的方法進行磷酸鈣介導的293T細胞暫態轉染。在轉染前一天將細胞塗布在凝膠化的100 mm直徑的培養皿中以獲得50%的匯合單層。轉染過夜後，用新鮮的含有2% FCS的培養基替換轉染培養基以用於病毒生產或用含有10% FCS的培養基替換以用於所有其他轉染。將細胞溫育30至72小時，之後收集上清液，如果合適對細胞進行熒光分析。在所有的實驗中平行地使用質粒pEGFP-N1(Clontech，BD Biosciences，Amsterdam，The Netherlands)進行轉染並在FACSCalibur(Becton Dickinson)流式細胞儀中測量熒光細胞的百分比，經確定轉染效率在95-100%的範圍之內。通過在300xg下離心10分鐘澄清含有病毒的上清液。立即或在4℃貯存短于一周後，或在-80℃貯存超過一周後確定上清液中的病毒滴度。
MDCK細胞的轉染
基本上如以前(1)所描述的進行MDCK細胞的暫態轉染。簡而言之，向10μl脂轉染胺2000中加入240μlOptimem I培養基(GibcoBRL)並在室溫下溫育5分鐘。將所需量的DNA用Optimem I調整至50μl體積再加入至該混合物中。將該混合物在室溫下溫育20分鐘。溫育後，加入200μl不含青黴素和鏈黴素的MDCK培養基(參見上面)並將該混合物加入至6孔板中的1x106
懸浮MDCK細胞中。在5小時溫育後，用PBS清洗細胞兩次並在2ml不含青黴素和鏈黴素的MDCK培養基中培養。在過夜溫育後，用含有2% FCS的MDCK培養基替換該培養基。
BSR-T7細胞的轉染
為進行BSR-T7細胞的暫態轉染，在轉染前將400.000細胞塗布在6孔培養皿中以獲得50-70%的匯合單層。將無血清DMEM(240μl)加入至10 μl脂轉染胺2000中並在室溫下溫育4分鐘。用無血清DMEM將DNA調整至50μl再加入到該混合物中，並在室溫下溫育20分鐘。在轉染前，用2 ml無血清DMEM替換培養基。溫育後，將轉染混合物逐滴加入至細胞中並在37℃下溫育5小時。轉染後，用PBS清洗細胞一次並加入2ml含有2% FCS的DMEM以用於病毒生產或含有10% FCS的DMEM以用於FACS分析。
質粒
使用編碼T7pol(pAR3126和pAR3132)的真核表達載體。儘管質粒pAR3126編碼野生型T7pol，但質粒pAR3132表達含有核定位元信號(NLS)的T7pol，所述核定位元信號有效地將T7pol靶向細胞核(5)。表達A型流感病毒聚合酶蛋白的真核表達質粒使用小鼠羥基甲基戊二醯輔酶A還原酶啟動子pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP(25)。
通過PCR擴增pPolI-CAT-RT(25)的HδVrib並克隆入pSP72的XbaI-BamHI位點。將用BamHI-EcoRV消化的tT7序列克隆在pSP72-HδVrib的BamHI-HpaI位點，產生pSP72-HδVrib-tT7(MS24)。在合適的背景中將編碼pT7的寡核苷酸連接在pSP72-HδVrib-tT7的NdeI-XbaI位點以引入BbsI位點，產生載體pSP72-pT7-HδVrib-tT7(MS25,第1圖)。通過使用pSP-Hu-GFP-Mu(4)作為模板，將綠色熒光蛋白(GFP)的開放閱讀框克隆在pSP72-pT7-HδVrib-tT7的BbsI位點，所述開放閱讀框的側翼連接有來自流感病毒A/PR/8/34的片段5的NCRs。將該GFP小基因組以有義和反義的方向克隆，並且在緊接著pT7的下游包含0/2/3個額外的G殘基(第1圖)。
為將流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7，de Wit等人(4)描述的雙向流感病毒A/PR/8/34構建體被用作PCR的模板(第4個3’核苷酸對應著國家流感序列資料庫中報道的流感病毒A/PR/8/34的序列)。將包含AarI限制性位點的引物用於克隆片段1、2、3、4、6、7、8，並對片段5使用平末端連接；將基因片段以反義方向克隆入BbsI位點並在pT7之後包含2個額外的G殘基。
通過克隆tT7下游的CMV啟動子(pCMV)產生雙向載體pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV(MS65,第1圖)，從而允許從相應的基因片段產生mRNA。使用含有AseI限制性位點的引物通過PCR擴增pCMV。用AseI部分消化pSP72-pT7-HδVrib-tT7並以合適的方向將pCMV連接在tT7的下游，從而從基因片段產生mRNA.
再次克隆流感病毒A/PR/8/34片段以獲得各雙向T7pol驅動的流感病毒A/PR/8/34構建體。
我們也產生了其中刪除了tT7的成套的雙向載體。通過用BamHI-BpeEI消化pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV、用klenow酶進行處理、和再連接以產生pSP72-pT7-HδVrib-pCMV(MS90,第1圖)來製備該雙向載體。再次克隆流感病毒A/PR/8/34的片段以獲得各雙向T7pol驅動的流感病毒A/PR/8/34構建體。
按照廠商說明書，使用Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing試劑盒(Applied Biosystems)和3100 Genetic Analyser(Applied Biosystems)對所有質粒進行測序。
用基於T7pol的系統產生重組病毒
如上所述，用5μg各包含PR/8/34的基因片段的雙向質粒、表達質粒HMG-PB2、HMG-PB1、HMG-PA、HMG-NP各5μg和15μg pAR3132轉染293 T細胞。或者，我們用5μg包含PR/8/34的基因片段的各雙向質粒和15μg pAR3132進行轉染。轉染72小時後收集上清液並用1ml感染匯合的MDCK細胞單層。
病毒的感染和滴定
在接種之前，用PBS清洗MDCK細胞2次，並用1ml 293T上清液接種6孔板中的MDCK細胞匯合單層；在感染期間加入40 μg胰蛋白酶(2.5%，Bio Whittaker)。將板在37℃貯存1小時並用PBS清洗兩次，之後加入2ml含有4% BSA、100 IU/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、2 mM穀氨醯胺、1.5 mg/ml碳酸氫鈉、10 mM Hepes、非必需氨基酸和20 μg/ml胰蛋白酶的EMEM(BioWhittaker)(感染培養基)。在感染後3天，收集培養物的上清液並檢測作為細胞感染指示劑的HA的活性。如前面所述(26)進行病毒滴定。簡而言之，在感染培養基中製備轉染細胞的十倍系列稀釋。在接種之前，用PBS清洗細胞兩次。將100μl稀釋的培養上清液用於接種96孔板中的MDCK細胞匯合單層。在37℃溫育1小時後再次用PBS清洗細胞，並向各孔中加入200μl新鮮感染培養基。感染後3天，就各孔中作為細胞感染指示劑的HA活性對培養物的上清液進行檢測。根據Spearman-Karber(26)的方法從10個重復實驗中計算感染性滴度。
結果
使用基於單向T7pol的反向遺傳學系統的GFP小基因組測定法
構建包含pT7、HδVrib和tT7的單向載體。以有義(S)和反義(AS)方向將GFP開放閱讀框克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7並且具有0、2或3個額外的G殘基(第1圖和附錄2和3)，所述開放閱讀框側翼連接有流感病毒A/PR/8/34的片段5的非編碼區(NCRs)。這些構建體分別稱為S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G和AS-3G。我們檢測這些選擇中產生最佳表現的選擇。
我們用GFP小基因組(S-0G、S-2G、S-3G、AS-0G、AS-2G、AS-3G)、T7pol表達質粒(pAR3132)和4種表達PB2，PB1，PA和NP蛋白的質粒(pHMG-PB2，pHMG-PB1，pHMG-PA，pHMG-NP)轉染293T細胞。作為對照，我們用省去pHMG-NP、導致GFP小基因複製喪失的質粒進行相同的轉染。轉染後30小時，在FACSCalibur中對細胞進行熒光分析。
第2圖描述了所述結果。從左圖可看出在以反義方向排列的、具有兩個額外的G殘基的GFP小基因的轉染中觀察到最高比例的GFP陽性細胞。
其他的GFP小基因組構建體也產生了稍小比例的GFP陽性細胞。當將GFP陽性細胞的平均熒光值進行比較(第2圖，右圖)時，具有兩個額外G殘基以反義方向排列的GFP小基因組再次顯示最佳的表現。在該實驗中，具有兩個額外G殘基以有義方向排列的GFP小基因組顯示最差的表現，而其他構建體表現適中。
儘管我們在不同的實驗中在表達GFP的細胞的比例上和不同GFP小基因組質粒之間的GFP表達水平上觀察到一些變化(資料未顯示)，但具有兩個額外G殘基以反義方向排列的GFP小基因組總體上表現最佳，因此選用該構建體進行隨後的實驗。
細胞核與細胞質T7pol表達的比較。
我們潛在地需要解決的一個問題是T7pol的表達。對於副黏病毒反向遺傳學，使用主要在細胞質中表達的T7pol，這是想要的，因為副黏病毒的複製也發生在細胞質中。流感病毒在細胞核中複製，因此在細胞質中表達T7pol可能不是最佳選擇。因此當使用細胞質版本的T7pol(質粒AR3126)或包含核定位元信號(NLS，質粒pAR3132)的T7pol時，我們希望比較GFP表達水平。
該實驗的結果顯示於第3圖。當使用野生型T7pol表達質粒時，陽性細胞中的平均GFP熒光強度是521。通過使用包含核定位元信號的T7pol可顯著增加GFP的表達水平(平均熒光1106)。當將具有和不具有核定位元信號的T7pol一起使用(1：1比例，保持轉染質粒的總量不變)時，觀察到中等的GFP表達水平(平均熒光強度為775)。在大量的獨立實驗中，使用多種GFP小基因組質粒，這些結果是可重復的；當使用細胞核版本的T7pol時觀察到GFP的表達增加2至10倍(資料未顯示)。因此，在隨後的實驗中，我們使用包含核定位元信號的T7pol。
暫態和穩定的T7pol表達的比較
對於幾種副黏
病毒反向遺傳學系統，不是通過質粒轉染而是通過使用允許T7pol穩定表達的細胞系提供T7pol。為進行該目的，可獲得幼年倉鼠腎細胞(BSR-T7)。我們檢測BSR-T7是否能用於流感病毒GFP小基因組的轉錄，所述GFP小基因隨後可被流感病毒聚合酶複合體複製，從而導致GFP表達(第4圖)。
從第4圖中可看到，293T細胞中高GFP熒光強烈地依賴於T7pol的表達。在BSR-T7細胞中，與用其中省去pHMG-NP質粒的材料的轉染相反，在用GFP小基因組與流感病毒聚合酶複合體共轉染時觀察到相對較高水準的GFP表達。當加入表達細胞核版本的T7pol後，發現GFP的表達水平甚至更高。BSR-T7細胞中相對高水準的GFP表達暗示著T7pol的穩定表達比通過轉染進行的暫態表達更有效。然而，其中由轉染提供細胞核T7pol的實驗表明對於流感病毒反向遺傳學，表達細胞核T7pol而非野生型T7pol的穩定細胞系將更有效。
用基於單向T7pol的反向遺傳學系統產生重組病毒
然後，將流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7載體中以產生重組流感病毒A/PR/8/34。
我們用編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段、pT7pol(pAR3132)、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP的8個構建體轉染293T細胞。轉染後，向培養基中加入胰蛋白酶以使產生的病毒能夠複製。轉染後72小時，收集上清液並用於接種MDCK細胞。接種後3天，對這些MDCK細胞的上清液進行HA檢測，其作為病毒複製的指示。HA檢測呈陽性。接著，確定293T和MDCK上清液的病毒滴度。293T上清液中的病毒滴度顯示為1.6x101
TCID50
/ml；MDCK上清液中的病毒滴度為2.0x107
TCID50
/ml。當轉染後不向293T細胞中加入胰蛋白酶時，在293T細胞和MDCK細胞中獲得稍微下降的病毒滴度(資料未顯示)。因此這代表了第一個只是質粒重組流感A病毒的拯救，所述拯救不使用PolI啟動子。
雙向T7系統
然後我們希望發展在pT7控制下的雙向反向遺傳學系統。通過將pCMV克隆入pSP72-pT7-HδVrib-tT7，導致載體pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV(第1圖)的產生。將側翼連接流感病毒A/PR/8/34的片段5的非編碼區(NCRs)的GFP開放閱讀框(具有2個額外G殘基)以反義方向克隆在pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV內。因為我們預期該質粒在無需通過流感聚合酶複合體複製小基因組的情況下產生GFP表達(相對於所述小基因組，pCMV是以有義方向排列)，我們也製備了相似的包含小基因組(0 G殘基)的構建體，所述小基因組相對pT7以有義方向排列，從而與pCMV形成反義方向排列)。將小基因組質粒和表達細胞核T7pol和pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PA和pHMG-NP的質粒轉染293T細胞。30小時後通過FACS分析細胞(第5圖)。
用不完整的流感病毒聚合酶複合體和有義GFP小基因(S-0G)進行轉染導致非常少的具有非常低的GFP表達(第5圖，右圖)的GFP陽性細胞(第5圖，左圖)。在完整的流感病毒聚合酶複合體存在的情況下，大約7%的細胞是具有平均熒光強度大約為1200的GFP陽性細胞。通過使用反義GFP小基因組質粒，在缺少完整流感病毒聚合酶複合體的情況下，相對較大比例的細胞(大約10%)表達GFP，但只以低水平表達(平均GFP熒光強度為182)。當用完整的流感病毒聚合酶複合體共轉染時，表達GFP的細胞的比例不增加，但是每個細胞的GFP表達水平顯著增加(平均GFP熒光強度為-
1205)。因此，從這個實驗我們可以得出結論：雙向表達載體是有功能的；我們觀察到作為來自pCMV的GFP mRNA產生的結果，在無需流感病毒聚合酶複合體的情況下GFP表達水平較低。很明顯，這可以通過單獨地使用AS-2G GFP小基因組質粒轉染293T細胞來證實，所述轉染導致相似的GFP表達水平(約19%細胞以128的平均熒光值表達)(資料未顯示)。此外，我們觀察到作為從pT7轉錄的小基因的複製的結果，在流感病毒聚合酶複合體存在的情況下GFP表達水平增加。因此，雙向pT7-pCMV表達質粒是有功能的。
用基於雙向T7pol的反向遺傳學系統產生重組病毒
然後，將流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入載體pSP72-pT7-HδVrib-tT7-pCMV中以產生重組流感病毒A/PR/8/34。
我們用編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段和pT7pol(pAR3132)的8個構建體轉染293T細胞。轉染後，向培養基中加入胰蛋白酶以允許所產生的病毒複製。轉染後72小時，收集上清液並用於接種MDCK細胞。接種後3天，對這些MDCK細胞的上清液進行HA檢測，其作為病毒複製的指示。所述HA檢測呈陰性，表明沒有重組病毒被回收。
根據使用雙向載體表達PB2、PB1、PA和NP基因的小基因組報道測定，我們獲得證據：來自這些質粒的蛋白表達非常低(資料未顯示)。我們假設tT7序列干擾從pCMV的轉錄，導致被編碼的基因的產量較低。因此我們產生新的雙向質粒，在該質粒中tT7序列被除去(pSP72-pT7-HδVrib-pCMV)。將流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入載體pSP72-pT7-HδVrib-pCMV以產生重組流感病毒A/PR/8/34。在最初的努力中，再次未產生重組病毒。然而，當對用於轉染的質粒量進行一些優化後，我們成功地產生了重組病毒。用於該實驗的質粒的量是：編碼PB2、PB1、PA和HA的各構建體各10μg和編碼NP、NA、MA和NS的各構建體各5μg。儘管不能檢測到293T細胞中的重組病毒滴度，但隨後MDCK細胞的接種產生具有1.3 x 105
TCID50/ml的初始滴度的病毒。
MDCK細胞中的T7pol系統
為給基於T7pol的反向遺傳學系統的通用特性提供進一步的證據，我們檢測MDCK細胞而非293T細胞中的GFP小基因組的複製。儘管使用BSR-T7細胞的實驗已提供了證據：T7pol反向遺傳學系統在非靈長類動物來源的細胞中發揮作用(第4圖)，但MDCK更廣泛地用於流感病毒研究和疫苗生產。
如可在第6圖中看到的，發現基於T7pol的反向遺傳學系統在MDCK細胞中具有功能。與BSR-T7細胞(第4圖)中的結果相結合，這些實驗表明T7pol反向遺傳系統確實代表著”通用”系統，可用於廣泛的細胞類型。根據該實驗，可以認為有可能從非靈長類動物細胞中生產重組流感病毒。
此處我們已第一次顯示，使用基於T7pol的系統可在293T細胞中產生重組流感病毒A/PR/8/34(MDCK-適應性NIBSC株系)。然而，並不假定將這些方法的應用限定於流感病毒A/PR/8/34；其可用於所有A、B和C型流感病毒以及其他片段化負鏈RNA病毒。也沒有假定將這些方法的應用限定於293T細胞、BSR-T7細胞和MDCK細胞；可通過例如廣泛的細胞系的轉染來提供T7pol，在所述細胞系中可產生重組病毒。
用於該基於T7pol的反向遺傳學系統技術學的質粒載體和其包含的元件也具有明顯的靈活性。此處，我們使用噬菌體T7的RNA聚合酶產生vRNA或cRNA樣RNA分子，但也可使用各種其他的RNA聚合酶例如噬菌體SP6 RNA聚合酶。在此處顯示的實驗中，T7 RNA聚合酶經修飾包含SV40大T抗原的核定位元信號，但可使用各種其他核靶向信號(例如，hnRNP K蛋白的核靶向信號)修飾RNA聚合酶。我們在此使用δ型肝炎病毒的核酶序列，但已描述了其他可選擇使用的核酶序列。最後，此處描述的系統不依賴于流感病毒聚合酶蛋白質表達載體的應用，所述表達載體基於小鼠羥基甲基戊二醯輔酶A還原酶啟動子(pHMG構建體)；可使用來自廣泛的流感病毒的聚合酶蛋白，並且可使用廣泛的表達載體表達所述聚合酶蛋白。
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實施例2
如上所述基於相關流行性病毒(例如A/Moscow/10/99)的HA和NA基因和高生產能力的病毒主鏈(例如來源於疫苗株系A/PR/8/34)生產重組病毒。在通過轉染產生重組病毒後，在合適的細胞基質(例如，雞蛋、MDCK細胞、Vero細胞)中擴增所述病毒以達到足夠高的量。當在含胚雞蛋中擴增時，通過在1000x g下離心10分鐘和通過0.45微米的篩檢程式過濾來清除尿囊液體。現通過在4℃下在150.000x g下離心1.5小時沈澱所述病毒並重新懸浮於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中。然後用2%的癸醯基-N-甲基葡糖胺(MEGA)處理病毒，將病毒加在一層25%的PBS中的蔗糖上並在4℃下在250.000x g下離心1.5小時。
然後將含有HA和NA蛋白的最上層對PBS進行透析並用12.5%的經考馬斯亮藍染色的SDS聚丙烯醯胺凝膠確定蛋白製劑的純度和量。用大約10微克HA/NA蛋白肌內免疫白鼬。如果想要，可使用連續多劑或使用佐劑(MF59、ISCOM)進行接種。使用血凝抑制測定法、神經氨酸酶抑制測定法、ELISA、病毒中和測定法等確定接種前和接種後收集的血清樣品中的抗HA和NA抗體的滴度。在接種後6周，使用1 x 10E5 50%組織培養半感染劑量(TCID-50)的流感病毒A/Moscow/10/99或異源病毒分離株攻擊接受接種的動物和對照動物。攻擊後，10天內每天從動物收集鼻或咽拭抹樣品，通過定量PCR分析或病毒滴定確定由接受感染的動物分泌的病毒量。因此，通過對抗體滴度和抗所述攻擊病毒感染的保護水平的增加進行定量來確定獲得的疫苗誘導的免疫性。
第1圖，用於基於T7pol的反向遺傳學系統的構建體。克隆策略的詳述參見說明書。
第2圖，用編碼GFP小基因組(0.6 μg)、T7pol(0.6 μg)和A型流感病毒聚合酶基因(各1μg)的構建體轉染的293T細胞的FACS分析。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。在X軸上，顯示以有義(S)和反義(AS)方向排列的被轉染的GFP小基因組構建體，並標明額外G核苷酸的數目。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第3圖，經轉染的293T細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組、4μgA型流感病毒聚合酶構建體、和0.6μg野生型T7pol(C)、含有核定位元信號(N)的T7 pol或以1：1比例(C/N)的兩種構建體來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。
第4圖，經轉染的293T或BSR-T7細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的GFP小基因組的構建體和4μg A型流感病毒聚合酶構建體來進行轉染。顯示了細胞的GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。用或不用表達T7pol的質粒轉染細胞，所述聚合酶含有核定位元信號(293T和293T N比較或BSR-T7和BSR-T7 N的比較)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第5圖，經轉染的293T細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組(AS-2G)或有義GFP小基因組(S-0G)的構建體和0.6μg表達具有核定位元信號的T7pol的質粒和4μg表達A型流感病毒聚合酶基因的質粒來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分中GFP表達的水平(平均熒光強度)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
第6圖，經轉染的293T和MDCK細胞的FACS分析，所述細胞用0.6μg編碼具有2個額外G殘基的反義GFP小基因組(AS-2G)的構建體、0.6μg表達具有核定位元信號的T7pol的質粒和4μg表達A型流感病毒聚合酶基因的質粒來進行轉染。左圖：轉染30小時後GFP陽性細胞的百分比。右圖：GFP陽性部分的GFP表達水平(平均熒光強度)。黑色條形表示用A型流感病毒聚合酶複合體的所有4個成分(PB2、PB1、PA和NP)進行的共轉染，白色條形表示用省去pHMG-NP構建體的構建體轉染的對照。
Claims (28)
- 一種用於生產一複製型流感病毒顆粒而不使用輔助病毒的方法，該方法包含培養一被以7或8個核酸轉染之細胞，其中該等核酸分別包含一流感基因片段和一噬菌體聚合酶啟動子，或該等核酸分別包含一流感基因片段和一噬菌體聚合酶啟動子的互補體，其中該等核酸係分別包含在雙向質粒中。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中在該方法中使用之核酸不包含噬菌體聚合酶終止子。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中在該方法中使用之核酸係在與噬菌體聚合酶啟動子相鄰的位置被提供至少一個額外的鳥嘌呤殘基。
- 如申請專利範圍第3項的方法，其中在該方法中使用之核酸在與噬菌體聚合酶啟動子相鄰的位置被提供有兩個額外的鳥嘌呤殘基。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該噬菌體聚合酶啟動子係T7聚合酶啟動子。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中在該方法中使用之至少一核酸包含一流感基因片段，該流感基因片段係衍生自一流感病毒，且該病毒係被世界衛生組織推薦用於疫苗目的。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中在該方法中使用之至少一核酸包含一A型流感基因片段。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中在該方法中使用 之細胞係額外提供有噬菌體聚合酶。
- 如申請專利範圍第8項的方法，其中該噬菌體聚合酶包含一核定位元信號。
- 如申請專利範圍第8項的方法，其中該噬菌體聚合酶為T7聚合酶。
- 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中在該方法中使用之細胞係一非靈長類動物細胞。
- 如申請專利範圍第11項的方法，其中在該方法中使用之細胞係MDCK細胞或CEF細胞。
- 一種細胞，該細胞係依據如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法被以7或8個核酸轉染。
- 一種組成物，其包含一衍生自如申請專利範圍第13項之細胞的細胞或材料。
- 一種如申請專利範圍第14項之組成物供生產一藥學組成物的用途，該藥物組成物係用於產生抵抗流感病毒感染一個體的免疫學保護作用。
- 一種如申請專利範圍第14項之組成物，供用於產生抵抗流感病毒感染一個體的免疫學保護作用。
- 一種核酸，其包含一流感基因片段及一T7噬菌體聚合酶啟動子，或一種核酸，其包含一流感基因片段及一T7噬菌體聚合酶啟動子的互補體，其中該核酸係已被提供至少一額外的鳥嘌呤殘基於鄰近該啟動子處，且其中該核酸係包含在雙向質粒中。
- 如申請專利範圍第17項之核酸，該核酸係已被提供二個 額外的鳥嘌呤殘基於鄰近該啟動子處。
- 如申請專利範圍第17或18項之核酸，其包含一基因片段，該基因片段係衍生自一流感病毒，該流感病毒係被WHO推薦用於疫苗目的。
- 如申請專利範圍第17或18項之核酸，其包含一A型流感基因片段。
- 一種細胞，其被提供有至少一如申請專利範圍第17至20項中任一項之核酸。
- 如申請專利範圍第21項之細胞，其額外地被提供有一T7噬菌體聚合酶。
- 如申請專利範圍第22項之細胞，其中該聚合酶包含一核定位元訊號。
- 如申請專利範圍第21至23項中任一項之細胞，其係一非靈長類動物細胞。
- 如申請專利範圍第24項之細胞，其係一MDCK細胞或一CEF細胞。
- 如申請專利範圍第21至23項中任一項之細胞，其係未被提供有一輔助病毒。
- 一種如申請專利範圍第13項之細胞供生產一藥學組成物的用途，該藥學組成物係用於產生抵抗流感病毒感染一個體的免疫學保護作用。
- 一種如申請專利範圍第21項之細胞供生產一藥學組成物的用途，該藥學組成物係用於產生抵抗流感病毒感染一個體的免疫學保護作用。
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